張曉東，李彩霞，李 爽，劉倩倩，王元忠，王家金*

(1.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223)

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滇龍膽香葉醇10-羥化酶基因的克隆與表達分析

張曉東1，李彩霞1，李 爽1，劉倩倩1，王元忠2，王家金2*

(1.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 653100；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650223)

【目的】克隆滇龍膽香葉醇10-羥化酶基因GrG10H(geraniol 10-hydroxylase)，分析其生物信息學(xué)特征、基因結(jié)構(gòu)、蛋白表達和組織表達情況，為龍膽苦苷生物合成途徑解析提供理論依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^RT-PCR及基因克隆方法，從滇龍膽總RNA中克隆得到基因GrG10H及其基因組序列；使用生物信息學(xué)方法分析其DNA序列及其編碼蛋白特性，使用Clustal X2.1軟件對GrG10H蛋白質(zhì)及其同源序列做序列比對，使用MEGA7.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建；利用定量PCR技術(shù)分析GrG10H基因在滇龍膽根莖葉中的表達水平?！窘Y(jié)果】使用RT-PCR方法從滇龍膽葉片中克隆得GrG10H基因全長為1834 bp，包含2外顯子和1內(nèi)含子，ORF 1548 bp，將序列提交至GenBank，得到序列號KJ418410。生物信息學(xué)分析表明，該基因編碼515個氨基酸，分子量為57.74 kD，理論等電點為9.02；該蛋白屬于細胞色素P450超家族成員，定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其N端含一跨膜螺旋(21～43)，其中1～20氨基酸殘基位于膜內(nèi)，44～515位于膜外。該蛋白無信號肽，為親水穩(wěn)定蛋白，主要由無規(guī)則卷曲(44.85%)和α-螺旋(40.58%)構(gòu)成。GrG10H蛋白與川西獐牙菜SmG10H蛋白具有較高的相似性(87%)，且親緣關(guān)系最近。原核表達結(jié)果表明，GrG10H基因在大腸桿菌中表達的重組蛋白相對分子質(zhì)量約為83.74 kD (含GST標(biāo)簽26.00 kD)，與預(yù)期蛋白大小一致。組織特異性表達分析結(jié)果表明GrG10H基因主要在葉中表達。【結(jié)論】克隆到滇龍膽GrG10H基因，并成功在大腸桿菌中表達，推測其在主要葉片中起作用。

