熊露王曉云梁志宏，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

羧肽酶A的脫毒功能及其應(yīng)用前景

熊露1王曉云1梁志宏1，2

（1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由曲霉菌和青霉菌產(chǎn)生的一種真菌毒素，谷物、豆類、葡萄酒和咖啡等制品常常受到其污染，對食品安全構(gòu)成了極大的威脅。隨著全球氣候的變化，OTA的污染情況日益嚴(yán)重，為保障人類及畜禽動物的安全，不少研究人員正致力于脫除或降解食品及其原料中的OTA。目前很多真菌和細(xì)菌被報(bào)道能降解OTA，然而它們產(chǎn)生的降解酶很少被定性和純化，降解產(chǎn)物也不明確，無法應(yīng)用于工業(yè)中。羧肽酶A（Carboxypeptidase A，CPA）對OTA的脫毒能力已被廣泛證明，同時(shí)它的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理都極為清晰，降解產(chǎn)物也對人體無害，是脫除OTA的理想產(chǎn)品。因此通過基因工程和蛋白質(zhì)工程大量表達(dá)獲得穩(wěn)定并效率高的羧肽酶A是降解OTA的新途徑。將從OTA的污染狀況及其生物脫毒機(jī)制、CPA的脫毒能力、CPA作為脫毒劑的發(fā)展前景等方面進(jìn)行綜述，旨在為真菌毒素降解酶制劑的開發(fā)和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

赭曲霉毒素A；生物脫毒；羧肽酶A

羧肽酶（Carboxypeptidase，CPs）是一種專一性地從肽鏈的C端逐個(gè)降解、釋放游離氨基酸的一類肽鏈外切酶［1］，發(fā)揮著許多重要的功能，參與食物的消化、神經(jīng)內(nèi)分泌肽的合成、蛋白的修飾及成熟等。廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域，可去除食品和飼料中的赭曲霉毒素，同時(shí)也可用于脫苦。羧肽酶在動物、植物、微生物中均存在，然而目前人們主要從動物器官組織中生產(chǎn)獲得商業(yè)化的羧肽酶，成本高、量少、操作困難，造成其售價(jià)比較昂貴，限制了羧肽酶功能的開發(fā)與應(yīng)用。目前市場上污染赭曲霉毒素A的農(nóng)產(chǎn)品包括糧食谷物、畜禽肉、奶制品等，不僅造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，還嚴(yán)重威脅著人類的健康，如何去除這些毒素已然成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，而酶降解技術(shù)是最適合工業(yè)化的，利用基因工程和蛋白質(zhì)工程獲得大量的重組酶并對酶進(jìn)行修飾以期獲得穩(wěn)定、效率高的羧肽酶是未來OTA脫除的另一發(fā)展方向。

1 赭曲霉毒素A的簡介

赭曲霉毒素（Ochratoxins，OTs）是繼黃曲霉毒素后又一個(gè)引起世界廣泛關(guān)注的霉菌毒素。它是由7種曲霉菌（Aspergillus.spp）和6種青霉菌（Penicillium.spp）產(chǎn)生的一組世界范圍內(nèi)重要的污染食品的真菌毒素。毒素有A、B、C和D四種，其中OTA危害性最大。OTA分子式為C20H18ClNO6，由異香豆素和L-苯丙氨酸通過酰胺鍵形成，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。OTA的相對分子質(zhì)量為403.8，是一種無色的晶體狀化合物。該毒素能溶于極性有機(jī)溶劑和稀的碳酸氫鹽水溶液中，微溶于水，呈弱酸性。在有機(jī)溶劑和堿水中，OTA對空氣和光不穩(wěn)定，尤其在潮濕環(huán)境中，短暫的光照就能使之分解，但在乙醇溶液中低溫條件下可保存一年。在紫外下能發(fā)出藍(lán)色熒光。OTA具有耐熱性和化學(xué)穩(wěn)定性［2］，谷物產(chǎn)品中的赭曲霉毒素 A 在高溫條件下保存 3 h，仍能保持35%的毒性［3］，焙烤只能使其毒性減少20%，蒸煮對其毒性無影響。

