韓曉麗，聶園軍，黃春國，郭晉平

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所， 山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801)

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河岸林土壤好氧反硝化菌的分離及活性初探

韓曉麗1，聶園軍2，黃春國3，郭晉平4*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所， 山西 太原 030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 城鄉(xiāng)建設(shè)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]好氧反硝化菌可在有氧條件下，將硝酸鹽還原，釋放N2O，減少富氮對土壤的危害。本研究旨在探明河岸林土壤中是否存有好氧反硝化菌。[方法]以文峪河上游毗鄰農(nóng)田河岸林土壤為材料，采用土壤稀釋、涂布劃線、滴加格利斯及二苯胺試劑顯色等方法分離篩選菌株，采用16S rDNA基因序列同源性分析鑒定；在滅菌土壤中接種篩選所得菌株培養(yǎng)，并測定硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、亞硝態(tài)氮含量變化來分析其活性。[結(jié)果]獲得3株反硝化菌(編號：df3、df7、df14)，鑒定命名為Psueadomonassp.DF3，Alicaligenessp.DF7,Klebsiellasp.DF14?；钚苑治鲲@示：接種3株菌土壤硝態(tài)氮明顯減少，且接種df3和df7土壤中具亞硝態(tài)氮。[結(jié)論]樣品土壤中存在好氧反硝化活性菌株，具有重要科學(xué)研究意義。

河岸林； 好氧反硝化細菌； 篩選； 反硝化活性

1 材料與方法

1.1 材料來源

1.1.1 試驗所用土樣

樣地選擇在文峪河上游毗鄰農(nóng)田河岸林，坐標為111°27′54″E，37°51′8″N，采集時間2014年7月8日。共設(shè)置3個20 m×20 m樣方，每樣方內(nèi)隨機采集5個點，取新鮮土樣充分混勻后放入冰盒帶回實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

(1)牛肉膏蛋白胨硝酸鹽培養(yǎng)基：5 g牛肉膏，10 g蛋白胨，1 g KNO3，5 g NaCl，20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH7.2～7.4。

(2)硝酸鹽葡萄糖反硝化液體培養(yǎng)基：5 g葡萄糖，2 g KNO3，1 g KH2PO4，1 g K2HPO4，0.20 g MgSO4·7H2O，1 000 mL去離子水，pH 7.2～7.5。

(3)格利斯試劑：Ⅰ液：磺胺酸0.5 g溶于150 mL 30%醋酸溶液，棕色瓶儲存?zhèn)溆茫虎蛞海?.5 gα-萘胺溶于50 mL蒸餾水，煮沸后緩慢與150 mL 30%醋酸溶液混勻，棕色瓶儲存?zhèn)溆谩?/p>

(4)二苯胺試劑：1 g二苯胺溶于20 mL蒸餾水，并緩慢加入濃硫酸100 mL混勻，棕色瓶儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 好氧反硝化細菌的分離

采用土壤稀釋法將供試土樣制成不同稀釋度的土壤溶液[16]。并分別取少量涂布于牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。

1.2.2 好氧反硝化細菌的篩選

(1)擴大培養(yǎng)：挑取菌落接種于硝酸鹽葡萄糖反硝化液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d。

(2)篩選：向上述菌液中滴加格利斯試劑和二苯胺試劑篩選反硝化菌株，原理和方法見文獻[16]。

(3)純化：對篩選出的菌株編號，采用劃線法轉(zhuǎn)至牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接3次及以上，經(jīng)鏡檢獲得純菌株后轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨硝酸鹽固體培養(yǎng)基試管斜面上，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 好氧反硝化細菌的分子生物學(xué)鑒定

基因組DNA提?。簱u床30 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，采用離心柱DNA試劑盒提取DNA[17]。引物：16S rDNA的PCR反應(yīng)引物，序列正向為：5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向為：5′-GGTTACTTGTTACGACTT-3′。

PCR擴增：采用50 μL反應(yīng)體系: 10×buffer 1/10 voL，MgCl22.5 mM，dNTP 0.2 mM，Taq酶 2.5 U，模板1 μL。

PCR反應(yīng)程序：循環(huán)數(shù)30，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 40 s，55 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸2 min；72 ℃整理10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物的測序由派森諾生物公司完成。