滇龍膽；香葉醇10-羥化酶；基因克??；表達分析

【研究意義】滇龍膽為云南省道地藥材。近年來，由于其市場需求量急劇增加，野生滇龍膽遭到人為過度采挖，導(dǎo)致其野生資源匱乏，現(xiàn)已被列為國家三級重點保護植物[1]。龍膽苦苷是滇龍膽的主要藥用成分，要解決市場上滇龍膽植物原料問題，需要搞清龍膽苦苷的合成途徑和調(diào)控機制[2]，為生產(chǎn)龍膽苦苷創(chuàng)造新途徑。在龍膽苦苷生物合成途徑中，10-羥香葉醇(10-hydroxygeraniol)是重要的中間產(chǎn)物[3-4]?！厩叭搜芯窟M展】在川西獐牙菜(Swertiamussotii)中，細胞色素P450單加氧酶(CYP)香葉醇10-羥化酶(geraniol 10-hydroxylase，SmG10H，EC 1.14.14.1)能夠催化香葉醇(geraniol)生成10-羥香葉醇[5-7]，該反應(yīng)需要NADP、H+和氧的參與；茉莉酸甲酯(MeJA)能夠通過誘導(dǎo)該基因的表達，促進獐牙菜苦苷(swertiamarin)的累積[8]。目前，香葉醇10-羥化酶基因G10H已經(jīng)從蘿芙木[5]、金雞納樹[5]、長春花[9]、川西獐牙菜[8]、秦艽[10-11]、藍星花[5]、小蔓長春花[5]、喜樹[12]和金銀花[5]等多種植物分離。Canto-Canché等以長春花CrG10H蛋白為免疫原，注射兔子后成功地獲得了適合多種植物G10H蛋白檢測的多克隆抗血清[9]。CrG10H基因的表達具有組織特異性，并受植物激素的影響。如在轉(zhuǎn)基因煙草幼苗中，CrG10H基因僅在葉和根尖活躍生長的細胞中表達；在轉(zhuǎn)基因長春花毛狀根和轉(zhuǎn)基因煙草幼苗中，真菌誘導(dǎo)子和茉莉酸甲酯均能誘導(dǎo)CrG10H基因的表達[13]。在長春花CrG10H基因啟動子中，其潛在的增強子分別位于-191到-147、-266到-188和-318到-266[13]。研究還表明，香葉醇10-羥化酶是單萜吲哚生物堿生物合成的速度限制步驟[9]。在長春花細胞中，CrG10H基因表達與長春質(zhì)堿和文多靈的含量有顯著的正相關(guān)[14]。在川西獐牙菜中，過表達SmG10H基因可同時增加10-羥香葉醇和獐牙菜苦苷的含量[8]。在長春花毛根中同時過表達CrDXS和CrG10H，導(dǎo)致單萜類吲哚生物堿阿嗎堿(ajmalicine)、洛柯定堿(lochnericine)和它波寧的含量分別增加16%、31%和13%[15]。最新研究表明，長春花中的香葉醇10-羥化酶CrG10H在萜類和類黃酮合成中均起作用[16]，在短小蛇根草毛狀根中過表達長春花CrG10H基因能夠極大地提高喜樹堿的產(chǎn)量[17]?！颈狙芯壳腥朦c】截止到現(xiàn)在，由于遠源雜交、基因組龐大等引起的基因組雜合性、生長時間長和重要農(nóng)藝性狀遺傳信息缺少，導(dǎo)致龍膽基因組資源相當(dāng)匱乏[18]。前期研究表明GrG10H基因是龍膽苦苷生物合成的關(guān)鍵酶基因，但在滇龍膽還未被克隆和研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究根據(jù)前期滇龍膽轉(zhuǎn)錄組測序獲得的GrG10H基因序列，設(shè)計一對特異性引物，通過TA克隆獲得GrG10H基因，進行基因及其編碼蛋白的序列分析、原核表達和根莖葉表達特異性分析，為闡明滇龍膽主要藥效成分龍膽苦苷的生物合成途徑和調(diào)控機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和GrG10H基因克隆 根據(jù)植物總RNA提取試劑(Takara)說明書提取組培苗幼葉的總RNA，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara)說明書合成第一鏈cDNA。根據(jù)GrG10H基因序列和原核表達載體pGEX-4T-1多克隆位點，設(shè)計基因特異引物GrG10HXhoI-R與GrG10HBamHI-F(表1)。采用高保真酶(全氏金)酶進行DNA擴增，PCR條件為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物通過電泳分離，切膠后采用DNA膠回收試劑盒(百泰克)對目的DNA片段進行回收，然后將其連接到T載體上，轉(zhuǎn)化E.Coli. DH5α(全氏金)化學(xué)感受態(tài)細胞，涂布于含Amp(Takara)+ X-Gal(Takara)+ IPTG(Takara)固體LB平板，37℃過夜培養(yǎng)，然后挑12個陽性菌斑，250 r/min、37℃恒溫培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒，從質(zhì)粒大小檢測正確的里面選取3～5個，通過酶切鑒定后送公司進行測序，獲得pMD19-GrG10H重組載體。

1.2.2GrG10H基因gDNA序列的克隆 使用基因組提取試劑盒MiniBEST Plant DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(Takara)從滇龍膽葉片中提取基因組DNA(gDNA)，然后使用引物GrG10HBamHI-F和GrG10HBamHI-R進行PCR反應(yīng)，程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，擴增30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，進行膠回收、TA克隆和測序。

