黃招玲 胡美華 林君瑾 廖惠珍 陳月香 劉道泉 邱艷紅 林伯全 徐磊＊

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院福州350119；2.長樂市農(nóng)業(yè)局農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站福建長樂350200；3.福州市動物疫病預(yù)防控制中心福州350002）

豬脾轉(zhuǎn)移因子與雞毒支原體F弱毒疫苗株聯(lián)合接種對SPF雞淋巴細(xì)胞比率影響的研究

黃招玲1胡美華1林君瑾1廖惠珍2陳月香3劉道泉3邱艷紅3林伯全1徐磊1＊

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院福州350119；2.長樂市農(nóng)業(yè)局農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測站福建長樂350200；3.福州市動物疫病預(yù)防控制中心福州350002）

為了解豬脾轉(zhuǎn)移因子（TF）與雞毒支原體（MG）F弱毒疫苗株聯(lián)合接種對SPF雞淋巴細(xì)胞比率的影響，以活菌數(shù)達(dá)109ccu/mL的MG F株0.033 mL/羽與TF 0.02 mL/羽分側(cè)點(diǎn)眼SPF雞，設(shè)為A組；B組以MG F株0.033 mL/羽與生理鹽水0.02 mL/羽分側(cè)點(diǎn)眼；C組以生理鹽水0.033 mL/羽與TF 0.02 mL/羽分側(cè)點(diǎn)眼；D組以生理鹽水0.033 mL/羽和0.02 mL/羽對應(yīng)分側(cè)點(diǎn)眼，作為對照組。點(diǎn)眼后第7 d采血測定淋巴細(xì)胞比率。結(jié)果顯示，A組（63.9%）、B組（53.8%）和C組（54.6%）的淋巴細(xì)胞比率均值分別比D組（41.5%）提高了22.4%、12.3%和13.1%。結(jié)果表明，TF與MG F株單獨(dú)使用均能提高SPF雞的淋巴細(xì)胞比率，且TF與MG F株聯(lián)合使用后淋巴細(xì)胞比率提高值高于單獨(dú)使用。

雞毒支原體F弱毒疫苗豬脾轉(zhuǎn)移因子聯(lián)合接種淋巴細(xì)胞比率

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）感染，也稱雞敗血霉形體感染或慢性呼吸道病（Chronic Respiratory Disease，CRD）[1-2]。MG感染流行于包括我國在內(nèi)的全世界雞場中[3-4]，造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[5]。MG F株是一個良好的弱毒制苗菌株，并已進(jìn)行了許多有益的研究[6-12]。轉(zhuǎn)移因子（Transfer Factor, TF）是由T淋巴細(xì)胞釋放的能夠轉(zhuǎn)移致敏信息的物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)活性[13-17]。

本試驗(yàn)依照本課題組已獲授權(quán)得發(fā)明專利制備TF[18-19]，通過TF與MG F株聯(lián)合使用對SPF雞淋巴細(xì)胞比率影響的研究，揭示TF發(fā)揮免疫增強(qiáng)作用的一些機(jī)理，為MG防控和TF應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 疫苗株MG弱毒F株由本實(shí)驗(yàn)室保存，活菌數(shù)達(dá)109ccu/mL。

1.2 儀器與試劑全自動血細(xì)胞分析儀為貝克曼庫爾特COULTER○RLH 750；動物飼養(yǎng)隔離器購自蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動物設(shè)備有限公司；SPF種蛋由福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司提供；肝素鈉購自國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)動物SPF種蛋于動物飼養(yǎng)隔離器內(nèi)孵化，雛雞4日齡時(shí)，頸靜脈采血，選取MG抗體陰性的雛雞40羽。3 d后，隨機(jī)分為4組，分別為：A、B、C和D組，隔離飼養(yǎng)，每組各10羽。