圖1 赭曲霉毒素A的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.1 赭曲霉毒素A對食品的污染

OTA具有腎臟毒性［4］、肝臟毒性［5］，還有致畸［6］、致突變［7］和致癌作用［8］，并有免疫抑制作用［9］，1993年被認(rèn)定為2B類致癌物［10］，嚴(yán)重危害食品及飼料的食用/飼用安全。全世界每年有25%的糧食受到已確認(rèn)的真菌毒素的污染［11］，糧食的真菌毒素污染問題已成為全球糧食問題的熱點(diǎn)。我國是糧食生產(chǎn)和消費(fèi)大國，有報(bào)道顯示，赭曲霉毒素 A 在全國糧食類食品中的檢出陽性率為 2.47%［12］。OTA污染最嚴(yán)重的是谷物及其制品，人類OTA 攝入量的50%也來源于谷物及相關(guān)產(chǎn)品，有報(bào)告顯示在飼料霉菌毒素中，黃曲霉毒素因管控嚴(yán)格會漸漸淡化而赭曲霉毒素由于污染范圍較廣有可能成為我國未來幾年霉菌毒素危害的“后起之秀”［13］。其次OTA還污染葡萄及其制品，人們從葡萄酒中攝取的OTA含量占總量的13%。因此OTA對食品質(zhì)量安全的影響不容小視。

1.2 赭曲霉毒素A的生物脫毒機(jī)制

OTA脫毒主要有兩種途徑，即吸附和降解，其方法可分為物理化學(xué)法和生物方法。物理化學(xué)方法包括水洗、高溫加熱處理、放射線輻射、物理吸附（常見的為蒙脫石，膨潤土）、化學(xué)試劑的處理及臭氧氧化等［14］。物理化學(xué)方法對復(fù)雜的體系脫毒率不高，且處理后原料的營養(yǎng)價(jià)值可能發(fā)生改變，試劑的殘留還可能造成二次污染，因此物理化學(xué)方法并不是脫除真菌毒素的有效手段，也不是脫毒的發(fā)展方向。生物防霉主要是通過防霉劑殺滅或抑制霉菌，主要應(yīng)用于飼料脫毒。防霉劑對霉菌的殺滅作用，是通過其孢子的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，消滅孢子或阻止其發(fā)芽以達(dá)到防止霉菌生長的目的。但防霉劑的效果并非一成不變，受微生物、濕度、溫度等因素影響，實(shí)際應(yīng)用中難以控制。糧食中防霉劑的去除也難以實(shí)現(xiàn)。因此，利用微生物或酶制劑降解的生物脫毒方法成為控制真菌毒素污染的理想方法。

OTA的生物脫毒途徑也是吸附和降解，前者主要是一些菌體的細(xì)胞壁如酵母細(xì)胞壁能吸附毒素，降低毒素在食品原料中的含量。降解是利用菌體產(chǎn)生的酶，將OTA水解成無毒的產(chǎn)物。OTA的生物降解與兩條途徑相關(guān)［15］：（1）斷裂連接L-β-苯丙氨酸和OTɑ之間的酰胺鍵，生成無毒產(chǎn)物 L-β-苯丙氨酸和OTɑ（圖2）；（2）水解打開OTA的內(nèi)酯環(huán)，生成最后的降解產(chǎn)物內(nèi)酯環(huán)打開的OTA（OP-OTA）（圖3）。

圖2 OTA水解成OTα和L-苯丙氨酸

圖3 OTA開環(huán)形成OP-OTA

2 羧肽酶A的簡介

根據(jù)催化機(jī)制的不同，羧肽酶可分為3類：絲氨酸羧肽酶（EC 3.4.16）、金屬羧肽酶（EC 3.4.17）、半胱氨酸羧肽酶（EC 3.4.18）［16］。前者在酸性條件下具有末端蛋白水解酶和酯酶、脫酰胺酶的活性，同時(shí)還可參與多肽和蛋白質(zhì)的加工、修飾和降解［17］。金屬羧肽酶存在于細(xì)胞外，主要幫助蛋白質(zhì)的消化，在中性或弱堿性條件下具有很高的活性，根據(jù)整體結(jié)構(gòu)域及氨基酸序列相似性的差異，金屬羧肽酶可分為2個(gè)亞家族：CPA/B、CPN/E亞家族。CPA是一種鋅依賴羧肽酶，在1973年被分離得到，該酶由307個(gè)氨基酸殘基組成，存在于哺乳動物的胰臟中，常見的是牛胰臟和豬胰臟羧肽酶，其在體內(nèi)首先以無活性的酶原表達(dá)，經(jīng)胰蛋白酶消化后成為成熟的酶。CPA主要作用于C末端是芳香族和較大空間的脂肪類氨基酸殘基，不能作用于末端是堿性氨基酸殘基和脯氨酸殘基的肽鍵，而羧肽酶B優(yōu)先作用于C末端的堿性氨基酸殘基，隨后又能作用于非堿性氨基酸殘基［18］。