表1 GrG10H克隆和qPCR分析的引物序列

1.2.3GrG10H原核表達載體構(gòu)建和原核表達 分別對質(zhì)粒pMD19-GrG10H和pGEX-4T-1(Amersham)進行BamH I和XhoI雙酶切，分別回收GrG10H基因和pGEX-4T-1載體，進行連接，獲得質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrG10H。純化質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA測序，以確保沒有發(fā)生移碼。使用42℃熱激45 s的方法將質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrG10H轉(zhuǎn)化EcoliRosetta(DE3)感受態(tài)細胞(全氏金)后，挑單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)中，250 r/min、37 ℃培養(yǎng)過夜。然后以菌種∶LB培養(yǎng)基 = 1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB液體培養(yǎng)基(不含抗生素)中，250 r/min、37 ℃培養(yǎng)約3 h使OD600≈ 0.6-0.8，在1 mmol/L IPTG終濃度、37 ℃恒溫誘導(dǎo)下進行表達，以完全相同條件的空載體轉(zhuǎn)化菌作為對照。誘導(dǎo)分別為0、2、4和6 h，集菌2 mL。10 000 r/min、4 ℃下離心30 s，倒掉上清液，加入ddH2O 100 μl、蛋白Loading 25 μl，懸菌混勻，100 ℃煮5 min。12 000 r/min、4 ℃離心6 min。吸取蛋白上清液20 μl上樣，進行電泳檢測。

1.2.4GrG10H基因序列分析 參照張曉東等人的方法[19]，分別進行DNA和蛋白質(zhì)序列的生物信息學(xué)分析?；騼?nèi)含子和外顯子分析方法為：將GrG10H基因的ORF序列與其gDNA序列進行比對，再結(jié)合內(nèi)含子GT-AG規(guī)則，來確定內(nèi)含子和外顯子序列。

1.2.5GrG10H基因的qPCR分析 取3年生盆栽滇龍膽的葉、莖和根，分別抽提總RNA，然后使用DNase I(Takara)去除可能污染的基因組DNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara)合成cDNA。選擇GrGAPDH基因作為內(nèi)參[20]。根據(jù)GrG10H基因的cDNA序列設(shè)計特異性引物GrG10H-F和GrG10H-R(表1)。采用實時熒光定量PCR試劑盒(天根)進行反應(yīng)，反應(yīng)條件設(shè)為：95℃變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火延伸31s。每個PCR反應(yīng)重復(fù)3次。qPCR反應(yīng)在ABI7000 qPCR儀(Applied Biosystems)上進行，軟件自動生成擴增曲線、溶解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用內(nèi)參基因校準(zhǔn)后，分別計算GrG10H基因在葉、莖和根中的相對表達量。定量數(shù)據(jù)分析處理采用 “2-△△Ct” 比較Ct值的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1GrG10H基因克隆

第六，信息披露不及時。如上已述，格魯吉亞的群體性事件很大程度上緣起于人民群眾不清楚蘇共二十大決議的內(nèi)容。身處莫斯科的中央高層領(lǐng)導(dǎo)應(yīng)該知道：揭露斯大林的所謂“暴政”，民眾會產(chǎn)生怎樣的反應(yīng)。為了避免其過激反應(yīng)，“應(yīng)該往格魯吉亞派出有經(jīng)驗的宣傳人員，向群眾解釋所發(fā)生的一切”。[11](P132-133)問題是，官僚主義十足的高層領(lǐng)導(dǎo)們壓根兒沒有這樣做。如果這樣做了，那么，可以相信：“很多第比利斯的居民都能夠理解二十大的決議，這種震動了整個加盟共和國的風(fēng)潮和不必要的犧牲都是可以避免的?！盵11](P133)

