袁歡　王濤　祝晨蔯　吳愛芝　林朝展

[摘要]以中性紅為分子探針研究2種苯乙醇苷類化合物（PhGs）毛蕊花糖苷和連翹酯苷B在生理條件下與小牛胸腺DNA（ctDNA）之間的相互作用。熒光光譜、紫外光譜、黏度、DNA熱變性實驗和分子對接結(jié)果表明：這2種PhGs主要采用氫鍵作用以溝區(qū)方式結(jié)合到ctDNA雙螺旋小溝中，毛蕊花糖苷與DNA結(jié)合作用更強。

[關(guān)鍵詞]苯乙醇苷； ctDNA； 中性紅； 分子對接

[Abstract]In physiological condition， the interaction of acteoside and forsythoside B with calf thymus DNA using neutral red （NR） as a fluorescence probe were investigated by fluorescence， UVvisible spectrophotometry， viscosity， DNA melting techniques， and molecular docking It is observed that acteoside and forsythoside B can react with DNA The major mode of recognition between drug and DNA is groove binding by hydrogen bonds， and the interaction of acteoside with DNA is stronger than that of forsythoside B

[Key words]phenylethanoid glycosides； ctDNA； neutral red； molecular docking

眾所周知，脫氧核糖核酸（DNA）是生命體內(nèi)基因表達的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究藥物小分子與DNA之間的相互作用機理，是當今生命科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的課題。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，糖苷藥物中的糖基作為藥物分子的一部分不僅可以調(diào)節(jié)脂水分配系數(shù)、調(diào)節(jié)血漿半衰期、改善藥動學(xué)性能，而且其糖基片段上豐富的羥基對DNA等作用靶點具有特異性的識別與結(jié)合功能，因此糖基作為直接功能基團可以存在于許多以DNA為靶點的抗腫瘤化療藥物中[1]。含雙糖和三糖的苯乙醇苷類成分（PhGs） 毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B在紫珠屬植物Callicarpa L中廣泛存在，藥理實驗顯示這2個化合物具有良好的抗癌和抗炎活性[23]。PhGs抑制惡性細胞增生的能力主要取決于苯乙基上的取代基，表現(xiàn)為3，4鄰二羥基苯乙基芳香體系有相當強的抗腫瘤作用[4]。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B中正含有這樣的結(jié)構(gòu)片斷，因此研究二者與DNA的微觀相互作用具有重要意義。

DNA本身熒光極弱，常用溴化乙錠作為熒光探針，但其毒性大，具有強致癌性，污染環(huán)境。與溴化乙錠相比，中性紅（NR）作為熒光探針穩(wěn)定性好、毒性低[5]。本文將以NR為分子探針，選擇紫珠屬植物中富含的2個PhGs成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B作為藥物小分子，結(jié)構(gòu)見圖1，采用光譜法和分子對接技術(shù)首次研究其與ctDNA的相互作用，旨在闡明PhGs與DNA的作用方式、糖基片段對作用方式的影響。實驗結(jié)果為以DNA為靶標的藥物分子設(shè)計提供有益探索，同時也為紫珠屬植物的深入臨床醫(yī)學(xué)研究提供重要理論依據(jù)。

1材料

F2500熒光光度計（Hitachi公司），UV1000紫外可見光譜儀（上海天美科學(xué)儀器有限公司），CHIRASCAN圓二色光譜儀（英國應(yīng)用光物理公司），VG ZABHS質(zhì)譜儀（英國VG公司），AVANCE400超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker公司），伍氏黏度計。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B（從紫珠屬植物藤紫珠中分離得到，純度>98%）溶液：配制成濃度為128×10-3mol·L-1的水溶液。中性紅（上海阿拉丁，純度99%）溶液：配制成100×10-5mol·L-1的水溶液。DNA（華美生物工程），溶液濃度以A260 nm/A280 nm>18衡量，濃度以260 nm處吸光度來確定（ε=6 600 L·mol-1·cm-1），4 ℃以下避光保存。緩沖液由01 mol·L-1Tris溶液和01 mol·L-1HCl配制（pH 740），實驗過程中所用試劑均為分析純，用水為二次蒸餾水。

2方法

21紫外測試在5 mL量瓶中，加入1 mL的trisHCl緩沖溶液和50μL的藥物溶液，分別在容量瓶中依次加入不同體積的DNA溶液，trisHCl溶液定容。室溫放置20 min后，以緩沖液為參比，測定200～400 nm紫外圖譜。間隔05 nm，狹縫2 nm。

