古麗巴哈爾·托乎提，李海芳，顧金花，楊玲玲，張明君，李小燕，哈麗旦·蘇來曼

(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所藥理與微生物檢驗室，新疆 烏魯木齊 830002)

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10種維吾爾藥微生物限度檢查方法及探討

古麗巴哈爾·托乎提*，李海芳，顧金花，楊玲玲，張明君，李小燕，哈麗旦·蘇來曼

(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所藥理與微生物檢驗室，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：建立10種維吾爾藥的微生物限度檢查方法。方法：對10種維吾爾藥進行需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的適用性試驗及控制菌檢查方法的適用性試驗。結(jié)果：需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的適用性試驗中，按平皿法，供試液制備為1∶10時，依提爾菲力艾皮提蒙蜜膏、復(fù)方沙拉吉提丸、開胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提爾菲力吾斯提庫都斯蜜膏、復(fù)方蘇拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏的回收比在0.5～2范圍內(nèi)，無明顯抑菌現(xiàn)象；而再爾吾尼蜜膏、羅補甫艾斯熱蜜膏對枯草芽孢桿菌，加瓦日西安比爾蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑菌作用，但可通過制成1∶100的供試液按平皿法消除抑菌作用。采用直接接種法進行10種維吾爾藥的控制菌檢查，菌株正常生長，10種維吾爾藥對上述細菌無抑制作用。結(jié)論：依提爾菲力艾皮提蒙蜜膏、復(fù)方沙拉吉提丸、開胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提爾菲力吾斯提庫都斯蜜膏、復(fù)方蘇拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏可通過制備為1∶10的供試液、采用平皿法檢驗需氧菌；再爾吾尼蜜膏、羅補甫艾斯熱蜜膏、加瓦日西安比爾蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏可通過制備為1∶100的供試液、采用平皿法檢驗需氧菌；10種維吾爾藥均可通過制備為1∶10的供試液、采用平皿法檢驗霉菌和酵母菌；10種維吾爾藥均可采用直接接種法檢查控制菌。

維吾爾藥； 微生物限度； 方法適用性； 回收比

口服制劑的微生物污染狀況是其質(zhì)量控制的重要指標[1-3]。微生物限度是口服制劑的必檢項目，維吾爾藥制劑為含有多種維吾爾藥材及中藥材成分的復(fù)方制劑[4]，可能存在一定抑菌活性。故在對具有抗菌活性的藥品進行微生物限度檢查時，應(yīng)首先消除其抗菌活性，以保證檢驗結(jié)果的真實性、有效性[5-6]。由于原料來源、生產(chǎn)工藝、輔料等的不同，導(dǎo)致同一產(chǎn)品但不同廠家、甚至同一廠家但不同批次的藥品對同一種微生物的抑制程度不同[7]。參考《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)，建立10種維吾爾藥的微生物限度檢查方法，為檢驗機構(gòu)提供參考，并進一步提高產(chǎn)品質(zhì)量，防止微生物污染。

1 材料

1.1 儀器

DHP120型細菌培養(yǎng)箱(上海市實驗儀器總廠)；QS-PY150型智能型生化培養(yǎng)箱(上海奇珊電子科技有限公司)；SL601 N型電子天平(上海民橋精密科學儀器公司)；ZDX-35BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海富駿機械制造有限公司)；MS3圓周振蕩器(德國艾卡集團)。

1.2 藥品

加瓦日西安比爾蜜膏(批號：20150802、20141103、20150401)；再爾吾尼蜜膏(批號：20151103、20150802、20150401)；依提爾菲力艾皮提蒙蜜膏(批號：20151203、20150802、20150401)；羅補甫艾斯熱蜜膏(批號：20151203、20150702、20150301)；復(fù)方沙拉吉提丸(批號：20151103、20150602、20150301)；開胃加瓦日西阿米勒蜜膏(批號：20150301、20150702、20151203)；依提爾菲力吾斯提庫都斯蜜膏(批號：20150501、20150902、20151203)；加瓦日西卡尼沙蜜膏(批號：20151203、20150401、20150301)復(fù)方蘇拉甫蜜膏(批號：20151203、20150602、20150401)；穆派日克力甫蜜膏(批號：20151101、20151102、20151203)；以上藥品均由新疆和田民豐縣維吾爾醫(yī)醫(yī)院生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂(批號：20151030)；沙氏葡萄糖瓊脂(批號：20151030)；胰酪大豆胨液體(批號：20151029)；腸道菌增菌液體(批號：20150902)；紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂(批號：20150831)；沙氏葡萄糖液體(批號：2015092)；麥康凱液體(批號：20151026)；麥康凱瓊脂(批號：20150823)；RV沙門菌增菌液體(批號：20150902)；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂(批號：20130702)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：20150813)；以上培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品檢定研究院提供。