2.1 羧肽酶A對OTA的降解能力

羧肽酶A的應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，不僅能測定蛋白質(zhì)的序列，還可作為發(fā)酵食品的發(fā)酵增強(qiáng)劑，促進(jìn)醬油、奶酪等產(chǎn)業(yè)的發(fā)展［19］，同時(shí)還可對受OTA污染的飼料、葡萄酒等進(jìn)行脫毒。羧肽酶A對OTA的脫毒能力已經(jīng)得到廣泛的證實(shí)，在多篇研究OTA降解的文獻(xiàn)中，被用作對照物［20］。Abrunhosa等［20］在篩選能降解OTA的黑曲霉的實(shí)驗(yàn)中，以CPA作為降解對照酶發(fā)現(xiàn)，羧肽酶能降解99.8%的OTA。其中來自牛胰臟的羧肽酶A是研究最早也是最透徹的蛋白酶，早在1969年P(guān)itiou［21］就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羧肽酶（CPA）能將OTA降解為OTα和L-苯丙氨酸。隨后Deberghes等［22］在產(chǎn)赭曲霉毒素的液體培養(yǎng)基中加入不同酶活單位的牛胰臟羧肽酶A發(fā)現(xiàn)，一定時(shí)間內(nèi) 5U的羧肽酶A就可以完全降解OTA。

2.2 羧肽酶A的活性結(jié)構(gòu)

CPA是一類水解芳香族和脂肪族C端氨基酸殘基的含鋅金屬蛋白酶，牛胰臟羧肽酶是目前研究較為徹底的蛋白酶。CPA含有307個(gè)氨基酸殘基，Gly 207、Ile243和Ile255是底物結(jié)合位點(diǎn)，其中Ile255決定該酶的底物特異性。在酶的催化中心，Zn2+與His69、Glu72和His196緊密結(jié)合，其他氨基酸殘基，如Arg127、Asn144、Arg145、Tyr248、Glu270等與催化功能有關(guān)［23］，其中最重要的活性部位是Zn2+和Glu270的γ-羧基。Plummer等［24］報(bào)道牛胰臟羧肽酶的活性中心肽段，其核心區(qū)域由12個(gè)氨基酸構(gòu)成，其一級結(jié)構(gòu)的氨基酸順序?yàn)椋篢hr-Ile-Tyr-Gln-Ala-Ser-Gly-Gly-Ser-Ile-Asp-Trp。

3 羧肽酶A脫毒發(fā)展前景

羧肽酶應(yīng)用廣泛，然而商業(yè)化的產(chǎn)品主要來源于牛、豬等胰腺組織，由于受提取率、數(shù)量、價(jià)格、穩(wěn)定性等因素的限制，還不能實(shí)際應(yīng)用于飼料、葡萄酒、咖啡等污染嚴(yán)重的產(chǎn)品上，因此如何在體外獲得大量且催化效率高的羧肽酶已經(jīng)成為當(dāng)下急需解決的問題。目前主要有兩種途徑，一是利用基因重組技術(shù)體外表達(dá)羧肽酶；二是對酶進(jìn)行修飾。

3.1 羧肽酶A的重組表達(dá)

應(yīng)用生物技術(shù)手段將酶的基因轉(zhuǎn)化到合適的載體上進(jìn)行表達(dá)是生產(chǎn)酶制劑的主要方法，目前許多羧肽酶已經(jīng)在體外被成功表達(dá)。師磊等［25］成功在畢赤酵母中表達(dá)了牛胰臟羧肽酶酶原A，蛋白含量為150 mg/L，當(dāng)OTA質(zhì)量濃度為4 μg/mL時(shí)，降解率可達(dá)72.3%，這是運(yùn)用基因克隆技術(shù)首次獲得具有降解活性的重組CPA；隨后王曉云等［26］用響應(yīng)面法對表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，CPA蛋白平均表達(dá)量可達(dá)325 mg/L。李樹剛等［27］利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（E.coli BL21）實(shí)現(xiàn)了對羧肽酶G2的表達(dá)，通過純化工藝后，蛋白純度高于95%，其酶活力達(dá)400 U/mg。陳丹等［28］利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對米曲霉羧肽酶O進(jìn)行了表達(dá)，該酶以糖蛋白的形式存在，產(chǎn)量約為20.4 nKat/mL，且具有良好的熱穩(wěn)定性，能提高大豆分離蛋白和酪蛋白的水解度，明顯降低其苦味。Yu等［29］通過畢赤酵母GS115表達(dá)羧肽酶Y，搖瓶培養(yǎng)168 h后，羧肽酶Y的產(chǎn)量為605 mg/L，重組酶經(jīng)過純化，在最適條件下（30℃，pH6.0）活性可達(dá)305 U/mg，這是第一次成功在體外表達(dá)獲得具有高活性的羧肽酶Y。盡管，包括羧肽酶A在內(nèi)的許多羧肽酶和其他霉菌毒素降解酶已經(jīng)陸續(xù)在體外被成功表達(dá)，但產(chǎn)物表達(dá)量、穩(wěn)定性、活性、純度等并不理想，不能應(yīng)用于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，后期需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化酶的表達(dá)條件。