22熒光試驗分別移取濃度為100×10-3 mol·L-1的DNA溶液50 μL，濃度為100×10-3 mol·L-1的NR溶液50 μL于4 mL石英吸收池中，加入緩沖液TrisHCl 3 mL，用微量注射器進行熒光滴定，每次加入10 μL藥物溶液，混合均勻，靜置5 min。以467 nm為激發(fā)波長，入射和發(fā)射狹縫分別為5 nm，在熒光光度計上記錄500～700 nm波長的發(fā)射光譜。

23DNA熔點試驗配制2組NRDNA溶液，其中1組加入適量藥物，水浴加熱，在40～100 ℃，每隔5 ℃監(jiān)測DNA在260 nm處吸光值的變化。以fss=（A-A0）/（Af -A0）為縱坐標（A，Af 分別為起始吸光度和最終吸光度，A為表觀吸光度），溫度為橫坐標作圖，得到DNA的熱變性溫度曲線圖。

24黏度試驗DNA濃度固定為440 ×10-4 mol·L-1，藥物濃度依次增大，溫度恒定在（25±01） ℃，反應(yīng)20 min后，進行測量。數(shù)據(jù)以（η/η0）1/3對藥物濃度作圖。η代表DNA在藥物體系時的黏度，η0代表DNA單獨存在時的黏度。

25分子對接藥物小分子初始結(jié)構(gòu)由分子模擬軟件SybylX13 獲得，運用Tripos力場和GasteigerHückel電荷對分子結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。DNA晶體結(jié)構(gòu)來自PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（編號425D）。采用Surflex程序進行分子對接時，考慮了小分子10個構(gòu)象，結(jié)合自由能最低的構(gòu)象用來做進一步理論分析。dsDNA分子優(yōu)化前去除其結(jié)構(gòu)中的水分子。對接原型分子通過選擇堿基對生成，對接過程中考慮了配體小分子環(huán)的柔性。

3結(jié)果與討論

31紫外光譜NR與DNA相互作用的紫外可見光譜圖，見圖2，顯示了DNA的加入對NR吸收光譜的影響。圖2中曲線 （a）是NR的吸收譜圖，可以看出其最大吸收峰在462 nm，DNA的加入使得NR在462 nm處的吸收峰發(fā)生了明顯減色效應(yīng)和一定程度的紅移現(xiàn)象，說明NR與DNA發(fā)生了嵌插作用[6]。545 nm處附近出現(xiàn)了1個新吸收峰，此峰應(yīng)該是NRDNA復(fù)合物的吸收峰[7]。462 nm處明顯的減色效應(yīng)表明NR和DNA堿基之間緊密靠近，DNA中大量堿基層層堆積，使得雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個強大的疏水區(qū)。紅移現(xiàn)象表明NR嵌入到DNA堿基對后，周圍所處的環(huán)境發(fā)生了改變，DNA與溶劑水分子形成氫鍵的能力降低。結(jié)果表明，NR主要以嵌插方式與DNA結(jié)合形成復(fù)合物。

毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的紫外可見吸收光譜，見圖3。這2個PhGs由于丙烯酸酯雙鍵與苯環(huán)共扼振動發(fā)生在333 nm附近，因而這類成分在333 nm附近具有特定的吸收光譜。與DNANR體系的吸收圖譜比較，見圖2。當PhGs溶液中不斷增加DNA濃度時，這類小分子在333 nm處的最大吸收峰強度幾乎沒有發(fā)生紅移和減色效應(yīng)，表明這2個小分子與DNA的作用方式不是典型

32藥物對NRDNA體系熒光猝滅程度的影響NR在pH 740水溶液中熒光很弱，當有DNA存在時，NR在DNA中的嵌插式結(jié)合會使體系熒光強度明顯增強。2種PhGs逐漸加入到NRDNA體系時的熒光猝滅曲線，其中F0為不加藥物時在602 nm處的熒光強度，F(xiàn)為藥物存在時在602 nm處的熒光強度，見圖4。熒光光譜顯示隨著PhGs加入到NRDNA體系，熒光峰的形狀和位置并沒有改變，但其熒光強度隨著藥物濃度的增加而不斷降低，并且2個PhGs化合物對NRDNA體系熒光猝滅的程度存在明顯差異，猝滅程度毛蕊花糖苷明顯大于連翹酯苷 B，表明PhGs與NR之間存在競爭結(jié)合，間接反映了毛蕊花糖苷與DNA的結(jié)合強度大于連翹酯苷B。熒光猝滅的原因可能是富含羥基的PhGs參與了和NR競爭結(jié)合DNA的過程，使得NR和DNA結(jié)合力減弱，從而導(dǎo)致體系熒光強度降低，推測氫鍵作用對PhGs和DNA的結(jié)合具有重要影響[9]。