1.4 菌種

枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌、沙門菌均由中國食品藥品檢定研究院菌種保藏中心提供。

2 方法

2.1 菌液的制備

2.1.1 金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌菌懸液：取經(jīng)33 ℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)≤10 000 cfu/ml的菌懸液，即得。

2.1.2 大腸埃希菌、沙門菌菌懸液：取經(jīng)33 ℃培養(yǎng)18～24 h的大腸埃希菌、沙門菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)≤100 cfu/ml的菌懸液，即得。

2.1.3 白色念珠菌菌懸液：取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)物，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)≤10 000 cfu/ml的菌懸液，即得。

2.1.4 黑曲霉孢子懸液：取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)5～7 d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液3～5 ml洗下孢子，吸出孢子懸液，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無菌氯化鈉溶液制成含菌數(shù)≤10 000 cfu/ml的孢子懸液[1-2]。

2.2 需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法適用性試驗

2.2.1 供試液的制備：取樣品10 g，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1∶10的供試液，或加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進一步稀釋成1∶100的供試液[2]。

2.2.2 菌液組菌落數(shù)計算：取“2.1.1”“2.1.3”“2.1.4”項下菌液各0.1 ml(菌落數(shù)為3 000～10 000 cfu/ml)，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml中，取混合液1 ml注入平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，測定菌液中的菌落數(shù)，結(jié)果記為a。

2.2.3 對照組菌落數(shù)計算：取“2.2.1”項下供試液1 ml，注入平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，測定樣品中的菌落數(shù)，結(jié)果記為b。

2.2.4 驗證組菌落數(shù)計算：取“2.1.1”“2.1.3”“2.1.4”項下菌液各0.1 ml(菌落數(shù)為3 000～10 000 cfu/ml)，加至“2.2.1”項下供試液10 ml中，取混合液1 ml注入平皿，加入胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，測定菌液中的菌落數(shù)，結(jié)果記為c。

2.2.5 回收比的計算：“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項下胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板在33 ℃培養(yǎng)3～5 d，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在23 ℃培養(yǎng)5～7 d后計數(shù)。回收比R=(c-b)/a。根據(jù)《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)，當0.5≤R≤2，則可認為該計數(shù)方法可用于樣品的菌落計數(shù)。

2.3 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗

2.3.1 供試液的制備：取樣品10 g，加入pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1∶10的供試液，或加pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液進一步稀釋成1∶100的供試液[2]。

2.3.2 培養(yǎng)物的制備：取“2.3.1”項下供試液10 ml，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，即為供試品組。取pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液10 ml，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，即為陰性對照組。取“2.3.1”項下供試液10 ml，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，加入“2.1.2”項下大腸埃希菌菌懸液(菌落數(shù)10～100 cfu)，即為陽性驗證組。

2.3.3 適用性試驗：將“2.3.2”項下培養(yǎng)物于33 ℃培養(yǎng)24 h，再分別取培養(yǎng)物1 ml，接種至100 ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，于42 ℃培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)物劃線于麥康凱瓊脂平板上，于33 ℃培養(yǎng)24 h。若陽性驗證組檢出大腸埃希菌，可認為該方法適用于樣品的大腸埃希菌檢查。

2.4 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法適用性試驗

2.4.1 供試液的制備：取樣品10 g，加胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基至100 ml，勻漿，制成1∶10的供試液。

2.4.2 培養(yǎng)物的制備：取“2.4.1”項下供試液10 ml，即得供試品組。取胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基10 ml，即為陰性對照組。取2份“2.4.1”項下供試液10 ml，分別加入“2.1.1”、“2.1.2”項下大腸埃希菌菌懸液和銅綠假單胞菌菌懸液(菌落數(shù)10～100 cfu)，即為陽性驗證組。

2.4.3 適用性試驗：將“2.4.2”項下培養(yǎng)物于23 ℃培養(yǎng)2 h，再分別取培養(yǎng)物10 ml接種至100 ml腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，于33 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)物劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，于33 ℃培養(yǎng)24 h。若陽性驗證組檢出大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，可認為該方法適用于樣品的耐膽鹽革蘭陰性菌檢查。