3.2 羧肽酶A的修飾

當(dāng)CPA實(shí)際應(yīng)用于糧食、飼料、葡萄酒等的脫毒時(shí)，會受到溫度、pH、原料中各種成分等因素的影響，酶的結(jié)構(gòu)、活性發(fā)生變化，使得OTA的降解效果并不理想，因此蛋白酶的修飾對穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)、提高酶的活性有很重要的研究意義。酶的修飾主要包括分子化學(xué)修飾和基因工程修飾。

1981年，Mock等［30］將羧肽酶A中的Zn2+替換成Ca2+，改變了其底物特異性，提高了含硫環(huán)狀多肽的水解能力。李康等［31］用琥珀酸酐、丙酸酐、乙酸酐對脂肪酶進(jìn)行修飾，相對于原酶其活性分別提高24%、33.9%、31.4%，同時(shí)酸酐修飾后的脂肪酶熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑的耐受力均得到提高?；瘜W(xué)修飾簡單方便，但是既提高酶活又提高熱穩(wěn)定性比較困難，修飾劑的選擇，修飾條件的優(yōu)化是酶修飾的關(guān)鍵因素。

定點(diǎn)突變技術(shù)是氨基酸置換修飾和核苷酸置換修飾常用的方法。Chen等［32］利用錯(cuò)意多態(tài)性改變?nèi)唆入拿窫的基因，從而達(dá)到了改變酶活的目的；Rasekh等［33］對來自于芽孢桿菌屬的漆酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，不僅熱穩(wěn)定性得到提高，而且將188位的谷氨酸突變成非極性氨基酸，如丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸和帶正電的氨基酸如賴氨酸、精氨酸時(shí)，漆酶在甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性都會提高，且替代為非極性氨基酸時(shí)C50值（當(dāng)酶活為原來的50%時(shí)，有機(jī)溶劑的濃度）顯著性的提高、熱滅活率也大大降低；王小燕［34］等設(shè)計(jì)突變位點(diǎn)，在畢赤酵母重組表達(dá)的β-葡萄糖苷酶（PGUS-P）中引入具有芳香增強(qiáng)序列（Enhanced aromatic sequence，EAS）序列特征的新N-糖基化位點(diǎn)，獲得的突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259對底物甘草酸的催化效率提高了23.9%和12.65%，兩者在65℃處理90 min后，剩余的酶活＞90%。

牛胰臟CPA的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列都已經(jīng)完全清楚，但對于該酶的修飾卻并沒有很多的研究，要得到適合工業(yè)應(yīng)用的酶，選擇合適的修飾方法很重要。利用基因突變技術(shù)獲得理想新性狀的突變酶，是最常見的方法，對于CPA來說，可以先從自然存在的等位基因變異入手，設(shè)計(jì)引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變，有目的地改變CPA的某一氨基酸殘基，得到具有新性狀的酶，增強(qiáng)酶的底物親和性、催化特性及熱穩(wěn)定性。很多蛋白酶的結(jié)構(gòu)都存在loop區(qū)，研究證明刪除loop區(qū)能提高酶的穩(wěn)定性，Damnjanovic等［35］設(shè)計(jì)刪除了來自鏈霉菌磷脂酶D的由10個(gè)氨基酸構(gòu)成的loop區(qū)，得到兩個(gè)突變酶△37-45DYR、△38-46DYR，兩個(gè)突變體的耐熱性均得到提高，但70℃分別處理10 min、40 min，△38-46DYR突變體剩余酶活是△37-45DYR的3.1和4.1倍，因此選擇合適的loop刪除位點(diǎn)很重要。CPA同樣存在loop區(qū)，刪除該區(qū)域也是一種提高酶活的有效方法。

