喻歡歡　鐘猛　丁銳　宋婷　吉光見稚代　胥秀英　鄭一敏

[摘要]以玄參為研究對(duì)象，探索同步測定玄參中環(huán)烯醚萜類和苯丙素類共7種有效成分的高效液相色譜條件，并在此基礎(chǔ)上建立“一測多評(píng)”測定方法，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。以梓醇為內(nèi)標(biāo)物，建立梓醇與桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸的相對(duì)校正因子與相對(duì)保留值，計(jì)算其他6種成分的含量：同時(shí)采用外標(biāo)法測定這7種成分的含量，比較兩者的測定結(jié)果。結(jié)果表明采用“一測多評(píng)”法和外標(biāo)法測定的含量之間無顯著差異，實(shí)驗(yàn)所得的校正因子可信。該方法作為一種新的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，用于玄參多種有效成分的同步質(zhì)量評(píng)價(jià)是準(zhǔn)確、可行的。

[關(guān)鍵詞]玄參； 環(huán)烯醚萜類； “一測多評(píng)”

[Abstract]To establish a new quantitative method for simultaneous determination of multicomponents in Scrophularia root by using high performance liquid chromatography （HPLC） and validate its feasibilities.Meanwhile，using catalpol as one chemical reference substance to establish the relative correct factors and relative retention values of aucubin，harpagide，acteoside，angoroside C，harpagoside and cinnamic acid.Then using the quantitative analysis of multicomponents by singlemarker （QAMS）model，the six analytes can be quantitatively determined in Scrophularia root.The method was evaluated by comparison of the quantitative results to external standard method.No significant differences were observed between the quantitative results of the two methods.The obtained RCFs were credible.It is feasible and suitable to evaluate the quality of Scrophularia root

[Key words]Scrophularia ningpoensis root； iridoid glycosides； quantitative analysis of multicomponents by singlemarker （QAMS）

中藥材內(nèi)在化學(xué)成分的多樣性決定了采用單一指標(biāo)難以真正體現(xiàn)中藥的多效性和整體性。多成分同步測定的質(zhì)量控制必須滿足對(duì)照品供應(yīng)充足且齊全，由于中藥化學(xué)對(duì)照品分離難度大、單體不穩(wěn)定難以供應(yīng)或供應(yīng)價(jià)格高等因素，限制了該評(píng)價(jià)模式下的應(yīng)用[12]。 “一測多評(píng)”（quantitative analysis of ulticomponents by singlemarker，QAMS）為解決該矛盾提供了新思路，這一模式已被2015年版《中國藥典》一部收載。本文以玄參的環(huán)烯醚萜類和苯丙素類不同結(jié)構(gòu)類型的7個(gè)化學(xué)成分為研究對(duì)象，探討“一測多評(píng)”技術(shù)在中藥材多組分質(zhì)量控制中的可行性和適用性。

玄參為玄參科Scrophulariaceae玄參屬Scrophularia植物玄參S ningpoensis Hemsl的干燥根。玄參藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性微寒，味甘、苦、咸，歸肺、脾、腎經(jīng)，具有清熱涼血，滋陰降火，解毒散結(jié)功能[3]。玄參含有的化學(xué)成分復(fù)雜，主要分為環(huán)烯醚萜和苯丙素2大類。環(huán)烯醚萜苷作為玄參藥材的主要活性成分類群，其含量也最為豐富，在玄參的藥理成分活性研究中發(fā)現(xiàn)，苯丙素苷成分在抗炎、保肝、抗氧化、抗血小板聚集等方面也有明顯的作用，甚至比環(huán)烯醚萜苷類強(qiáng)[48]。而目前的文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)玄參的質(zhì)量控制研究著重于環(huán)烯醚萜苷類，藥典中對(duì)玄參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定也僅限于哈巴苷和哈巴俄苷。為了更加全面、客觀的對(duì)玄參藥材進(jìn)行質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)，本研究采用一測多評(píng)的方法，以較為廉價(jià)易得的梓醇為內(nèi)參物，通過建立其與哈巴苷、哈巴俄苷、桃葉珊瑚苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、肉桂酸之間的相對(duì)校正因子，同時(shí)測定7種成分的含量，以實(shí)現(xiàn)用單一對(duì)照品對(duì)玄參進(jìn)行多指標(biāo)成分質(zhì)量控制的目的。

1材料

11實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，openLAB CDS 色譜工作站（美國安捷倫公司）；Shimadzu LC20A高效液相色譜儀，LC Solution 色譜工作站（日本島津公司）；Waters 2487高效液相色譜儀，Breeze色譜工作站（美國 WATERS 公司）；METTLER AE240電子天平（1/10萬，上海梅特勒托利多儀器公司）；SB5200超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；LCMS液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。