將測得的序列在NCBI網(wǎng)站的GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫中進行Blastn比對，下載相似度高的相關(guān)序列，然后用mega軟件進行1 000次bootstrap統(tǒng)計學(xué)檢驗，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 好氧反硝化細菌的活性測定

(1)純化菌種的擴大培養(yǎng)

挑取純化菌株接種于100 mL硝酸鹽葡萄糖反硝化液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min-1恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h后備用。

(2)好氧反硝化菌反硝化活性試驗

采集樣土風(fēng)干磨細后過20目篩備用。供試土壤pH 6.35，有機質(zhì)5.83 g·kg-1，全氮3.3 g·kg-1，硝態(tài)氮為5.65 mg·kg-1，銨態(tài)氮9.63 mg·kg-1。稱取10 g經(jīng)30 min、121 ℃高壓滅菌的樣土分裝于100 mL紗布封口的塑料瓶中，并分別加入純化菌液0.5 mL和1.5 g·L-1的KNO3溶液1 mL，確保樣土起始硝態(tài)氮含量約為200 mg·kg-1，靜置于暗處培養(yǎng)8 d；設(shè)置空白對照是加入0.5 mL滅活菌液。培養(yǎng)過程中，前4 d每隔12 h取樣一次，5～8 d每隔24 h定時取樣，每次取樣量為0.5 g，用濃度為2 mol·L-1的KCl溶液5 mL浸提，采用easychem全自動離子分析儀測定浸提液中硝態(tài)氮、亞硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的濃度。試驗中所有取樣均設(shè)置3個重復(fù)。測定數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果分析

2.1 反硝化細菌的分離篩選

經(jīng)分離篩選試驗獲得3株具反硝化功能的菌株，編號為：df3、df7、df14，并在10×100倍光學(xué)顯微鏡下觀察鏡檢。其中df3菌體細胞呈球狀，直徑1～1.5 μm；df7菌體細胞呈桿狀，長1.5～2 μm，寬0.5～0.7 μm；df14桿狀，長1.7～3 μm，寬0.8～1 μm。同時，經(jīng)平板培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)，df3菌落3～5 mm左右，圓形，隆起，淡黃色，邊緣整齊，革蘭氏陰性；df7菌落2.5～3 mm左右呈圓形，淡黃色，邊緣整齊，革蘭氏陰性；df14菌落1 mm左右，呈圓形有隆起，乳白色，邊緣整齊，革蘭氏陰性。

2.2 反硝化細菌的分子生物學(xué)鑒定

通過16S rDNA基因序列同源性分析鑒定結(jié)果可見(圖1～圖3)：菌株df3聚在Psueadomonas分支上，與genebank中KT695813，KR088657及HQ224651序列相似度達99%，菌株df7聚在Alicaligenes分支上，與genebank中FJ415749序列相似度達98%，菌株df14聚在Klebsiella分支上，與genebank中NR119277，AJ871858及JN102560相似度達99%。

圖1 菌株df3及相似菌株16S rDNA的系統(tǒng)樹Fig.1 Phylogenetic tree of df3 bacterial isolate and their GeneBank allies’ 16S rDNA sequences

圖2 菌株df7及相似菌株16S rDNA的系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree of df7 bacterial isolate and their GeneBank allies’ 16S rDNA sequences

圖3 菌株df14及相似菌株16S rDNA的系統(tǒng)樹Fig.3 Phylogenetic tree of df14 bacterial isolate and their GeneBank allies’ 16S rDNA sequences

結(jié)合菌株群落及顯微特征，鑒定并命名菌株df3為Psueadomonassp.DF3;菌株df7為Alicaligenessp.DF7;菌株df14為Klebsiellasp.DF14。

2.3 好氧反硝化細菌反硝化活性測定

經(jīng)過反硝化活性試驗可知：與對照相比，接種3株反硝化細菌的土壤中硝態(tài)氮含量發(fā)生明顯減少(圖4)，其中接種df3和df14土壤中硝態(tài)氮含量在第3 d時降至最低值，分別為126.8 mg·kg-1和158.4 mg·kg-1，減少率達36.6%和20.8%；接種df7土壤中硝態(tài)氮含量在第4 d時降至最低值115.6 mg·kg-1，減少率為42.2%。之后隨著培養(yǎng)時間的延長，土壤中硝態(tài)氮含量無明顯變化，均保持在最低值附近。表明試驗分離篩選得到的3株好氧反硝化菌Psueadomonassp.DF3，Alicaligenessp.DF7，Klebsiellasp.DF14均具有明顯的反硝化作用，可以將土壤中含量充足的硝態(tài)氮明顯降低。與接種df3和df14菌株相比，接種df7菌株的土壤中硝態(tài)氮含量降低幅度最大，表明在相同處理條件下，df7菌株的反硝化活性較強。

