秦海彬 熊濤 張博 牛坤

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014）

α-酮戊二酸半醛脫氫酶的定點(diǎn)突變及酶學(xué)性質(zhì)變化

秦海彬 熊濤 張博 牛坤

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310014）

3-HP是一種性質(zhì)優(yōu)良的化學(xué)中間體，以甘油為底物生產(chǎn)3-HP的研究備受青睞，而限制3-HP產(chǎn)量的主要原因是AldH活力過低。對(duì)源于Azospirillam brasilense 的α-酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSADH）基因同源建模和結(jié)構(gòu)分析，采用定點(diǎn)突變方法得到高活力KGSADH，將突變酶表達(dá)純化，探討酶學(xué)性質(zhì)的變化。結(jié)果表明，TU-KGSADH（E120D/P219A）酶活力達(dá)6.03 U/mg，比原始酶比酶活提高了322 %，最適溫度由35℃降低為30℃，且熱穩(wěn)定性降低，最適pH為8.0，在pH 6.0-8.0條件下酶活力有所提高。Zn2+對(duì)KGSADH的酶活有較強(qiáng)的抑制作用，而Co2+、Fe3+、Fe2+對(duì)KGSADH的酶活有較大的激活作用。在酶的動(dòng)力學(xué)方面，TU-KGSADH對(duì)乙醛的Km由7.58降為6.28 mmol/L，Vmax由10.6提高為12.3 U/mg。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)改變的因素分析發(fā)現(xiàn)，120位突變與最適pH下降和pH穩(wěn)定性向酸性偏移有關(guān)，219位突變可能是最適溫度和熱穩(wěn)定性降低的原因，為醛脫氫酶進(jìn)一步定向改造提供參考。

α-酮戊二酸半醛脫氫酶；定點(diǎn)突變；表達(dá)純化；酶學(xué)性質(zhì)

3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）又名β-羥基丙酸，是一種三碳非手性有機(jī)酸，也是一種性質(zhì)優(yōu)良的化學(xué)中間體，可以用來合成涂料、膠黏劑、水處理化學(xué)品、個(gè)人護(hù)理用品等一批重要的化工產(chǎn)品，具有較高的市場價(jià)值和良好的工業(yè)應(yīng)用前景［1］。目前市售的3-HP均由化學(xué)合成法制得，如3-羥基丙腈水解法、β-丙內(nèi)酯水解法、丙烯酸水合法等［2］，但化學(xué)法使用不可再生資源、副產(chǎn)物多、分離困難、污染嚴(yán)重［3］。相對(duì)而言，生物法合成3-HP是以甘油或葡萄糖為底物進(jìn)行微生物發(fā)酵，可以避免化學(xué)法所帶來的一系列問題，而針對(duì)國際市場上甘油過剩的現(xiàn)狀，各國學(xué)者積極開展以甘油為底物生產(chǎn)3-HP的研究工作。

在以甘油為底物，兩步法生產(chǎn)3-羥基丙酸的過程中，涉及到兩個(gè)關(guān)鍵酶——甘油脫水酶（DhaB）和醛脫氫酶（AldH）。首先，甘油脫水酶在輔酶VB12的參與下將甘油還原為3-羥基丙醛（3-HPA）；然后，醛脫氫酶依賴NAD（P）+將3-羥基丙醛轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸。近年來，Rathnasingh等［4-8］學(xué)者報(bào)道了多種來源的DhaB和AldH，使得3-HP的產(chǎn)量有了大幅度提高，然而仍然存在著AldH活力偏低、需外源添加VB12、輔酶循環(huán)再生、3-HPA的累積毒性、產(chǎn)物3-HP積累毒性等問題［9］。而低活力的AldH作為限速步驟，限制了3-HP的產(chǎn)量，因此，尋找新的醛脫氫酶或?qū)ζ溥M(jìn)行定向改造以提高其活性具有重要的研究意義。