2.5 沙門菌檢查方法適用性試驗

2.5.1 供試液的制備：取樣品10 g，加胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基至200 ml，即得。

2.5.2 培養(yǎng)物的制備：取“2.5.1”項下供試液200 ml，即為供試品組。取胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基200 ml，即為陰性對照組。取“2.5.1”項下供試液200 ml，加入“2.1.2”項下沙門菌菌懸液(菌落數(shù)10～100 cfu)，即為陽性驗證組。

2.5.3 適用性試驗：將“2.5.2”項下培養(yǎng)物于33 ℃培養(yǎng)24 h。分別取培養(yǎng)物0.1 ml接種至10 ml RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，于33 ℃培養(yǎng)24 h。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物，劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上，于33 ℃培養(yǎng)24 h。若驗證組檢出沙門菌，可認為該方法適用于樣品的沙門菌檢查。

3 結(jié)果

3.1 供試液濃度為1∶10時需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比

供試液為1∶10時，對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，依提爾菲力艾皮提蒙蜜膏、復(fù)方沙拉吉提丸、開胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提爾菲力吾斯提庫都斯蜜膏、復(fù)方蘇拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏的回收比在0.5～2范圍內(nèi)，無明顯抑菌現(xiàn)象；而再爾吾尼蜜膏、羅補甫艾斯熱蜜膏對枯草芽孢桿菌，加瓦日西安比爾蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑菌作用，見表1。

表1 10種維吾爾藥對需氧菌、霉菌和酵母菌的回收比(供試液濃度為1∶10)

注：*表示所得數(shù)據(jù)為胰酪大豆胨瓊脂和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的回收比

Note：*indicates the obtained data are recovery ratio of TSA and SDA on culture medium

3.2 供試液濃度為1∶100時需氧菌的回收比

供試液濃度為1∶100時，對于金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌，再爾吾尼蜜膏、羅補甫艾斯熱蜜膏、加瓦日西安比爾蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏的回收比均>0.5，可用于4種維吾爾藥的需氧菌總數(shù)檢測，見表2。

表2 4種維吾爾藥對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收比(供試液濃度為1∶100)Tab 2 Recovery ratio of ten kinds of Uighur drugs to staphylococcus aureus and bacillus subtilis (1∶100 sample)

注：“—”表示1∶10供試液已通過回收率試驗

Note：“—” indicates the 1∶10 sample passing the recovery test

3.3 10種維吾爾藥對控制菌的檢驗結(jié)果

10種維吾爾藥對控制菌無抑制作用，見表3。

4 討論

自《中華人民共和國藥典》(2005年版)[8]出現(xiàn)，微生物限度檢查開始引入方法驗證試驗。而由于《中華人民共和國藥典》(2015年版)培養(yǎng)體系的變化，微生物限度檢查方法將需要再次驗證。與2010年版相比，《中華人民共和國藥典》(2015年版)增加了供試品制備中的稀釋液種類，采用胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基取代了營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于需氧菌總數(shù)檢查，采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基取代了玫瑰紅鈉培養(yǎng)基檢測霉菌與酵母菌總數(shù)；將原來的細菌總數(shù)檢查更名為需氧菌總數(shù)檢查，這其中就包括了細菌、霉菌、真菌等可在此培養(yǎng)基上生長的所有需氧微生物；2010年版所使用的培養(yǎng)基對目標菌的選擇性強，不能滿足所有微生物的生長需要[9]，而2015年版所使用的培養(yǎng)基具有良好的廣譜性，對目標微生物生長選擇性低，有利于微生物的修復(fù)與生長，提高檢出率，且在控制菌檢查上增加了耐膽鹽革蘭陰性菌檢查，簡化了大腸埃希菌的檢驗方法，變更了乙型副傷寒沙門菌的培養(yǎng)基種類，取消了大腸菌群的檢查。

表3 10種維吾爾藥對控制菌的檢驗結(jié)果Tab 3 Result of ten kinds of Uighur drugs to control bacteria

