李修平 馬文東 常瑋

摘要[目的]明確寒地水稻紋枯病抗性鑒定的調(diào)查指標(biāo)及鑒定時(shí)期。[方法]利用苗期鑒定法和成株期牙簽嵌入法分別于分蘗末期和抽穗期進(jìn)行接種，并在苗期采用單株病情指數(shù)，成株期采用病級、相對病斑長度、病斑長度和絕對病斑高度為調(diào)查指標(biāo)，進(jìn)行抗性鑒定。[結(jié)果]分蘗末期接種的3次調(diào)查中，病級、絕對病斑高度與抽穗期第3次調(diào)查的絕對病斑長度和病級的灰色關(guān)聯(lián)度呈上升趨勢，且分蘗末期接種的第3次調(diào)查中這2個(gè)指標(biāo)與對照指標(biāo)的灰色相關(guān)度分別為0.891 2、0.888 6和0.911 1、0.903 0。這2個(gè)指標(biāo)可作為抗性鑒定重要參考指標(biāo)。苗期鑒定的單株病情指數(shù)與2個(gè)對照指標(biāo)的灰色相關(guān)度分別為0.746 1和0.787 9，表明苗期鑒定的調(diào)查指標(biāo)與成株期鑒定的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。[結(jié)論]成株期牙簽嵌入法在分蘗末期和抽穗期接種，接種后第36天調(diào)查的病級和絕對病斑高度可作為抗性鑒定和遺傳分析的重要指標(biāo)。苗期鑒定的單株病級指數(shù)與成株期鑒定結(jié)果具有一定的灰色關(guān)聯(lián)度。

關(guān)鍵詞 寒地水稻；紋枯??；抗性鑒定指標(biāo)；灰色關(guān)聯(lián)分析

中圖分類號 S435.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）03-0174-03

Abstract[Objective] The purpose of this study was to clear scientific and reliable investigation index and identification period for rice sheath blight resistance identification in cold region. [Method] The resistance identification was carried out in seedling stage and adult plant stage， toothpick embedding method was used in adult plant identification in the stage of late tillering stage and heading stage； the investigation indexes were seedling disease index in seedling stage and disease rank， absolute disease height， relative disease length and disease length in adult plant stage.[Result] The three investigation which were inoculated at late tillering stage， the grey correlation among disease rank， absolute disease height， relative disease length and disease length with absolute disease height， disease rank which were investigated in the third investigation at heading stage inoculation were increased， and the grey correlation in the third investigation with the check index were 0.891 2， 0.888 6 and 0.911 1， 0.903 0 respectively. And the two indexes could be used as important indexes for resistance identification. The grey correlation among the seeding disease index at seeding identification with two check indexes were 0.746 1 and 0.787 9 respectively， which showed that the investigation index in seeding identification was associated with that of adult plant stage.[Conclusion] The disease rank and absolute disease height of thirtysixth days after inoculation in adult plant identification could be used as important indexes for resistance identification and genetic analysis. There was a certain degree of grey correlation between seedling disease index in seedling stage and the results in adult plant identification.

Key words Rice in cold region；Sheath blight；Resistance identification index；Grey correlation analysis

水稻紋枯病是水稻生產(chǎn)中重要病害之一，培育抗病品種是最經(jīng)濟(jì)有效方式。水稻紋枯病的抗性鑒定成為水稻紋枯病抗性育種的首要任務(wù)。潘學(xué)彪等[1-5]對水稻紋枯病的抗性鑒定方法和指標(biāo)進(jìn)行了大量研究。其抗性鑒定方法按接種時(shí)期分為苗期鑒定和成株期鑒定，成株期接種又分為分蘗末期和抽穗期等；按照接種方式可分為撒施法[6]、外貼法[3]、注射法[7]、捆扎法[8]、牙簽嵌入法[3]，其中牙簽嵌入法已被廣泛應(yīng)用[9-12]。調(diào)查指標(biāo)常用的有Rush等[6]提出的0～9級病級調(diào)查體系、左示敏等[5]提出的16級葉鞘位調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)、潘學(xué)彪等[13]提出的絕對病斑高度和相對病斑長度等。

寒地水稻由于施肥水平的提高以及紋枯病病菌寄主廣泛、抗源少等原因，致使寒地水稻紋枯病發(fā)病日益嚴(yán)重，成為寒地水稻生產(chǎn)的上升性病害之一[14]。已有藥劑防治效果不佳且造成環(huán)境污染、增加農(nóng)民生產(chǎn)成本。因此，了解寒地水稻種質(zhì)資源抗性情況及培育適合寒地種植的抗性品種已成為寒地水稻紋枯病抗性育種亟待解決的問題。寒地水稻抗性鑒定體系和發(fā)病規(guī)律研究較少[15]，明確適合寒地水稻紋枯病抗性鑒定的調(diào)查指標(biāo)和時(shí)期，對寒地水稻紋枯病抗性育種及遺傳分析具有重要意義。

灰色關(guān)聯(lián)分析是根據(jù)變量序列曲線幾何性狀的相似程度來判斷多變量間緊密關(guān)系的統(tǒng)計(jì)分析方法[16]。筆者采用灰色關(guān)聯(lián)分析了水稻紋枯病抗性鑒定指標(biāo)，以期為寒地水稻紋枯病抗性鑒定和遺傳分析提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種質(zhì)資源材料。

收集192份寒地水稻品種（系）及育種材料，包括不同生育期主栽品種及優(yōu)良育種材料，田間管理同大田，每個(gè)品種種植2行，行長1 m；旱育秧，插秧規(guī)格為30 cm×10 cm。