使用基因特異性引物、滇龍膽gDNA和cDNA模板，分別擴增出約2000和1500 bp的DNA片段(圖1A、圖1B)。通過克隆的方法獲得質(zhì)粒pMD19-GrG10H(gDNA)和pMD19-GrG10H(cDNA)，酶切檢測正確后，送公司進行DNA測序。測序結(jié)果表明GrG10H基因(GenBank登錄號：KJ418410)長1834 bp，而其ORF序列長1548 bp(圖1C)。

2.2GrG10H基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN 7軟件對GrG10H基因的gDNA序列和其ORF序列進行比對，再結(jié)合內(nèi)含子的GT-AG規(guī)則進行分析，結(jié)果顯示GrG10H基因包含2個外顯子(1-942，1229-1834)和1個內(nèi)含子(943-1228)(圖1C)，這與川西獐牙菜SmG10H基因結(jié)構(gòu)類似[8]；該基因ORF為1548 bp，編碼氨基酸515個。

采用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLASTp對GrG10H蛋白序列進行分析，結(jié)果表明滇龍膽GrG10H蛋白與川西獐牙菜SmG10H相似性最高，為86.26 %，與茄子SmCYP76A2相似性較低，為36.14 %。使用DNAMAN 8將滇龍膽GrG10H蛋白與GenBank中相似性較高的蛋白進行多序列比對，結(jié)果顯示GrG10H與已知G10H蛋白序列保守性很高(圖2)。利用Mega 7將GrG10H蛋白與相似性較高的G10H蛋白進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明GrG10H蛋白與川西獐牙菜SmG10H蛋白位于同一進化枝(圖3)，表明他們的親緣關(guān)系很近。

M：Marker III；A：GrG10H基因gDNA序列；B：GrG10H基因ORF序列；C中數(shù)字表示堿基數(shù)目M:Marker III; A: gDNA sequence of GrG10H; B: ORF of GrG10H; The number in C indicate the number of base pair(s)圖1 滇龍膽GrG10H基因的基因組序列(A)，ORF序列(B)的PCR擴增和基因結(jié)構(gòu)(C)Fig.1 PCR amplification and structure of GrG10H gene in G. rigescens

黑色：相似性為100%；粉紅：75%≤相似性<100%；淺藍：50%≤相似性<75%Black: homology = 100%; pink: 75% ≤ homology < 100%; light blue: 50% ≤ homology < 75%圖2 滇龍膽GrG10H蛋白多序列比對結(jié)果Fig.2 Multiple sequence alignment of GrG10H protein in G. rigescens

數(shù)值代表從1 000次重復(fù)計算得到的bootstrap百分比值The bootstrap percentage values calculated from 1 000 replications were represented by numbers圖3 滇龍膽GrG10H蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree of GrG10H protein in G. rigescens

采用ProtParam軟件對GrG10H蛋白進行分析，結(jié)果顯示GrG10H蛋白分子量為57.74 kDa，化學(xué)方程式為：C2601H4127N707O735S21；不穩(wěn)定指數(shù)較低(38.64)，屬穩(wěn)定性蛋白；脂肪指數(shù)較低(91.65)，屬于親水蛋白。GrG10H蛋白的氨基酸組成中，亮氨酸含量最高(12 %)；其次分別為賴氨酸、丙氨酸和絲氨酸(7.2 %、7.0 %、7.0 %)；色氨酸和半胱氨酸含量最低(1.4 %)。

使用SSpro方法進行α-螺旋(H)、無規(guī)則卷曲(C)和延伸帶(E)等二級結(jié)構(gòu)的分析，結(jié)果顯示GrG10H蛋白中H占40.58 %， C占44.85 %， E占14.56 %。利用Phyre2預(yù)測GrG10H蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4，該模型以穴兔微體細胞色素P450 2C5酶[d1nr6a]為模板，在第51～514氨基酸處建模，序列相似度為89.00 %，可信度為100 %；結(jié)果還表明該蛋白主要是由α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成的(圖4)。采用InterPro工具及相關(guān)文獻預(yù)測GrG10H蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明GrG10H蛋白具有1個P450超家族結(jié)構(gòu)域，在其N端具有富含脯氨酸的區(qū)域PPGPVPLP，C端具有血紅素結(jié)合部位PFGAGRRICPG，中間具有保守區(qū)AGTDTT。