圖4 接種3株菌后土壤硝態(tài)氮的變化Fig.4 Dynamics of nitrate-N in the soil inoculated with 3 strains

由圖5可見，接種3種菌株的土壤中銨態(tài)氮含量與對照中銨態(tài)氮含量變化趨勢一致，無明顯升高或積累，均在初始值附近上下浮動。表明土壤在接種3株反硝化菌的培養(yǎng)中，其反硝化作用對土壤氮素轉(zhuǎn)化的過程中并未伴有銨態(tài)氮的產(chǎn)生。

圖5 接種三株菌后土壤銨態(tài)氮的變化Fig.5 Dynamics of ammonia-N in the soil inoculated with 3 strains

由圖6可見，空白對照和接種df14土壤中表現(xiàn)為亞硝態(tài)氮沒有積累；而接種df3的土壤中第3 d時亞硝態(tài)氮積累量達到最高35.6 mg·kg-1；接種df7的土壤中第3.5 d亞硝態(tài)氮的積累量達到最高42.9 mg·kg-1，隨后均逐漸下降，到第8 d亞硝態(tài)氮降低到最低值。結(jié)合圖5所示的土壤銨態(tài)氮沒有產(chǎn)生和積累，表明菌株df3和df7的反硝化過程表現(xiàn)為由硝酸鹽先產(chǎn)生亞硝酸鹽，而后以氣態(tài)氮形式釋放，菌株df14的反硝化過程是由硝酸鹽直接產(chǎn)生氣態(tài)氮。

3 結(jié)論與討論

(1)本試驗選擇文峪河上游毗鄰農(nóng)田河岸林為樣地，最終篩選出3株好氧反硝化菌株，分別編號為：df3、df7和df14，驗證了文峪河上游毗鄰農(nóng)田河岸林土壤中存在好氧反硝化細菌。在有氧條件下，好氧反硝化菌將土壤中富余的硝酸鹽轉(zhuǎn)化，降低由毗鄰農(nóng)田人工施用硝態(tài)氮肥對河岸林土壤及水體的危害，也為當(dāng)?shù)亻_展土壤脫氮研究提供了菌種資源保證。

圖6 接種三株菌后土壤亞硝態(tài)氮的變化Fig.6 Dynamics of nitrite-N in the soil inoculated with 3 strains

(2)經(jīng)對篩選所得3株反硝化菌株的分子生物學(xué)鑒定可知，3種菌株分別屬于為Psueadomonas，Alicaligenes和Klebsiella3個屬。表明文峪河上游毗鄰農(nóng)田河岸林土壤中存在的反硝化功能菌具有多樣性，為進一步開展菌株反硝化功能基因研究奠定了基礎(chǔ)。

(3)通過土壤反硝化活性試驗表明：3株菌都具有明顯的反硝化活性。在相同處理條件下，菌株df7反硝化活性最強。本試驗所得菌株有望在下一步土壤脫氮試驗過程中得到應(yīng)用。

[1]Fowler D, Steadman C E, Stevenson D, et al. Effects of global change during the 21st century on the nitrogen cycle[J]. Atmospheric Chemistry and Physics, 2015, 15(24):1747-1868.

[2]Van D G, Bouwman A F, Knoop J M, et al. Global pollution of surface waters from point and nonpoint sources of nitrogen[J]. Scientific World Journal, 2001, 1(Suppl 2):632-641.

[3]Conley D J, Likens G E. Ecology-Controlling eutrophication: nitrogen and phosphorus [J]. Science, 2009, 323(5917):1014-1015.

[4]郭二輝,孫然好,陳利頂．河岸植被緩沖帶主要生態(tài)服務(wù)功能研究的現(xiàn)狀與展望[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2011, 30(8):1830-1837.