本研究對(duì)來源于Azospirillam brasilense 的新型醛脫氫酶α-酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSADH）進(jìn)行同源建模和結(jié)構(gòu)分析，確定了7個(gè)定點(diǎn)突變位點(diǎn)，通過雙點(diǎn)突變獲得了相對(duì)酶活較高的突變酶，并著重考察了突變酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 α-酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSADH）來源為Azospirillam brasilense 基因（GenBank：AB24 1137），并成功構(gòu)建E. coli BL21/pET-28b-kgsadh（菌種編號(hào)ZJB 12043）；E. coli BL21（DE3）為實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 LB培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨10，酵母粉5， NaCl 10。固體培養(yǎng)基補(bǔ)加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 主要工具酶和試劑 DpnⅠ限制性內(nèi)切酶、Primer start 聚合酶購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）購于北京經(jīng)科宏達(dá)生物有限公 司；Unstained Protein Ladder、2×Unstained Prot Loading Buffer購于上海博彩生物科技有限公司；Profinity IMAC Ni-Charged Resin 購于美國伯樂（BIORAD）公司；酵母粉、蛋白胨購自O(shè)XOID公司。

1.2 方法

1.2.1 定點(diǎn)突變 通過一步反向PCR法擴(kuò)增擬突變KGSADH氨基酸位點(diǎn)的質(zhì)粒，然后用DpnⅠ將質(zhì)粒進(jìn)行去甲基化，熱擊法轉(zhuǎn)化入E. coli BL21（DE3）中，篩選出重組菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行序列測定。

1.2.2 菌株的誘導(dǎo)表達(dá) 將過夜活化的突變菌株轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng)基中，接種量體積分?jǐn)?shù)為2%，37℃培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.6-0.8，添加濃度為0.1 mmol /L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，28℃誘導(dǎo)10 h，離心收集菌體備用。

1.2.3 KGSADH酶活的測定 吸取50 μL 0.1 mol /L Tris-HCl（pH8.0）、50 μL體積分?jǐn)?shù)1%的乙醛、50 μL 0.1 mol /L KCl、50 μL酶液（根據(jù)需要進(jìn)行一定的稀釋）于96孔板，37℃保溫1 min，加入50 μL 5 mmol /L NAD+，340 nm測1 min內(nèi)NAD+的動(dòng)態(tài)變化值，定義每分鐘產(chǎn)生1 μmol NADH所用的酶蛋白量為1 U。

1.2.4 KGSADH純酶的制備 將1.2.2離心收集到的菌體用pH8.0 Tris-HCl緩沖液重懸后進(jìn)行超聲破碎，破碎液離心10 min，取上清獲得粗酶液。粗酶液通過Ni-NTA柱分離純化獲得蛋白，將上述蛋白移于透析袋（截留分子量14 kD），一起放置于0.1 mol /L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液中，0℃透析過夜，獲得的酶液進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.5 KGSADH酶學(xué)性質(zhì)的考察 最適反應(yīng)溫度：分別在不同反應(yīng)溫度下測定KGSADH 酶活。（1）熱穩(wěn)定性：將酶液分別保溫在不同溫度下，每隔一段時(shí)間取樣測殘余酶活。最適反應(yīng)pH：分別在不同pH 條件下測定KGSADH 酶活。（2）pH 穩(wěn)定性：將酶液分別保溫在不同pH 條件下，每隔一段時(shí)間取樣測殘余酶活。（3）金屬離子的影響：反應(yīng)體系中分別添加2 mmol /L 的金屬離子，測定KGSADH 酶活。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)：改變酶反應(yīng)體系中乙醛的濃度，測定KGSADH酶活；選取10-200 mmol/L乙醛濃度繪制動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，求出Km和Vmax。