注：“+”表示菌株正常生長

Note：“+” indicates strains with normal growth

制劑質(zhì)量標準檢查項目中的微生物限度檢查是保障藥品使用安全的重要指標之一[10-11]。適用性試驗確認了供試品在所采用的檢查方法和檢驗條件下有無抑菌作用，以保證供試品所污染的微生物能被充分檢出。維吾爾藥通常成分復(fù)雜，含有維吾爾藥和中藥成分。其中，中藥藥源廣泛，成分多樣，可直接抗菌[12-13]，有些成分會抑制需氧菌，有些成分會抑制真菌，故中藥材真菌及真菌毒素污染現(xiàn)象普遍[14]，任何具有抑菌作用的成分均可影響微生物限度檢查的準確性。中藥制劑微生物污染的限度是中藥制劑臨床應(yīng)用是否安全有效的一項重要參數(shù)，中藥制劑微生物限度必須符合《中華人民共和國藥典》(2015年版)的要求[1-2，15]。與中藥制劑相同，維吾爾藥也必須針對其微生物污染的因素，采取積極的對策進行預(yù)防。本研究以《中華人民共和國藥典》(2015年版)微生物限度檢查方法適用性作為依據(jù)，確定了上述10種維吾爾藥微生物限度檢查的方法。

上述10種維吾爾藥制劑微生物限度標準為：需氧菌總數(shù)104cfu/g；霉菌和酵母菌總數(shù)102cfu/g；不得檢出大腸埃希菌(1 g)；不得檢出沙門菌(10 g)；耐膽鹽革蘭陰性菌應(yīng)<102cfu/g。本研究結(jié)果表明，需氧菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法的適用性試驗中，可按平皿法、且供試液為1∶10檢驗的是依提爾菲力艾皮提蒙蜜膏、復(fù)方沙拉吉提丸、開胃加瓦日西阿米勒蜜膏、依提爾菲力吾斯提庫都斯蜜膏、復(fù)方蘇拉甫蜜膏、穆派日克力甫蜜膏；而需氧菌總數(shù)可按平皿法、且供試液為1∶100檢驗的是再爾吾尼蜜膏、羅補甫艾斯熱蜜膏、加瓦日西安比爾蜜膏、加瓦日西卡尼沙蜜膏。10種維吾爾藥的控制菌控制菌檢查可根據(jù)直接接種法進行。

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Investigation of Microorganism Limited Inspecting Method on Ten Kinds of Uighur Drugs

Gulibaha’er·TUOHUTI, LI Haifang, GU Jinhua, YANG Lingling, ZHANG Mingjun, LI Xiaoyan, Halitan·SULAIMAN

(Laboratory of Pharmacology and Microbiology, Xinjiang Uygur Autonomous Region for Food and Drug Inspection Institute, Xinjiang Urumqi 830002,China)

OBJECTIVE: To establish the microorganism limited inspecting method on ten kinds of Uighur drugs. METHODS: Adaptability tests of aerobic bacteria, mold and yeast count methods and control bacteria examination methods were conducted on ten kinds of Uighur drugs. RESULTS: According to adaptability test of aerobic bacteria, mold and yeast count methods, there was no significant bacteriostatic phenomenon for Yiti’erfeili’ aipitimengmigao, Compound shalajitiwan, Kaiweijiawarixi’amilemigao, Yiti’erfeiliwusitikudusimigao, Compound sulafumigao and Mupair-ikelifumigao within recovery ratio of 0.5-2 when the examine probational liquid of 1∶10. However, the Zai’erwunimigao, Luobufu’aisiremigao have different inhibitory effects on bacillus subtilis, while Jiawarixi’anbi’ermigao, Jiawarixikanishamigao have different inhibitory effects on bacillus subtilis staphylococcus aureus,which could be eliminated by the examine probational liquid of 1∶100. Direct inoculation method was adopted to examine control bacteria of ten kinds of Uighur drugs, strains were in normal growth, and ten kinds of Uighur drugs had no inhibition. CONCLUSIONS: Yiti’erfeili’aipitimengmigao, Compound shalajitiwan, Kaiweijiawarixi’amilemigao, Yiti’erfeiliwu-sitikudusimigao, Compound sulafumigao and Mupairikeli-fumigao can detect aerobic bacteria through preparation of the examine probational liquid of 1∶10 and plate method. And Zai’erwunimigao, Luobufu’aisiremigao, Jiawarixi’anbi’ermigao, Jiawarixikanishamigao can detect aerobic bacteria through preparation of the examine probational liquid of 1∶100 and plate method. Ten kinds of Uighur drugs can detect molds and yeast through preparation of the examine probational liquid of 1∶10 and plate method; ten kinds of Uighur drugs can detect the control bacteria by direct inoculation method.

Uyghur drugs; Microbial limit; Method validation; Recovery ratio

R927.1

A

1672-2124(2017)07-0940-04

2017-03-07)

*高級實驗師。研究方向：微生物檢驗。E-mail：gulbahartohti@sina.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.07.028