劉威 尹鵬 王子浩 葉乃興
摘要:從福建省不同地區(qū)茶樹(shù)及其他木本植物上分離獲得38株炭疽病菌,采用rDNA-ITS序列分析方法對(duì)供試菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和種群分化研究。結(jié)果表明,炭疽菌不同種群遺傳多樣性豐富且存在遺傳差異,供試不同寄主來(lái)源炭疽病病菌在rDNA-ITS基因序列上存在一定的特異性,但不明顯。供試炭疽病病菌存在一定的寄主?;裕痪哂械乩韥?lái)源特異性。序列比較結(jié)果顯示,菌株間的ITS序列同源性較高,但仍存在多種不同類型的堿基變異,包括堿基的缺失、突變、插入等。
關(guān)鍵詞:茶樹(shù);木本植物;炭疽病菌;遺傳多樣性;ITS序列分析
中圖分類號(hào): S435.711文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號(hào):1002-1302(2017)11-0042-03[HS)][HT9.SS]
炭疽病是刺盤(pán)孢屬真菌(Colletotrichum Corda)侵染植物引起的病害,種類繁多,寄主范圍廣泛,有記錄的寄主植物種類至少有176屬190種,包括果樹(shù)、林木、蔬菜、牧草、花卉等[1],且不同種類的炭疽菌生物學(xué)、生理學(xué)特性多存在差異。炭疽病病菌侵染茶樹(shù),引起茶樹(shù)感染炭疽病,該病的發(fā)生可影響茶樹(shù)的生長(zhǎng),降低茶葉的產(chǎn)量與品質(zhì)[2]。炭疽病病菌種間、種內(nèi)存在較多變異,甚至不同寄主之間也會(huì)存在一定的遺傳多樣性,這些遺傳變化影響炭疽病病菌的侵染特性、寄主選擇性、致病力、生物學(xué)特性,及對(duì)茶樹(shù)炭疽病的防治效果。為深入了解炭疽病病菌的遺傳多樣性特征,rDNA-ITS序列分析、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析等多種分子標(biāo)記技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用[3-4]。
絕大多數(shù)真菌rDNA-ITS區(qū)域基因序列具有廣泛的多態(tài)性,多數(shù)表現(xiàn)為種內(nèi)基因序列相對(duì)一致,而種間差異明顯的特點(diǎn)[5]。鑒于rDNA-ITS序列片段長(zhǎng)度小且易于分析的特點(diǎn),可以從其序列差異中得到足夠的信息用于種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育分析,現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用在真菌性病害的分類鑒定和病害診斷中[6-8]。本研究通過(guò)分析從福建省不同地區(qū)寄主為茶樹(shù)或其他木本植物上分離獲得的炭疽菌rDNA-ITS區(qū)域序列異同,探討福建省不同寄主來(lái)源炭疽病病菌以及不同地區(qū)茶樹(shù)炭疽菌的遺傳多樣性,將對(duì)今后炭疽病的防治工作提供參考。
1材料與方法
1.1供試菌株[HT]
從福建省茶樹(shù)上采集炭疽病病菌標(biāo)本,經(jīng)單孢分離獲得25株病原菌菌株,寄主為非茶樹(shù)木本植物的13株炭疽病菌菌株由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供,組成供試38株不同采集地區(qū)、不同寄主植物的炭疽病病菌標(biāo)本,菌株編號(hào)、種名、寄主植物、拉丁學(xué)名、采集地、GenBank登錄號(hào)等信息如表1所示。38株菌株均用馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)平板培養(yǎng)基保存于4~8 ℃冰箱中備用。
用真菌rDNA-ITS通用引物[JP3]ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[JP]對(duì)供試38株菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。試驗(yàn)PCR反應(yīng)的體系及其組成成分:5 ng模板DNA、1 μL上游引物、1 μL下游引物、5 μL PCR緩沖液、0.5 μL DNA聚合酶、4 μL dNTPs。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 52 s、56 ℃ 55 s、72 ℃ 60 s,共循環(huán)30次;71.5 ℃延伸11 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,用微量移液器吸取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)其含量,切取電泳條帶經(jīng)純化后送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。
1.2茶樹(shù)等炭疽菌遺傳多樣性分析
將供試38株炭疽病菌菌株的ITS基因序列用MEGA 6.0軟件的鄰結(jié)法(Neighbor-Joining,簡(jiǎn)稱NJ)構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),以自展法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),循環(huán)1 000次。采用軟件DNAMAN 6.0計(jì)算各菌株變異位點(diǎn)和堿基含量,并選用Kimura 2-parameter計(jì)算菌株間的遺傳距離。對(duì)供試的38株植物炭疽病病菌rDNA-ITS基因序列進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)分析,比較茶樹(shù)炭疽菌與其他木本植物炭疽菌的序列差異。