1.4 TF制備按照本課題組已獲授權(quán)的發(fā)明專利制備TF[18-19]：以健康豬脾臟為原料，經(jīng)勻漿、細(xì)胞破碎、滅活、微濾、超濾后精制而成。經(jīng)檢驗(yàn)，所制備TF的pH7.0，多肽含量為3.5 mg/mL，核糖含量為72.0 μg/mL，脫E受體法效力檢驗(yàn)活力為15%，細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于10 EU/mL，在252 nm波長處有最大吸收，OD260nm/OD280nm的比值為2.23；蛋白質(zhì)定性檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)、熱原檢驗(yàn)、異常毒性檢查、過敏反應(yīng)檢查、安全檢驗(yàn)均合格。1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)SPF雞7日齡時(shí)，將MG F株新鮮培養(yǎng)物以0.033 mL/羽的劑量點(diǎn)眼接種SPF雞20羽，為A、B組；其中，A組以0.02 mL/羽的劑量另一側(cè)點(diǎn)眼接種TF，而B組以0.02 mL/羽的劑量另一側(cè)點(diǎn)眼接種生理鹽水。C組則以0.033 mL/羽的生理鹽水和0.02 mL/羽的TF分側(cè)點(diǎn)眼接種。同時(shí)設(shè)立對照組（D組），將生理鹽水以0.033 mL/羽和0.02 mL/羽對應(yīng)分側(cè)點(diǎn)眼接種。點(diǎn)眼后第7 d，各組SPF雞經(jīng)頸靜脈采集外周抗凝血，采用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞比率測定。所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析和最小顯著性差法（LSD）分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

點(diǎn)眼后第7 d，A組的淋巴細(xì)胞比率最高，均值為63.9%；其次為C組與B組，兩者淋巴細(xì)胞比率均值較接近；最低為D組，其淋巴細(xì)胞比率均值為41.5%。A、B和C組得淋巴細(xì)胞比率均值分別比D組提高了22.4%、12.3%和13.1%。結(jié)果表明，TF與MG F株單獨(dú)使用均能提高SPF雞的淋巴細(xì)胞比率，且TF與MG F株聯(lián)合使用后淋巴細(xì)胞比率提高值高于單獨(dú)使用。見表1。

3 討論

白細(xì)胞可分為5種類型，即中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。淋巴細(xì)胞比率即是淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞總計(jì)數(shù)的百分比。江清艷等[20]用轉(zhuǎn)移因子提取液注射粵黃雞，能夠提高雞外周血液中T細(xì)胞百分率，而凌紅麗等[21]報(bào)道轉(zhuǎn)移因子對雞血液淋巴細(xì)胞比率的影響無規(guī)律可循。但在本試驗(yàn)中，點(diǎn)眼后第7 d，僅點(diǎn)眼TF的C組的淋巴細(xì)胞比率就比D組提高了13.1%，說明單獨(dú)使用TF即可提高淋巴細(xì)胞比率。該結(jié)果與江清艷等的研究結(jié)果一致，而與凌紅麗等的研究結(jié)果不同，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

表1 淋巴細(xì)胞比率測定結(jié)果

研究顯示[10-11]，MG F株可提高雞淋巴細(xì)胞亞型比值，如Th/T、Tc/T和Bu-1a+B/PBL等。在本試驗(yàn)中，僅點(diǎn)眼MG F株的B組的淋巴細(xì)胞比率比D組提高12.3%。表明單獨(dú)使用MG F株可提高淋巴細(xì)胞比率。

本試驗(yàn)依照本課題組已獲授權(quán)的發(fā)明專利制備TF[18-19]，通過TF與MG F株聯(lián)合使用對SPF雞淋巴細(xì)胞比率影響的研究，TF與MG F株單獨(dú)使用均能提高SPF雞的淋巴細(xì)胞比率，且TF與MG F株聯(lián)合使用后淋巴細(xì)胞比率提高值高于單獨(dú)使用。

[1]Nicolet J.Animal mycoplasmoses:a general introduction[J]. Rev Sic Tech,1996,15(4):1233-1240.

[2]Bradbury J M,Abdul-Wahab O M,Yavari C A,et al.Mycoplasma imitans sp.nov.is related to Mycoplasma gallisepticum and found in birds[J].Int J Syst Bacteriol,1993,43(4): 721-728.

[3]徐磊,林伯全,林平,等.雞毒支原體病的預(yù)防技術(shù)[J].福建畜牧獸醫(yī),2013,35(3):36-38.

[4]冀錫霖,寧宜寶.雞感染雞毒霉形體和滑液霉形體情況的調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技,1986(2):21-23.

[5]王承宇,宣華.雞毒支原體病研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2000,22(增刊):208-211.

[6]寧宜寶.雞敗血霉形體弱毒F株對雞的致病性和免疫效力測定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999(3):264-266.

[7]寧宜寶.雞敗血霉形體F-36株的穩(wěn)定性測定[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999(5):462-463.

[8]丁亮.雞毒支原體F弱毒疫苗對肉雞生長及免疫性能影響的研究[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[9]林伯全,徐磊,楊慧,等.雞毒支原體F弱毒疫苗株感染SPF雞對IFN-、IL-2、IL-4和IL-10產(chǎn)生的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2014,34(11):1778-1780.