圖4 滇龍膽GrG10H蛋白3D結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of 3D structure of GrG10H protein in G. rigescens

A：GrG10H蛋白跨膜螺旋預(yù)測；B：斜體表示可能的跨膜螺旋序列；C：預(yù)測螺旋輪的投射A: Prediction of transmembrane helix in GrG10H; B: Italics showed the likely transmembrane helix; C: Projection of the predicted helical wheel圖5 滇龍膽GrG10H蛋白N末端跨膜螺旋預(yù)測Fig.5 Prediction of a likely transmembrane helix at the N-terminal of GrG10H in G. rigescens

使用SignalP服務(wù)器對GrG10H蛋白進行分析，沒有發(fā)現(xiàn)信號肽，表明GrG10H為非分泌型蛋白。GrG10H跨膜螺旋區(qū)預(yù)測結(jié)果表明該蛋白為膜蛋白，這與長春花中的CrG10H蛋白相一致[21]。GrG10H蛋白的第1～20氨基酸殘基處于膜內(nèi)，第21～43氨基酸為跨膜螺旋區(qū)域，含酸性氨基酸殘基(Asp)，剩余的氨基酸殘基在膜外(圖5)。采用ChloroP軟件對GrG10H蛋白葉綠體轉(zhuǎn)運肽進行預(yù)測，結(jié)果顯示該蛋白不包含葉綠體轉(zhuǎn)運肽。

稀有密碼子預(yù)測結(jié)果表明，GrG10H稀有密碼子占1.36 %，且不存在二聯(lián)、三聯(lián)稀有密碼子，所以可選用E.coli. BL21或E.coli. Rosetta(DE3)進行GrG10H蛋白的原核表達。

2.3GrG10H基因的原核表達載體構(gòu)建

使用限制酶BamH I和XhoI分別對pGEX-4T-1和pMD19-GrG10H進行雙酶切，回收載體和目的基因，連接后，獲得重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrG10H。雙酶切質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrG10H，能夠切出目的基因GrG10H片段和載體(圖6)，單酶切獲得線性質(zhì)粒，其大小為雙酶切產(chǎn)生的2個片段之和，表明pGEX-4T-1-GrG10H質(zhì)粒已成功構(gòu)建。測序結(jié)果表明，沒有移碼現(xiàn)象發(fā)生。

2.4GrG10H基因的原核表達

將測序檢測正確的pGEX-4T-1-GrG10H質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Ecoli. Rosetta(DE3)后，使用IPTG進行誘導(dǎo)表達。在1 mmol/L IPTG終濃度和37 ℃恒溫條件下，共誘導(dǎo)表達6 h，期間每隔2 h取樣1次，抽提細菌總蛋白跑SDS-PAGE進行檢測。結(jié)果顯示，與未加IPTG的pGEX-4T-1對照(泳道1)相比，IPTG誘導(dǎo)后的pGEX-4T-1菌出現(xiàn)GST標(biāo)簽蛋白(泳道2)；與未加IPTG的pGEX-4T-1-GrG10H的對照(泳道3)相比較，轉(zhuǎn)化菌pGEX-4T-1-GrG10H經(jīng)過誘導(dǎo)后，在相對分子質(zhì)量約83.74 kDa處有1條顯著的差異條帶(泳道4、5、6)，而且蛋白含量隨著誘導(dǎo)時間的增加而增加，說明pGEX-4T-1-GrG10H質(zhì)粒在Ecoli. Rosetta(DE3)中已成功誘導(dǎo)表達出馬達蛋白GrG10H。GrG10H蛋白適宜的表達條件為：37 ℃、誘導(dǎo)表達6 h、1 mM IPTG(圖7)，此條件下誘導(dǎo)表達的蛋白，可用于蛋白純化。