33藥物對NRDNA熱變性溫度的影響通常把DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時的溫度稱為該DNA的熔點或熔接溫度，用Tm表示，藥物與DNA的相互作用會影響Tm。嵌插作用能夠使雙螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，因而會使Tm增加5～8 ℃，而溝區(qū)結(jié)合不會使Tm有明顯增加[10]。當fss=05時所對應(yīng)的溫度就是Tm，當藥物加入到DNANR后，體系Tm減小，再次證明藥物與DNA的結(jié)合不是嵌插式結(jié)合，Tm的降低可能是由于藥物與DNA溝區(qū)的結(jié)合作用，一定程度上改變了體系的構(gòu)象，使體系穩(wěn)定性降低，見圖5。

34黏度試驗黏度測定一般被認為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一。當藥物以嵌插方式進入DNA雙螺旋堿基對時，相鄰堿基對之間的距離會增大以便容納插入的配體，導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)膨脹變粗變長，DNA溶液的黏度會增大；而以溝區(qū)結(jié)合等非嵌插方式與DNA作用時，DNA 結(jié)構(gòu)不會伸展，此時DNA 溶液的黏度無明顯變化[11]。DNA在不同濃度藥物存在時的相對黏度變化見圖 6。結(jié)果顯示，加入藥物后，DNA的相對黏度變化并未明顯增加，表明藥物與DNA的作用未引起DNA雙螺旋骨架的扭曲變化，推測其與DNA作用方式為溝區(qū)結(jié)合。

35分子對接利用分子對接技術(shù)可以直觀形象的反映藥物與DNA 的結(jié)合情況，這有助于從理論上確定小分子與DNA相互作用的機制和模式[1214]。結(jié)合毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA相互作用的實驗結(jié)果可知，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B主要以溝區(qū)方式與DNA結(jié)合。因此分子對接過程中選擇DNA分子的雙螺旋小溝作為PhGs結(jié)合靶點，2個小分子與DNA作用的最佳分子對接模型，見圖7。藥物與DNA相互作用過程中根據(jù)分子對接分值（total score）值計算得到的結(jié)合常數(shù)Ka和ΔG，見表1。

對接結(jié)果顯示，毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B可以緊密結(jié)合在ctDNA的GGTAC小溝區(qū)域，形成雙螺旋d（GGTACCCATG）2DNA復(fù)合物。2個PhGs中的苯乙基、咖啡?；吞黔h(huán)上的羥基可與DNA上的胸腺嘧啶、腺嘌呤、戊糖、磷酸之間生成多個氫鍵，即PhGs與DNA二者之間存在強的氫鍵相互作用，這些氫鍵的存在對于PhGs結(jié)合在DNA小溝區(qū)域起著至關(guān)重要的作用。毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B與DNA結(jié)合時的total score值分別為753和711，結(jié)合常數(shù)Ka分別為339×107和129×107，結(jié)合吉布斯自由能變化值ΔG分別為-4299，-4059 kJ·mol-1，計算結(jié)果表明毛蕊花糖苷與DNA的結(jié)合能力大于連翹酯苷 B，結(jié)論與實驗結(jié)果吻合。毛蕊花糖苷中主要是苯乙基、葡萄糖基和咖啡?；Y(jié)合于DNA小溝，鼠李糖暴露在DNA鏈外；而連翹酯苷 B中主要是苯乙基、葡萄糖基和芹糖結(jié)合于DNA小溝，咖啡?；褪罄钐潜┞对贒NA鏈外，表明PhGs中心葡萄糖6位被芹糖取代后的角度更有利于小分子與DNA雙螺旋小溝匹配，見圖7，。原因可能是小分子中的這些多元環(huán)由扭轉(zhuǎn)的自由鍵連接，由此可產(chǎn)生合適的扭轉(zhuǎn)力來匹配小溝區(qū)的螺旋曲線，并在DNA雙螺旋鏈中AT富集的小溝區(qū)邊緣主要通過氫鍵作用形成接觸。這種選擇性作用可以非嵌入性地捆縛住DNA，阻止DNA的模板作用，從而達到抗腫瘤、抗病毒的目的。