2 結(jié)果

2.1 KGSADH突變酶的獲得

根據(jù)KGSADH氨基酸序列從PDB數(shù)據(jù)庫中查找到相似性為40%的3JZ4（PDB ID），利用軟件modoller 9.12同源建模，三維結(jié)構(gòu)見圖1。參考軟件Swiss-PDBV4.10對(duì)三維結(jié)構(gòu)的分析以及PoPMuSIC 2.0對(duì)各個(gè)氨基酸突變后的能量變化，選取能量降低明顯的7個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變（表1），其中120E、163K、219P為保守區(qū)域位點(diǎn)，177K為輔酶結(jié)合附近位點(diǎn)，225K、252E、278K為活性中心附近位點(diǎn)。

圖1 KGSADH同源建模三維結(jié)構(gòu)圖

表1 KGSADH突變位點(diǎn)ΔΔG的變化情況

以pET-28b-kgsadh為模板，通過一步反向PCR擴(kuò)增完成7個(gè)位點(diǎn)突變。測取的比酶活，結(jié)果（圖2）顯示，252E、278K位點(diǎn)突變使KGSADH完全失活，E120D、K177R、P219A位點(diǎn)有較大提高，經(jīng)過疊加突變，突變酶TU-KGSADH（E120D/P219A）酶活力達(dá)6.03 U/mg，比原始酶比酶活提高了322 %，且通過測序分析，確定突變位點(diǎn)與設(shè)計(jì)的目標(biāo)位點(diǎn)一致。后續(xù)以菌株E.coli BL21/pET-28b-kgsadh（E120D/P219A）（菌種編號(hào)ZJB15026）為目標(biāo)菌株進(jìn)行考察。

圖2 KGSADH突變酶的比酶活

2.2 KGSADH的誘導(dǎo)表達(dá)

原始菌株ZJB12043和突變菌株ZJB15026經(jīng)過發(fā)酵處理之后獲得的粗酶液，經(jīng)SDS-PAGE電泳（圖3泳道7和泳道8），與對(duì)照組E. coli BL21（泳道1）、E. coli BL21/pET-28b（泳道2）和未誘導(dǎo)（泳道3，4）的電泳圖比較，泳道7和8在48-65.2 kD之間有大量的可溶異源蛋白表達(dá)，這和KGSADH 的預(yù)測分子量50.8 kD基本一致。經(jīng)檢測酶活，表明KGSADH正確表達(dá)。

2.3 KGSADH的分離純化

KGSADH帶有6個(gè)His組成的“標(biāo)簽”，故利用Ni-NTA 瓊脂糖作為親和介質(zhì)，組氨酸與Ni2+之間形成配位相互作用，選擇性地將KGSADH 吸附在Ni柱上，再用不同濃度咪唑進(jìn)行洗脫，最終分離純化出KGSADH。ZJB12043、ZJB15026純化酶的SDSPAGE電泳結(jié)果見圖3，泳道5和泳道6僅帶有少許雜蛋白條帶，其純度已滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 ZJB12043和ZJB15026的表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析

2.4 KGSADH突變前后的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性 由表2可以看出，原始KGSADH最適溫度為35℃，而突變KGSADH最適溫度降為30℃。為進(jìn)一步研究酶的熱穩(wěn)定性變化，實(shí)驗(yàn)以0 h酶活為基準(zhǔn)，分別考察了40℃、50℃酶的穩(wěn)定性。從圖4可以看出，40℃分別保溫3 h和7 h，原始KGSDAH剩余酶活分別是96.3%和89.6%，突變KGSDAH剩余酶活分別是86.1%和58.8%。50℃保溫7 h，原始KGSDAH剩余酶活是84.8%，而突變KGSDAH剩余酶活是47.4%。表明突變后KGSADH的熱穩(wěn)定性降低。