12實(shí)驗(yàn)材料

桃葉珊瑚苷（批號(hào) 131228）、哈巴苷（批號(hào) 130918）、梓醇（批號(hào) 130109）、毛蕊花糖苷（批號(hào) 150404）、安格洛苷C（批號(hào) 150910）、哈巴俄苷（批號(hào) 130604）均購自成都普菲德生物公司，供含量測定用，肉桂酸（批號(hào) 15041614）購自北京恒元啟天化工技術(shù)研究院，供含量測定用，經(jīng)LCMS檢測，對(duì)照品純度>98%，滿足含量測定標(biāo)準(zhǔn)；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為自制超純水；玄參藥材部分為武隆仙女山玄參種植基地和南川德隆玄參種植基地直接采挖的新鮮玄參，分別經(jīng)不同溫度直接烘干得到，另外隨機(jī)選擇3批市售干燥品，總共13批樣品。詳細(xì)信息見表1。

2方法與結(jié)果

21色譜條件

根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[910]，哈巴俄苷和肉桂酸在280 nm有最大吸收，毛蕊花糖苷和安格洛苷C在330 nm 有最大吸收，桃葉珊瑚苷、哈巴苷和梓醇只有末端吸收。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用200 nm雖不能達(dá)到各物質(zhì)的最大吸收，但可以實(shí)現(xiàn)玄參中7種有效成分在單一波長下的含量測定。Whelchrom C18色譜柱（46 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） 002%磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～10 min，3% A；10～28 min，3%～40% A； 28～33 min，40% A； 33～38 min，40%～3% A； 38～50 min，3% A。流速1 mL·min-1； 檢測波長200 nm；柱溫25 ℃； 進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖 1。

22對(duì)照品溶液的制備

精密稱取桃葉珊瑚苷、哈巴苷、梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸對(duì)照品適量，加30%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為 0111，0124，0074，0027，0051，0054，0033 g·L-1的混合對(duì)照品溶液。

23供試品溶液的制備

精密稱定玄參粉末約05 g，置具塞錐形瓶中，加入50% 甲醇 50 mL，浸泡1 h，超聲處理45 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻?yàn)V過，取續(xù)濾液，即得。

24方法學(xué)考察

241線性關(guān)系的考察分別精密吸取22項(xiàng)制備的混合對(duì)照品溶液1，2，5，10，15，20 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定，以對(duì)照品進(jìn)樣量 X（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2，各成分進(jìn)樣量在各自范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

242精密度試驗(yàn)取對(duì)照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，桃葉珊瑚苷、哈巴苷、梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷C、哈巴俄苷、肉桂酸峰面積的 RSD 分別為063%，20%，18%，16%，051%，14%，16%，表明儀器精密度良好。

243重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批采于武隆栽培基地的玄參樣品6份，按23項(xiàng)方法制備供試品溶液，各取20 μL 進(jìn)樣，測定峰面積，計(jì)算得桃葉珊瑚苷、哈巴苷、梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸量平均值分別為009%，0072%，0162%，0584%，0260%，0098%，RSD分別為12%，094%，19%，023%，015%，11%，056%，表明重復(fù)性良好。

244穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，分別于配制后0，2，4，6，8，10，12 h 進(jìn)樣 20 μL，測定峰面積，計(jì)算得桃葉珊瑚苷、哈巴苷、梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸含量的 RSD分別為043%，15%，033%，054%，11%，11%，15%，表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。

245加樣回收率試驗(yàn)精密稱定已知含量的玄參粉末約025 g，平行3份，分別按對(duì)照品藥材含量（08∶1，1∶1，12∶1）的比例加入一定量的對(duì)照品溶液，按23項(xiàng)方法制備供試品溶液，每一份重復(fù)測定3次，并計(jì)算各成分的加樣回收率以及RSD。結(jié)果桃葉珊瑚苷、哈巴苷、梓醇、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸的加樣回收率分別為1008%，9971%，9985%，1001%，1002%，1006%，9976%，RSD分別為030%，099%，061%，15%，14%，097%，15%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

25相對(duì)校正因子的確定及其耐用性評(píng)價(jià)

251相對(duì)校正因子的計(jì)算以梓醇為內(nèi)標(biāo)，按照公式fk/m=fk /fm=（Wk×Am）/（Wm×Ak）] （式中Ak為內(nèi)參物峰面積，Wk為內(nèi)參物濃度，Am為其他組分m峰面積，Wm 為其他組分 m 濃度），分別計(jì)算桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸的相對(duì)校正因子，取各自的平均值作為其相對(duì)校正因子，結(jié)果見表 3。

