盧國(guó)強(qiáng)盧海林潘學(xué)春張正鋒吉振勇王 云

（1. 鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司， 江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

辣椒品種鎮(zhèn)研2 2種子純度的S S R分子標(biāo)記鑒定

盧國(guó)強(qiáng)1盧海林1潘學(xué)春1張正鋒1吉振勇1王 云2

（1. 鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司， 江蘇鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

分子標(biāo)記技術(shù)因其具有高效、穩(wěn)定、可靠等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多地被應(yīng)用到種子純度鑒定中；而基于分子標(biāo)記的辣椒（Capsicum annuum L.）雜交種子純度快速檢測(cè)技術(shù)體系的建立對(duì)辣椒雜交品種的選育和生產(chǎn)則具有重要的意義。以辣椒雜交品系鎮(zhèn)研22及其兩親本為試驗(yàn)材料，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)辣椒雜交品種間的多態(tài)性進(jìn)行了引物篩選和種子純度鑒定研究。結(jié)果表明，從20對(duì)SSR引物中篩選出CAMS-327引物，在親本和雜交種中表現(xiàn)出穩(wěn)定的共顯性，并對(duì)鎮(zhèn)研22雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果為98%，與田間鑒定結(jié)果基本一致；SSR 標(biāo)記分析可實(shí)現(xiàn)對(duì)辣椒雜交品種種子純度的快速和準(zhǔn)確鑒定。

辣椒；種子；純度鑒定；SSR標(biāo)記

AbstractThe molecular marker technique has been applied to the identification of seed purity increasingly due to its advantages of being effcient, stable and reliable. DNA-based assessment of seed purity is one of the most important quality control components in hot pepper (Capsicum annuum L.) hybrid seed production. In this study, the seed genetic purity of hot pepper hybrid cultivar Zhenyan 22 was analyzed with SSR marker, genomic DNA from the Zhenyan 22 and its parental lines was screened with 20 pairs of SSR primers, from which one pair of primers CAMS-327 that could perform stable co-dominance in the parental lines and hybrids and produce both female and male parent specifc markers was selected for the genetic purity test, and a total of 45 hybrid individuals were analyzed with the identified primer. The results showed that the overall genetic purity of the hybrid seed Zhenyan 22 was at 98% which was relatively consistent with that of the feld test. The combination of DNA extraction and SSR marker analysis is a rapid and accurate method for the detection of hybrid hot pepper variety seed purity.

Key wordsCapsicum annuum L；seed；purity assessment；SSR marker

1 前言

辣椒 (Capsicum annuum L.)是我國(guó)主要的蔬菜作物之一。種子純度表示品種在特征特性方面典型一致性的程度，即樣品中待測(cè)品種種子數(shù)或株數(shù)占供檢樣品種子總粒數(shù)或總株數(shù)的百分比。純度鑒定是商業(yè)育種中不可或缺的重要步驟，是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)，是保證優(yōu)良品種增產(chǎn)潛力得以發(fā)揮的關(guān)鍵因素。在辣椒育種過(guò)程中，利用雜種優(yōu)勢(shì)選育品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高的雜交種，是一條行之有效的途徑。辣椒雜種一代絕大多數(shù)是通過(guò)人工去雄授粉而來(lái)，由于辣椒花期長(zhǎng)且多次開(kāi)花，難免會(huì)造成自花授粉而產(chǎn)生偽雜種，因此，為保證優(yōu)良品種增產(chǎn)潛力得以發(fā)揮，雜種純度鑒定尤其重要。

傳統(tǒng)的種子純度鑒定主要依賴于田間植物形態(tài)學(xué)或同工酶等來(lái)判斷，其生產(chǎn)周期長(zhǎng)，用地多，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工且易受環(huán)境因素影響，準(zhǔn)確性難以保證。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的問(wèn)世及迅速發(fā)展，使得從基因組水平上檢測(cè)雜交種純度成為可能[1,2]。在利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建辣椒指紋圖譜及雜交種純度鑒定方面，已經(jīng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用有RAPD、SRAP、AFLP和SSR等分子標(biāo)記[3-5]。其中，SSR標(biāo)記因具有操作簡(jiǎn)單、數(shù)量豐富、在染色體上均勻分布、共顯性遺傳、穩(wěn)定性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，因而在辣椒[6]、蘿卜[7]、黃瓜[8]、茄子[9]、西瓜[10]等多個(gè)蔬菜作物品種純度鑒定中得到廣泛應(yīng)用。

本研究以鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司選育的辣椒品種鎮(zhèn)研22及其親本為試驗(yàn)材料，利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定研究，篩選出雙親互補(bǔ)，特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的SSR 引物，并以該譜帶作為分子標(biāo)記對(duì)其辣椒種子純度進(jìn)行鑒定，建立準(zhǔn)確快速的辣椒雜交種種子純度的鑒定方法，為辣椒種子純度分析及雜交育種和生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