M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-2：Bam H I和Xho I雙酶切、XhoI單酶切質(zhì)粒pGEX-4T-1-GrG10H的結(jié)果；3：負對照M: DNA standard; 1-2: The results of pGEX-4T-1-GrG10H digestions by Bam H I and Xho I, Xho I; 3: Negative control圖6 pGEX-4T-1-GrG10H質(zhì)粒酶切鑒定Fig.6 Identification of plasmid pGEX-4T-1-GrG10H by enzyme digestions

M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)；1-2：1 mmol/L IPTG終濃度、37 ℃下空載體分別誘導(dǎo)0和6 h的總蛋白；3-6：相同條件下工程菌分別誘導(dǎo)0、2、4和6 h的總蛋白M: Protein standard; 1-2: The expressed product of empty vector induced by 1 mmol/L IPTG for 0 and 6 h at 37 ℃; 3-6: The expressed product of engineering bacteria induced by 1 mmol/L IPTG for 0, 2, 4 and 6 h at 37 ℃圖7 37 ℃下誘導(dǎo)時間對GrG10H表達量的影響Fig.7 Effect of induction time on the expression amount of GrG10H at 37 ℃

以根為參照，設(shè)定其中的表達量為1Root was the reference, and its expression was designated as 1圖8 滇龍膽GrG10H基因在不同組織中的相對表達Fig.8 Relative expression of GrG10H gene in different tissues in G. rigescens

2.5GrG10H在根莖葉中的表達分析

取3年生盆栽滇龍膽的根莖葉，通過qRT-PCR檢測GrG10H基因在根莖葉中的表達情況。結(jié)果顯示，GrG10H基因表達量最高的組織是葉，其表達量大約是根和莖中的2855和13倍；其次是莖，表達量最低的是根(圖8)。這與川西獐牙菜SmG10H基因在根莖葉中的表達模式非常類似[8]。這些結(jié)果暗示葉是龍膽苦苷生物合成的主要場所。然而，在長春花中，CrG10H基因主要在根和葉中表達[22]；在秦艽中，GmG10H基因則主要在花和根中表達。這可能是因為植物中G10H基因存在不同家族成員，而不同成員具有組織表達特異性所導(dǎo)致[11]。

3 討 論

龍膽苦苷是滇龍膽的主要藥效成分，屬于裂環(huán)烯醚萜類化合物，目前龍膽苦苷生物合成途徑還不清楚。研究表明，在環(huán)烯醚萜類生物合成中，香葉醇的氧化被認(rèn)為是第一個限速反應(yīng)步驟，而此反應(yīng)由香葉醇10-羥化酶催化[8]。早在1999年，Collu等人就發(fā)明了HPLC技術(shù)檢測G10H蛋白活性的方法[23]。本研究以作者實驗室所建立的滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，從滇龍膽幼葉中克隆到一條GrG10H基因，其編碼蛋白與川西樟牙菜SmG10H基因的同源性達86.26 %；系統(tǒng)發(fā)育分析中二者處于同一進化枝，且GrG10H蛋白具有CYP450結(jié)構(gòu)域，屬于CYP76B亞家族成員，這些結(jié)果表明所克隆的基因的確為G10H基因。

不同植物的G10H蛋白大小也有差異。Wang等從川西獐牙菜克隆的SmG10H基因，在大腸桿菌中表達后蛋白大小為55 500[8]，長春花的G10H蛋白大小為56 500，而本研究GrG10H基因表達后大小為57 740，原因是GrG10H蛋白比前兩者多出19個氨基酸(圖2)，這暗示著滇龍膽的GrG10H蛋白與這2種植物的G10H蛋白存在結(jié)構(gòu)或功能上的差異。