表2 KGSADH突變前后的酶學(xué)性質(zhì)比較

圖4 原始和突變KGSADH的熱穩(wěn)定性

2.4.2 最適pH及pH穩(wěn)定性 如圖5所示，原始KGSADH最適pH在8.5，突變KGSADH最適pH在8.0。與原始KGSADH相比，突變KGSADH在pH 6.0-8.0下的酶活顯著增加。將原始酶與突變酶置于不同pH緩沖液中，20 h后取樣測定KGSADH活性。從圖6可以看出，原始酶的pH穩(wěn)定性較好，當(dāng)pH≥6.0時(shí)，其相對(duì)酶活仍保持在85%以上，而突變KGSADH在pH 6.0-8.0條件下，酶活保留在85%以上，在pH 8.0-9.0條件下，KGSADH的穩(wěn)定性顯著下降。

2.4.3 金屬離子及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 由于KGSADH具有金屬離子中心，因此部分金屬離子和表面活性劑會(huì)對(duì)KGSADH的酶活與催化能力產(chǎn)生一定的影響。實(shí)驗(yàn)考察了金屬離子Cu2+、Cu+、Co2+、Ni2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Fe2+和表面活性劑EDTA對(duì)KGSADH酶活的影響。從表2中可以看出，突變前后金屬離子對(duì)KGSADH酶活的影響變化不大。Zn2+對(duì)KGSADH的酶活有較強(qiáng)的抑制作用，而Co2+、Fe3+、Fe2+對(duì)KGSADH的酶活有較大的激活作用。在酶的動(dòng)力學(xué)方面，KGSADH對(duì)乙醛的Km為7.58 mmol/L，Vmax為10.6 U/mg。突變KGSADH對(duì)乙醛的Km為6.28 mmol/L，Vmax為12.3 U/mg。突變后KGSADH的Km值降低且Vmax有所升高，說明突變后酶對(duì)底物的親和力增加。

3 討論

Díaz Sánchez等［10］初步推測了醛脫氫酶的兩步法催化機(jī)制：?；饔煤兔擋Ｗ饔茫⒅赋銎淇赡艿幕钚灾行氖?86位Cys。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)活性中心附近位點(diǎn)252E、278K突變，發(fā)現(xiàn)KGSADH完全失活，這與Díaz Sánchez推測的活性中心相符。

圖5 pH對(duì)原始和突變KGSADH酶活力的影響

圖6 原始和突變KGSADH的pH穩(wěn)定性

通過酶學(xué)性質(zhì)的分析與比較，TU-KGSADH的最適pH由8.5降為8.0，酶活在pH 6.0-8.0條件下有所提高，這與劉清利［11］、周百靈［12］、蔣宇［13］發(fā)現(xiàn)不同乙醛脫氫酶最適pH均在7.0-8.0相符。利用AutoDock 軟件以3-HPA為配體對(duì)KGSADH突變前后進(jìn)行分子對(duì)接（圖7），發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)E120D、P219A與活性中心286 Cys沒有形成氫鍵的能力，但是E120D突變使肽鏈走向改變，使159Asn與3-HPA距離小于0.30 nm形成氫鍵，進(jìn)而增強(qiáng)活性中心附近催化殘基的氫鍵作用，使酶催化能力升高。這可能就是突變KGSADH酶活力升高的原因。在偏酸的環(huán)境下活性中心附近催化殘基的氫鍵作用減弱，使酶催化能力降低，而突變KGSADH活性中心附近的氫鍵作用強(qiáng)于原酶，在酸性條件下的酶活性相對(duì)更高，這就解釋了突變酶的最適pH下降和pH穩(wěn)定性向酸性偏移的現(xiàn)象。

TU-KGSADH的最適溫度由35℃降低為30℃，熱穩(wěn)定性降低，而酶的熱穩(wěn)定性與鹽橋的形成、二硫鍵的引入、脯氨酸的含量及芳香族氨基酸的相互作用等因素有關(guān)［14］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，耐熱性的蛋白中脯氨酸的含量比耐中溫蛋白高40%-50%，而嗜冷蛋白中脯氨酸的含量明顯低于耐中溫蛋白［15］，尤其脯氨酸殘基位于α-helix的第一位和β-turn的第2位上時(shí)，脯氨酸殘基的剛性結(jié)構(gòu)對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有較大的貢獻(xiàn)［16］。將KGSADH α-helix結(jié)構(gòu)中219位脯氨酸突變?yōu)楸彼?，破壞了脯氨酸殘基的剛性結(jié)構(gòu)，這可能是突變酶最適溫度和熱穩(wěn)定性降低的原因。