2結(jié)果分析
2.1rDNA-ITS區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果
利用通用引物ITS1、ITS4對(duì)38株供試炭疽菌菌株的 rDNA-ITS 區(qū)域擴(kuò)增,均能擴(kuò)增獲得1條特異性條帶,序列大小約為580 bp。擴(kuò)增的部分結(jié)果如圖1所示。
2.2遺傳多樣性分析
由圖2可知,在遺傳距離約為0.02處,38株炭疽病病菌菌株的進(jìn)化樹(shù)可分為3個(gè)類群,分別是Q1、Q2、Q3,其自檢支持率分別為98%、99%、99%;其中Q1群中包含的菌株最多,[FL)]
共26株,超過(guò)菌株總數(shù)的68%,其中有19個(gè)茶樹(shù)炭疽菌,7個(gè)其他木本植物炭疽菌。把Q1群可以再分為3個(gè)小群,分別為F1、F2、F3,F(xiàn)1、F2中菌株的寄主全為茶樹(shù),F(xiàn)3中菌株的寄主則全為其他木本植物;Q2群中3個(gè)菌株也可以分為2類,其中AMX、RFS為一類,寄主為茶樹(shù),YW寄主為魚(yú)尾葵,是非茶木本植物;Q3也可以再分為3個(gè)分支,分別為F4、F5、F6,F(xiàn)6中菌株的寄主全部為茶樹(shù),F(xiàn)4、F5中菌株的寄主全部為非茶樹(shù)木本植物。從整個(gè)聚類樹(shù)來(lái)看,HQ與F1較近,且Q1、Q2、Q3中菌株寄主既有茶樹(shù)又有非茶木本植物,這說(shuō)明供試炭疽菌存在一定的寄主專化性,但不具有嚴(yán)格的寄主專化性。在F1群中,菌株RTG與其余菌株存在較大的遺傳差異;在F2群中,ZRG與其余菌株存在較大的遺傳差異。
2.3供試植物炭疽菌rDNA-ITS序列差異比較
38株炭疽病病菌菌株的T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.6%、23.4%、27.5%、25.5%,寄主為茶樹(shù)的炭疽菌T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.8%、23.5%、27.1%、25.6%,其他木本植物T、A、C、G堿基出現(xiàn)的平均概率分別為23.1%、23.3%、28.2%、25.4%,由此可以看出,寄主為茶樹(shù)與其他木本植物炭疽菌的各堿基出概率差別不明顯。各菌株rDNA基因存在一些堿基差異,以T堿基為例,出現(xiàn)的概率為21.9%~25.2%,茶樹(shù)與其他木本植物病原菌沒(méi)有明顯差異。25株寄主為茶樹(shù)的菌株基因序列長(zhǎng)度為507~527 bp,其他木本植物基因序列長(zhǎng)度為506~526 bp,兩者差別[CM(25]不大。供試菌株rDNA-ITS序列長(zhǎng)度多樣性不豐富。采[CM)]
用MEGA 5.1計(jì)算38株炭疽病病菌菌株之間的遺傳距離,發(fā)現(xiàn)全部菌株的平均遺傳距離約為0.046,說(shuō)明各菌株間的遺傳距離較小,其中最大遺傳距離為0.119,最小遺傳距離為0。
多基因序列比對(duì)的部分結(jié)果如圖3所示,堿基的變異多出現(xiàn)在ITS1區(qū),炭疽菌種間與種內(nèi)均存在豐富的遺傳多樣性,比較38株供試菌株ITS序列,發(fā)現(xiàn)侵染茶樹(shù)的炭疽病病菌在第5 bp基因位點(diǎn)上均比侵染其他木本植物的炭疽病病菌多1個(gè)A堿基(圖3中箭頭所指位置),這可能與病原菌與寄主長(zhǎng)期互作有關(guān)系。
3結(jié)論與討論
研究表明,以基因序列為基礎(chǔ)的核酸分析技術(shù)來(lái)評(píng)價(jià)物種之間的親緣關(guān)系是可行的,rDNA基因區(qū)域中18S與28S區(qū)域相對(duì)保守,屬內(nèi)差別不大,可用于屬的分類鑒定,ITS區(qū)域序列多樣性豐富,被普遍應(yīng)用于真菌種的鑒定中[10]。
本研究通過(guò)擴(kuò)增供試38株炭疽病病菌的rDNA-ITS序列,并對(duì)其基因序列進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)供試菌株之間存在豐富的堿基序列差異,序列比較結(jié)果表明,菌株間的ITS序列同源性較高,但仍存在多種不同類型的堿基及序列變異,包括堿基的缺失、突變、插入等,這與ITS區(qū)段為非結(jié)構(gòu)基因、進(jìn)化速度比結(jié)構(gòu)基因快有關(guān)[11]。與其他木本植物炭疽菌相比,茶樹(shù)炭疽菌在5 bp基因位點(diǎn)上存在特異的堿基A,這一堿基變異可能與炭疽病病菌適應(yīng)寄主茶樹(shù)有關(guān),還需擴(kuò)大供試其他木本植物范圍進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步研究該變異與病原菌侵染性的關(guān)系。ITS序列的變異雖不一定是造成炭疽菌能侵染茶樹(shù)的原因,但這些變異可能使病原菌更易侵染茶樹(shù)或者在茶樹(shù)體內(nèi)更好地生長(zhǎng)。此外,還需對(duì)與病原菌侵染寄主直接相關(guān)的基因進(jìn)行研究,以便更好地了解炭疽病病菌侵染茶樹(shù)的內(nèi)在機(jī)制。
遺傳多樣性檢測(cè)分析結(jié)果表明,供試茶樹(shù)炭疽菌rDNA-ITS[CM(21*3]基因序列與其他植物炭疽菌存在一定的特異性,[CM)]
但特異性不明顯。同一采集地區(qū)的供試菌株在聚類圖上沒(méi)有相似性,說(shuō)明供試菌株在福建省內(nèi)沒(méi)有地理來(lái)源特異性。
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