在滇龍膽中，不同組織器官的龍膽苦苷含量存在很大差別，以根的含量為最高[24]。前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，滇龍膽基因組中至少包含2個GrG10H基因。所以，探究GrG10H基因在根莖葉中的表達特異性對于闡明其參與的龍膽苦苷生物合成途徑具有重要意義。本研究中，GrG10H基因在根中表達量遠遠低于其在葉中的表達量，這預(yù)示著GrG10H基因主要在葉中參與萜類的生物合成。事實上，龍膽苦苷的主要累積部位是根[24]，這暗示著在滇龍膽中龍膽苦苷在葉中合成，然后在根中累積的過程。接下來需要對龍膽苦苷生物合成途徑晚期基因進行克隆和表達分析，以闡明龍膽苦苷的主要合成部位與具體途徑。

4 結(jié) 論

通過基因克隆方法獲得滇龍膽香葉醇10-羥化酶基因，該基因包含2個外顯子和1個內(nèi)含子，編碼515個氨基酸。GrG10H蛋白屬于細胞色素P450超家族成員，可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，能夠在大腸桿菌中表達。GrG10H基因主要在葉中表達。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Cloning and Expression Analysis of Geraniol10-hydroxylase Gene inGentianarigescens

ZHANG Xiao-dong1, LI Cai-xia1, LI Shuang1, LIU Qian-qian1, WANG Yuan-zhong2, WANG Jia-jin2*

(1.College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yunnan Yuxi 653100, China; 2.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

【Objective】The objective of this study is to clone gentian geraniol 10-hydroxylase geneGrG10H, to analyze its bioinformatics characters, gene structure, prokaryotic expression and tissue expression, and to provide a theoretical base for elucidation of getiopicroside biosynthesis pathway. 【Method】RT-PCR and gene cloning were adopted to isolate the geneGrG10Hfrom the leaves ofGentianarigescens. Bioinformatics tools were used to analyze the characters of both DNA sequence and its coding protein. Clustal X2.1 software was used to make the multiple sequence alignments between the GrG10H protein and their homologous sequences, and the phylogenetic tree of homologous species was constructed by MEGA6.0. The real-time fluorescent quantitative RT-PCR was applied to analyze the expression ofGrG10Hin root, stem and leaf. 【Result】GrG10Hgene was obtained fromG.rigescensleaves by RT-PCR, and was deposited into GenBank (accession number: KJ418410). The results of bioinformatics analysis showed thatGrG10Hgene had a length of 1834 bp containing two exons and one intron. Its ORF (open reading frame) was 1548 bp coding for 515 amino acids. Its relative molecular weight was 57.74 kD with the isoelectric point of 9.02. GrG10H protein was the member of cytochrome P450 superfamily and may localize in endoplasmic reticulum; there was a transmembrane region in N-terminal (21-43), while the first 20 amino acids resided within the membrane and that of 44-515 were out of membrane; GrG10H was a hydrophilic stable protein without signal peptide and composed of mainly α-helix (40.58%) and irregular coils (44.85%). GrG10H protein was close to SmG10H ofSwertiamussotii. The results of prokaryotic expression ofGrG10Hgene inE.colishowed that the recombinant protein was approximately 83.74 kD (containing GST tag protein 26.00 kD), which was consistent with the theoretical size. The tissue-specific expression results indicated thatGrG10Hgene was primarily expressed in leaf. 【Conclusion】GrG10Hgene was cloned and expressed inE.coli. successfully, and it may mainly functioned in leaves.

Gentianarigescens; Geraniol 10-hydroxylase; Gene cloning; Expression analysis

1001-4829(2017)7-1499-08

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.006

2015-06-08

云南省教育廳重點項目(2015Z171)；云南省大學(xué)生創(chuàng)新項目(201511390005)

張曉東(1980-)，男，博士，主要從事植物代謝基因工程研究，E-mail: zxd95@126.com。*為通訊作者：王家金(1963-)，男，主要從事藥用植物資源評價與利用研究，E-mail: 2354665275@qq.com。

Q786

A