[5]Alexander R B, Johnes P J, Boyer E W, et al. A comparison of models for estimating the riverine export of nitrogen from large watersheds [J]. Biogeochemistry, 2002, 57-58(1):295-339.

[6]Seitzinger S, Harrison J A, B?hlke J K, et al. Denitrification across landscapes and waterscapes: a synthesis[J]. Ecological Applications, 2007, 16(6):2064-2090.

[7]王慶成,于紅麗,姚琴,等．河岸帶對陸地水體氮素輸入的截留轉(zhuǎn)化作用[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2007,18(11):2611-2617．

[8]Verhoeven J T, Arheimer B, Yin C, et al. Regional and global concerns over wetlands and water quality[J]. Trends in Ecology and Evolution, 2006, 21(2):96-103.

[9]Kbenjamin W, Christines F, Caroll C, et al. Nitrate removal, denitrification and nitrous oxide production in the riparian zone of an ephemeral stream [J]. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(4):671-680.

[10]Codispoti L A, Richards F A. An Analysis of the Horizontal Regime of Denitrification in the Eastern Tropical North Pacific [J]. Limnology and Oceanography, 1976, 21(3):379-388.

[11]夏超, 祝貴兵,鄒雨璇,等．厭氧氨氧化細菌和反硝化厭氧甲烷氧化細菌在岸邊帶土壤中的分布規(guī)律[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2015, 35(12):3965-3975.

[12]Jorgensen K S, Tiedje J M. Survival of denitrifies in nitrate-free, anaerobic environments [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(10):3297-3305.

[13]周立祥,黃峰源, 王世梅．好氧反硝化菌的分離及其在土壤氮素轉(zhuǎn)化過程中的作用[J]. 土壤學(xué)報, 2006, 43(3):430-435.

[14]Ding A, Jiamo F U, Sheng G. Experimental evidence for aerobic bio-denitrification [J]. Science Bulletin, 2000, 45(1):86-89.

[15]Patureau D, Zumstein E, Delgenes J P, et al. Aerobic Denitrifiers Isolated from Diverse Natural and Managed Ecosystems [J]. Microbial Ecology, 2000, 39(2):145-152.

[16]王有樂,雷興龍,陳連軍,等．土壤中好氧反硝化菌的分離及脫氮特性研究[J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2011, 5(8):1902-1906.

[17]汪安云,黃瓊．一株降低煙草中特有亞硝胺細菌的分離鑒定及特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2006, 26(11):1914-1920.

(編輯：梁文俊)

Study on isolation and denitrification activity of aerobic denitrifiers from a riparian forest

Han Xiaoli1, Nie Yuanjun2, Huang Chunguo3, Guo Jinping4*

(1.CollegeofForestry,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 2.InstituteofAgriculturalResources,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030031，China; 3.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China; 4.SchoolofUrbanandRuralConstruction，Taigu030801,China)

[Objective]Aerobic denitrifiers could decrease nitrate and release N2O, and reduce the harm of rich nitrogen soil under aerobic conditions. The study was conducted to verify the existence of aerobic denitrifiers in riparian forest soil.[Methods]In this study, the soil of riparian forest adjacent to farmland from the upper reaches of Wenyu River was taken as material, using soil dilution, plate streak, adding griess and diphenylamine colorimetric reactionmethod for strain screening, 16S rDNA analysis for identification and determination. The denitrificative activity was analyzed by determination the nitrate, ammonium, and nitrite content in sterilized soil inoculated with the strains.[Result]3 strains of denitrifiers were isolated and screened, which was coded df3, df7and df14, were respectively identified and named asPsueadomonassp.DF3，Alicaligenessp.DF7, andKlebsiellasp.DF14. Denitrification activity analysis showed that the soil nitrate was obviously decreased, and the soil nitrite was produced inoculation of df3 and df7.[Conclusion]There were aerobic denitrifiers in the soil samples. It has important scientific significance of the study.

Riparian forest, Aerobic denitrifying bacteria, Screening, Denitrification activity

2017-04-10

2017-06-01

韓曉麗(1983-)，女(漢)，山西霍州人，講師，博士研究生，研究方向：森林土壤微生物功能及多樣性

*通信作者：郭晉平，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:13935406926;E-mail:jinpguo@sohu.com

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(20132-14)

Q939.96

A

1671-8151(2017)08-0570-05