4 展望

OTA主要污染糧谷類，涉及到小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、水稻和黍類等。此外，豆類、咖啡、葡萄、葡萄干、水果、果汁、酒及調(diào)味品中也存在OTA污染，動物攝食被OTA污染的飼料后，會導(dǎo)致體內(nèi)OTA蓄積，因此在動物性食品中，尤其是豬的肝臟、腎臟、肌肉、肉質(zhì)品及奶和奶制品，也常常被OTA污染。OTA污染的農(nóng)產(chǎn)品范圍廣，超過國家標(biāo)準(zhǔn)限量的產(chǎn)品只能棄用，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失不可估量，但其中相當(dāng)一部分可以通過生物化學(xué)等方法將OTA降解為無毒產(chǎn)物后再投入市場，其中酶降解就是最安全最有效的脫毒方法。盡管目前市場上脫除霉菌毒素主要應(yīng)用吸附劑，但有些毒素并不能被其吸附，且吸附效果受溫度、pH的影響會產(chǎn)生解吸的現(xiàn)象。隨著全球環(huán)境的變化，霉菌毒素的污染日益嚴(yán)重，隱蔽毒素逐漸被關(guān)注，吸附劑很難滿足未來的需求，因此酶解技術(shù)已經(jīng)成為繼吸附劑和微生物發(fā)酵法脫除霉菌毒素后新的研究熱點(diǎn)和發(fā)展趨勢。酶制劑特異性強(qiáng)，不影響產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，不僅可以避免同吸附劑一樣造成毒素的蓄積從而污染環(huán)境，也可避免微生物發(fā)酵產(chǎn)生二次代謝污染物。CPA作為唯一一種研究非常透徹并能降解OTA的酶，對于糧食谷類及葡萄酒等行業(yè)的發(fā)展有著十分重要的意義。實(shí)際生產(chǎn)中，可以制備食品原料或飼料的解毒添加劑；或者作為葡萄酒的生物瀝濾材料，去除其中毒素。

被OTA污染的產(chǎn)品組分復(fù)雜，CPA在脫毒應(yīng)用過程中存在酶活降低甚至完全喪失的可能，所以選擇體外表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)蛋白酶，再對重組酶進(jìn)行修飾，是其商品化不可或缺的步驟。到目前為止我國只批準(zhǔn)了一種解毒酶產(chǎn)品-黃曲霉毒素解毒酶，因此，降解酶制劑的生產(chǎn)是科研人員面臨的巨大挑戰(zhàn)。CPA工業(yè)化的應(yīng)用將為食品原料和飼料中真菌毒素的生物脫毒的可持續(xù)發(fā)展提供一個(gè)新思路，以期最大限度地保證食品原料及飼料制品的安全。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Functions of Detoxification and Application Prospect of Carboxypeptidase A

XIONG Lu1WANG Xiao-yun1LIANG Zhi-hong1，2
（1. College of Food Science &Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083；2. Key Laboratory of Safety Assessment of Genetically Modified Organisms（Food Safety），Ministry of Agriculture，Beijing 100083）

Ochratoxin A（OTA）is one of mycotoxins produced by Aspergillus and Penicillium，by which many products，such as cereals，beans，wines and coffees，are contaminated，and these contaminated foods possesses serious threats to food safety. In recent years，with the change of global climate，the food contaminated by OTA has become increasingly serious. In order to guarantee safety of humans and animals，many researchers are committing to detoxifying and degrading OTA in food and food raw materials. Currently，it is reported that OTA can be degraded by many fungi and bacteria，but few enzymes produced by them are characterized and purified，and degraded substances of OTA are unknown，thus they can’t be used in industry. Carboxypeptidase A（CPA）is an ideal product to degrade OTA because the detoxification ability of CPA to OTA is widely proved，its feature，structure and mechanism are very clear，and degraded product has no toxicity to human body；therefore，it is a novel approach to degrade OTA through genetic engineering and protein engineering to obtain a lot of stably and efficiently expressed CPA. This paper summarizes the contamination status of OTA in food，and mechanisms of bio-detoxification，the detoxification ability of CPA，and the application prospect of CPA as detoxifying agent，aiming at providing theoretical base for the development and application of mycotoxin agents degrading enzymes.

ochratoxin A；bio-detoxification；carboxypeptidase A

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0163

2017-03-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31671947）

熊露，女，碩士研究生，研究方向：食品微生物與安全；E-mail：1183812933@qq.com

梁志宏，女，博士，副教授，研究方向：微生物與食品安全；E-mail：lzh105@cau.edu.cn