4結(jié)語

本文用光譜學(xué)方法和分子對接技術(shù)探討了生理條件下PhGs類成分毛蕊花糖苷和連翹酯苷 B分別與DNA的相互作用。結(jié)果表明：結(jié)構(gòu)類似的PhGs由于糖基種類、數(shù)目和取代位置的不同導(dǎo)致了與DNA結(jié)合模式的差異，這對于從分子水平深入理解PhGs化合物與DNA的作用機制，以及如何修飾一系列結(jié)構(gòu)類似的PhGs藥物促進其在體內(nèi)吸收和轉(zhuǎn)運具有極為重要的意義。另外，探究結(jié)構(gòu)不同的PhGs與DNA之間可能的序列選擇性為PhGs可不同程度修復(fù)損傷的DNA提供了合理解釋。

[參考文獻]

[1]Singh S， McCoy J G， Zhang C， et al Structure and mechanism of the rebeccamycin sugar 4Omethyltransferase RebM [J] J Biol Chem， 2008， 283（33）：22628

[2]Peerzada K J， Faridi A H， Sharma L， et al Acteosidemediates chemoprevention of experimental liver carcinogenesis through STAT3 regulated oxidative stress and apoptosis[J] Environ Toxicol， 2016， 31（7）：782

[3]Jiang W L， Fu F H， Xu B M， et al Cardioprotection with forsythoside B in rat myocardial ischemiareperfusion injury： relation to inflammation response[J] Phytomedicine， 2010，17： 635

[4]Abe F， Nagao T， Okabe H Antiproliferative constituents in Plants 9 aerial parts of Lippia dulcis and Lippia canescens[J].Biol Pharm Bull， 2002， 25： 920

[5]曹瑛， 李一峻， 何錫文 中性紅作為DNA作用方式光譜探針的研究[J] 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報， 1999， 20（5）： 709

[6]Pyle A M， Rehmann J P， Meshoyrer R， et al Mixedligand complexes of ruthenium （Ⅱ）： factors governing binding to DNA[J] J Amer Chem Soc， 1989， 111： 3051

[7]Ni Y N， Lin D Q， Kokot S Synchronous fluorescence and UVVisible spectrometric study of the competitive interaction of chlorpromazine hydrochloride and neutral red with DNA using chemometric sapproaches[J] Talanta， 2005， 65（5）： 1295

[8]Patel D J Nuclear magnetic resonance studies of drugnucleic acid interactions at the synthetic DNA level in solution[J] Acc Chem Res， 1979， 12（4）： 118

[9]Qais F A， Abdullah K M， Alam M M， et al Interaction of capsaicin with calf thymus DNA： a multispectroscopic and molecular modelling study [J] Int J Biol Macromol， 2017， 97：392

[10]Sarwar1 T， Ishqi H M， Rehman S U， et al Caffeic acid binds to the minor groove of calf thymus DNA： a multispectroscopic， thermodynamics and molecular modelling study[J] Int J Biol Macromol， 2017， 98： 319

[11]Bera R， Sahoo B K， Ghosh K S， et al Studies on the interaction of isoxazolcurcumin with calf thymus DNA [J] Int J Biol Macromol， 2008， 42： 14

[12]Wang G K， Yan C L， Wang D C， et al Specific binding of a dihydropyrimidinone derivative with DNA： spectroscopic， calorimetric and modeling investigations[J] J Lumin， 2012， 132： 1656

[13]Hassan M F， Rauf A Synthesis and multispectroscopic DNA binding study of 1，3，4oxadiazole and 1，3，4thiadiazole derivatives of fatty acid[J] Spectrochim Acta Part A， 2016， 153： 510

[14]Ahmad F， Valadbeigi S， Sajjadi S E， et al Grandivittin as a natural minor groove binder extracted from Ferulago macrocarpa to ctDNA， experimental and in silico analysis[J] Chem Biol Interact， 2016， 258： 89

[責(zé)任編輯丁廣治]