試驗(yàn)所用的鎮(zhèn)研22及其父母本均由鎮(zhèn)江市鎮(zhèn)研種業(yè)有限公司提供。將F1代和父母本種子置于30℃條件下催芽3 d后，播種到含草炭基質(zhì)的育苗盤中進(jìn)行育苗，溫室培養(yǎng)至6片真葉時(shí)取樣本葉片提取DNA。

2.2 DNA的提取

DNA的提取采用CTAB法[11]。辣椒葉片于研缽中磨碎后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，加入DNA 提取緩沖液（1% CTAB、0.7 M NaCl、10 mM EDTA、20 mM β-巰基乙醇），將混合液置于65℃振蕩水浴90 min，冷卻后加入等體積氯仿/異戊醇溶液，兩者體積比為24∶1，混勻、5 000 g 離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一滅菌離心管中，加入1倍體積異丙醇，混勻，5 000 g離心10 min，去上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，雙蒸水溶解。DNA經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后，于4℃下保存?zhèn)溆没蛴?20℃下長(zhǎng)期保存。

2.3 SSR擴(kuò)增與檢測(cè)

引物設(shè)計(jì)參照Minamiyama 等[12]發(fā)表的106對(duì)SSR引物序列，隨機(jī)合成20對(duì)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR采用20 μL體系，包含40～ 50 ng 模板DNA，3.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.25 μmol/L引物，1 U Taq酶。SRAP擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染顯色。

3 結(jié)果與分析

3.1 辣椒葉片基因組DNA的提取與檢測(cè)

用改良CTAB法提取辣椒葉片基因組DNA，A260 nm /A280 nm z的比值在1.8 ～ 2.0 之間，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示無(wú)明顯DNA降解、質(zhì)量良好（圖1），能夠滿足SSR檢測(cè)的要求。

圖1 辣椒基因組DNA的凝膠電泳檢測(cè)

3.2 特征引物的篩選

本研究利用20對(duì)SSR引物分別對(duì)辣椒品種鎮(zhèn)研22父母本進(jìn)行多態(tài)性篩選，其中CAMS-327引物在鎮(zhèn)研22父母本中能擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的特異性互補(bǔ)條帶，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。因此，本研究選取這對(duì)引物用于鎮(zhèn)研22的種子純度鑒定。

3.3 雜種純度的鑒定

隨機(jī)選取45粒鎮(zhèn)研22辣椒種子，育成幼苗后提取DNA，并以CAMS-327為引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，檢測(cè)辣椒種子的純度。檢測(cè)結(jié)果表明：鎮(zhèn)研22種子中有1株呈現(xiàn)出母本特征譜帶，44株呈現(xiàn)雜交一代特征譜帶，雜交種子純度為98%（圖3）。通過(guò)大田種植，根據(jù)植株表型鑒定，在200株鎮(zhèn)研22群體中，有6 株表型表現(xiàn)與親本一致，田間鑒定種子純度為97%，與分子標(biāo)記鑒定結(jié)果基本一致。

圖2 引物CAMS-327對(duì)鎮(zhèn)研22及其親本的擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

目前辣椒雜交種純度主要的鑒定方法有田間形態(tài)學(xué)鑒定法和生化檢測(cè)法等。形態(tài)學(xué)鑒定法易受環(huán)境條件的限制，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，鑒定的準(zhǔn)確性也受觀察者經(jīng)驗(yàn)的制約；生化檢測(cè)技術(shù)操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)事費(fèi)錢，都不能滿足種子純度鑒定和育種工作發(fā)展的需要。分子標(biāo)記技術(shù)因其準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、不受基因表達(dá)和環(huán)境因素影響，且不受器官、組織及發(fā)育特異性等限制，已逐步成為作物雜交種純度檢測(cè)的主要工具。SSR 標(biāo)記數(shù)量豐富，在植物基因組上均衡分布，共顯性遺傳，穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，是進(jìn)行作物雜交種純度鑒定理想的標(biāo)記類型。本研究利用SSR 標(biāo)記檢測(cè)鎮(zhèn)研22雜交種純度，其結(jié)果鎮(zhèn)研22雜交種純度為98%，分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本一致，雜交種中混雜了母本自交種， 可能是由于去雄不徹底導(dǎo)致的母本自交種。該結(jié)果說(shuō)明本試驗(yàn)建立的SSR 技術(shù)體系可用于辣椒雜交種純度的快速檢測(cè)。

圖3 CAMS-327在鎮(zhèn)研22單株及親本中的擴(kuò)增結(jié)果

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Genetic Purity Assessment of Hybrid Variety Zhenyan 22 with SSR Markers in Hot Pepper

LU Guoqiang1LU Hailin1PAN Xuechun1ZHANG Zhengfeng1JI Zhenyong1WANG Yun2
（1. Zhenjiang Zhenyan Seeds Co., Ltd., Zhenjiang 212013, China; 2. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China）

2017-06-19

鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科技支撐計(jì)劃（NY2015014）

盧國(guó)強(qiáng)（1975-），男，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事辣椒新品種的選育及推廣工作；Tel：13914555188；E-mail：zy.seed@163.com