圖7 3-HPA與原始（A）和突變KGSADH（B）活性中心分子對(duì)接

4 結(jié)論

本研究對(duì)來源于Azospirillam brasilense α-酮戊二酸半醛脫氫酶（KGSADH）基因同源建模和結(jié)構(gòu)分析，采用定點(diǎn)突變方法得到高活力突變酶TUKGSADH（E120D/P219A），并對(duì)該酶誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化，隨后探討了KGSADH突變前后酶學(xué)性質(zhì)的變化。結(jié)果表明TU-KGSADH的最適溫度由35℃降低為30℃，且熱穩(wěn)定性降低，最適pH為8.0，在pH 6.0-8.0條件下酶活有所提高。Co2+、Fe3+、Fe2+對(duì)酶活具有促進(jìn)作用，而Zn2+對(duì)酶活具有較強(qiáng)的抑制作用。突變KGSADH酶對(duì)乙醛的Km由7.58降為6.28 mmol/L，Vmax由10.6提高為12.3 U/mg。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)改變的可能因素分析發(fā)現(xiàn)，120位突變與最適pH下降和pH穩(wěn)定性向酸性偏移有關(guān)，219位突變可能是最適溫度和熱穩(wěn)定性降低的原因，突變降低了酶的熱穩(wěn)定性，但增強(qiáng)酶對(duì)產(chǎn)物3-HP的耐受力。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Site-directed Mutation of α-ketoglutorate Semialdehye Dehydrogenase and Its Enzymatic Properties

QIN Hai-bin XIONG Tao ZHANG Bo NIU Kun
（Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014）

3-HP is an excellent chemical intermediate，and the study on the production of 3-HP with glycerol as substrate is favored，while the main reason for limiting 3-HP production is the low activity of AldH. A gene of α-ketoglutorate semialdehye dehydrogenase（KGSADH）from Azospirillam brasilense was constructed by homology modeling and structure analysis. The KGSADH with high activity was obtained by sitedirected mutation. The KGSADH was expressed and purified for the investigation of enzymatic properties. The results revealed that the activity of TU-KGSADH（E120D / P219A）reached 6.03 U/mg，which was 322% higher than that of the original KGSADH. The optimal temperature of TU-KGSADH decreased from 35℃ to 30℃，the thermostability reduced，and the optimal pH was 8.0 and enzymatic activity was improved slightly under pH 6.0-8.0. Zn2+had a strong inhibitory effect on the activity of KGSADH，while Co2+，F(xiàn)e3+and Fe2+had a great effect on the activity of KGSADH. In the kinetic aspect of the TU-KGSADH，the Km with acetaldehyde as a substrate reduced from 7.58 to 6.28 mmol/L，and Vmax increased from 10.6 to 12.3 U/mg. Finally，the factors affecting the changes of enzymatic properties were analyzed，The 120 site mutation was associated with the decrease of the optimal pH and pH stability to acidic migration，and the 219 site mutation may be the reason for the decrease of the optimum temperature and thermal stability，providing a fine reference for further research in directional modification of aldehye dehydrogenase.

α-ketoglutorate semialdehye dehydrogenase；site-directed mutation；expression and purification；enzymatic properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0188

2017-03-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21306173），浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ 15C010001）

秦海彬，男，碩士，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化；E-mail：qinhaibin@zjut.edu.cn

牛坤，女，博士，副教授，研究方向：生物催化與轉(zhuǎn)化；E-mail：niukun@zjut.edu.cn