252高效液相色譜儀及色譜柱考察試驗(yàn)在同一實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用Agilent 1260，Shimadzu LC20A和Waters 2487 3種不同的高效液相色譜系統(tǒng)，分別考察了3種不同型號(hào)規(guī)格的色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果各成分相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好（RSD<50%），結(jié)果見表4。

253不同柱溫的考察不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響試驗(yàn)中采用Agilent 1260 高效液相色譜系統(tǒng)，Welchrom C18色譜柱，分別在不同柱溫（20，25，30 ℃）條件下對(duì)7種成分的相對(duì)校正因子進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，相對(duì)校正因子無顯著性差異，RSD<20%，見表5。

26待測色譜峰的定位

分別考察了玄參7種成分間的相對(duì)保留值和保留時(shí)間差在不同品牌儀器和不同品牌色譜柱中的重現(xiàn)性。相對(duì)保留值指各待測成分與內(nèi)參物s 間保留時(shí)間的比值，計(jì)算公式： ras=tRa /tRs； 保留時(shí)間差指各待測成分與內(nèi)參物S 間保留時(shí)間的差值，計(jì)算公式： ΔtRas=tRa-tRs。結(jié)果表明保留時(shí)間差的波動(dòng)較為明顯，RSD>50%，不太適合作為待測成分色譜峰定位的依據(jù)，相對(duì)保留值的波動(dòng)相對(duì)較小，因此采用相對(duì)保留值進(jìn)行玄參中7種待測成分色譜峰的定

位較為可行，見表6，7。

26“一測多評(píng)”法與常規(guī)外標(biāo)法結(jié)果的比較研究

首先采用外標(biāo)法對(duì)玄參中7種成分進(jìn)行多成分同步含量測定，再用建立的QAMS 法對(duì)其含量進(jìn)行計(jì)算，并將2種方法計(jì)算的結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證QAMS 法用于玄參多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，2種方法測得含量沒有顯著性差異，相對(duì)偏差<50%，提示建立的方法具有較好的可信度，結(jié)果見表8。

3討論

31色譜條件的選擇

該研究建立了同時(shí)測定玄參中7種有效成分的高效液相色譜條件，流動(dòng)相采用乙腈水梯度洗脫，并加入少量磷酸，試驗(yàn)中比較了加入磷酸、冰醋酸以及甲酸的分離效果，最后發(fā)現(xiàn)磷酸效果最佳，達(dá)到基線分離且峰形較好，該檢測方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

32內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的選擇

梓醇對(duì)照品價(jià)廉易得、性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，以梓醇為內(nèi)參物時(shí)，各成分間的相對(duì)校正因子較穩(wěn)定。從表5不同儀器和色譜柱耐用性考察結(jié)果可看出，6種成分和內(nèi)參物梓醇之間的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，故本實(shí)驗(yàn)選擇梓醇為內(nèi)參物質(zhì)進(jìn)行一測多評(píng)分析。

33樣品含量測定結(jié)果分析

根據(jù)對(duì)13批樣品的7種成分的含量測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)隨機(jī)抽取的3批市售品中哈巴苷和哈巴俄苷的總含量均低于045%，不符合藥典規(guī)定。說明一部分質(zhì)量不合格的玄參藥材仍在市場中流通，需相關(guān)部門加強(qiáng)管制與監(jiān)控。另外，對(duì)兩個(gè)產(chǎn)地的新鮮玄參采用不同溫度直接烘干的方法進(jìn)行粗加工，其哈巴苷和哈巴俄苷的總含量均高于045%，但梓醇、哈巴苷以及毛蕊花糖苷等成分的含量差異較大，說明干燥溫度對(duì)玄參有效成分有較大影響，其影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

34玄參QAMS 質(zhì)量評(píng)價(jià)模式

從表8測得結(jié)果可以看出，一測多評(píng)法測定的各成分含量與外標(biāo)法測定的含量無顯著性差異。在對(duì)照品缺乏的情況下，可以用外標(biāo)法測定梓醇，利用相對(duì)校正因子實(shí)現(xiàn)對(duì)桃葉珊瑚苷、哈巴苷、毛蕊花糖苷、安格洛苷 C、哈巴俄苷、肉桂酸的含量測定，最大限度降低檢驗(yàn)成本，又可以起到更加全面科學(xué)控制玄參藥材質(zhì)量的目的，可將一測多評(píng)法用于玄參有效成分測定甚至更多中藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

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[責(zé)任編輯丁廣治]