[10]林伯全,廖惠珍,杜海江,等.免疫雞毒支原體F弱毒株對SPF雞Bu-1a+B、TCRγδ+CD3+T細(xì)胞及血清IgM、IgG、IgA的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2015,35(4):549-552.

[11]林伯全,徐磊,楊慧,等.雞毒支原體F弱毒疫苗株細(xì)胞免疫特性研究[J].中國動物傳染病學(xué)報(bào),2014,22(3):78-81.

[12]徐磊,林伯全,胡濤,等.臨床雞毒支原體感染規(guī)律的血清學(xué)研究[J].福建畜牧獸醫(yī),2014,36(2):18-19.

[13]Lawrence H S,Borkowsky W.Transfer factor-current status and future prospects[J].Biotherapy,1996,9(1/3):1-5.

[14]Holeva O H,Paster I P,Liubchenko T A,et al.The immune reactivity transfer factor as a modulator of lymphocyte functional activity in rats[J].Fiziolohichny Zhurnal,2000,46 (4):58-65.

[15]Bravo-blas A,Téllez R,Uribe S,et al.Transfer factor acting as IFN-γ and IL-2 mRNA expression inductor in chicken vaccinated against avian influenza[J].Arch Med Vet, 2010,42(1):67-71.

[16]Ramaekers J C.Enhancement of immune response by transfer factor:WO 2012044960 A1[P].2015-04-05.

[17]Wang R N,Wang Y B,Geng J W,et al.Enhancing immune responses to inactivated porcine parvovirus oil emulsion vaccine by co-inoculating porcine transfer factor in mice[J].Vaccine,2012,30(35):5246-5252.

[18]徐磊,劉友霖.豬疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法及用途:201310506686.7[P].2015-05-13.

[19]徐磊.禽疫苗特異性豬脾臟轉(zhuǎn)移因子的制備方法及用途: 201310507478.9[P].2015-07-08.

[20]江青艷,戴遠(yuǎn)威,傅偉龍,等.脾臟轉(zhuǎn)移因子對粵黃雞免疫機(jī)能的影響[J].畜牧獸醫(yī)雜志,1996(3):6-8.

[21]凌紅麗,陸承平,孫海新,等.雞脾轉(zhuǎn)移因子對肉雞免疫應(yīng)答及防病效果的研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2006,36(7):556-560.

Study on the effect of combined inoculation of pig spleen transfer factor and Mycoplasma gallisepticum F vaccine on SPF chicken lymphocyte ratio

Huang Zhaoling1Hu Meihua1Lin Junjin1Liao Huizhen2Chen Yuexiang3Liu Daoquan3Qiu Yanhong3Lin Boquan1Xu Lei1*
(1.Fujian Agricultural Vocational Technical College,Fuzhou 350119;2.Station of Agricutural Products Quality and Safety Inspection,Changle Bureau of Agriculture,Changle Fujian 350200; 3.Fuzhou Animal Disease Prevention and Control Center,Fuzhou 350002)

To evaluate the effects of combined inoculation of pig spleen transfer factor(TF)and Mycoplasma gallisepticum(MG)F vaccine on SPF chicken lymphocyte ratio.This research adopted the living bacteria number reached 109ccu/mL MG F.And the establishment of A group(0.033 mL/plume MG F strain and 0.02 mL/plume TF,eye dropping SPF chicken dividedly),B group(0.033 mL/ plume MG F strain and 0.02 mL/plume saline),C group(0.033 mL/plume saline and 0.02 mL/plume TF)and D group(0.033 mL/ plume saline and 0.02 mL/plume saline),respectively.On 7 day post inoculation(dpi)blood lymphocyte ratio was detected.The results showed that compared with group D(41.5%),the mean lymphocyte ratio of group A(63.9%),group B(53.8%)and group C(54.6%) were increased by 22.4%,12.3%and 13.1%respectively.The results showed that both TF and MG F strains could increase the lymphocyte ratio of SPF chickens individually,and the ratio of lymphocyte rate of combined inoculation TF and MG F strains was higher than that of single use.

MG F attenuated vaccine Porcine spleen transfer factor Combined inoculation Lymphocyte ratio

A

1003-4331（2017）04-0008-03

福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃（閩教科[2015]54號）、福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目計(jì)劃（JA15760）、福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016S0002）、福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017N0009）、福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-N-94）、福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015-G-71）、福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016-G-64）、福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研項(xiàng)目（2016JS005）、福清市科技計(jì)劃項(xiàng)目（融科[2011]18號）資助。

黃招玲（1969-），女，福建福州人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事動物傳染病研究。E-mail:357365598@qq.com。

＊通信作者：徐磊，E-mail:xulei0328@163.com。