1.1.2 水稻紋枯病病菌。

2014年采集黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所紋枯病發(fā)病植株，進(jìn)行分離培養(yǎng)保存，參照彭紹裘等[17]的研究方法。

1.2 方法

1.2.1 水稻紋枯病抗病鑒定方法。

1.2.1.1 苗期鑒定。

（1）稻谷接種物培養(yǎng)基的制備。

將稻殼和稻粒以2∶1的比例混合，用清水浸泡 24 h，然后濾去水分（以不滴水為宜），裝入三角瓶，將稻谷混和物裝入三角瓶的 2/3處。用外套牛皮紙的脫脂棉塞塞住三角瓶口，121 ℃高壓滅菌30 min。滅菌后的稻谷接種物應(yīng)以稻谷表面濕潤但不結(jié)團(tuán)為宜。

（2）接種方法。

水稻紋枯病菌接種至 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)2～3 d，切取紋枯病菌菌絲塊5～10塊，接入裝有稻谷接種物培養(yǎng)基的三角瓶中，25 ℃暗培養(yǎng) 10～15 d，當(dāng)三角瓶長滿初期白色菌絲，后期深褐色的菌核時(shí)即可用于接種。暗培養(yǎng)期間每 2 d要輕晃三角瓶使菌絲體均勻分布在接種物上。

將鑒定材料浸種，播種，每品種3次重復(fù)，每重復(fù)種植 10 株苗。小苗于 3.1～3.5 葉期，采用稻谷接種物接種，在每株苗的假莖兩側(cè)分別放置 1 粒稻谷接種物，注意接種物應(yīng)需貼近葉鞘，以保證發(fā)病。

在溫室中利用防水塑料布鋪設(shè)長槽，將接種后的營養(yǎng)缽均勻擺放于其間，在槽內(nèi)注水以保證水分供給和棚內(nèi)濕度，在槽外側(cè)加蓋鐵架，鐵架外覆蓋薄膜，以保證溫度和濕度，在日光強(qiáng)烈時(shí)加蓋遮陽網(wǎng)，使接種材料處于溫度25～30 ℃、相對濕度80%～85%的“微室”中。以lemont為對照，在其充分發(fā)病后立即調(diào)查。調(diào)查指標(biāo)為單株病情指數(shù)，公式為單株病情指數(shù)=病斑高度/植株高度×9級。

1.2.1.2 成株期鑒定。

采用嵌入法分別于分蘗末期和抽穗期進(jìn)行接種鑒定。

（1）接種方法。

參照潘學(xué)彪等[3]于1997年提出的牙簽嵌入法，將木質(zhì)牙簽剪成長0.8～1.0 cm的小段，鋪于培養(yǎng)皿的底部，加入適量PDA培養(yǎng)基，覆蓋牙簽厚度以0.5～1.0 cm為宜，121 ℃高壓滅菌15 min，接種。在25 ℃下培養(yǎng)3～5 d，待菌絲密集地布滿培養(yǎng)基時(shí)，用于田間接種，每個(gè)品種接種3株，每稻叢接種3個(gè)莖桿，并掛標(biāo)簽。用鑷子將短牙簽自上向下嵌入接種莖干第2～3葉鞘，由于這2個(gè)葉鞘不再伸長，并且接種后葉鞘抱莖狀態(tài)未被改變，故植株呈自然狀態(tài)。

（2）調(diào)查時(shí)期及指標(biāo)。

接種15 d后，每隔7 d調(diào)查1次，共調(diào)查3次。調(diào)查指標(biāo)為病級、病斑長度、病斑高度、株高、相對病斑長度和絕對病斑高度。

病級參考Rush提出的9級標(biāo)準(zhǔn)并由潘學(xué)彪研究組修改的調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)[5]；

病斑長度為以病斑變色部分上下界限間長度為標(biāo)準(zhǔn)，莖稈上所有病斑長度的加和（cm）；

病斑高度為病斑上界至土表的距離（cm）；

株高為穗頂?shù)酵帘淼木嚯x（cm）；

相對病斑長度=病斑長度/株高×100%；

絕對病斑高度=病斑高度/株高×100 %。

1.2.2 灰度關(guān)聯(lián)分析。

將抽穗期接種3次調(diào)查和分蘗期接種3次調(diào)查的病級、病斑長度、相對病斑長度和絕對病斑高度視為一個(gè)灰色系統(tǒng)，根據(jù)各指標(biāo)與抗病性之間的關(guān)系，分別以抽穗期第3次調(diào)查的病級和絕對病斑高度作為參考數(shù)列（X0），試驗(yàn)組指標(biāo)所構(gòu)成的數(shù)列作為比較數(shù)列（Xi），根據(jù)灰色系統(tǒng)理論先將各考察性狀進(jìn)行無量綱化處理，并按照公式（1）將原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紋枯病各調(diào)查指標(biāo)差異性分析

由表1可知，病級數(shù)、絕對病斑高度、相對病斑長度及病斑長度4個(gè)調(diào)查指標(biāo)在分蘗末期的3次調(diào)查和抽穗期第3次調(diào)查中差異顯著，該4個(gè)調(diào)查指標(biāo)呈現(xiàn)不斷加重的趨勢，不論是分蘗末期還是抽穗期接種第3次調(diào)查（即接種后第36天）發(fā)病情況最重，變異系數(shù)最大。分蘗末期和抽穗期第3次調(diào)查的結(jié)果可作為抗性鑒定的參照指標(biāo)。

2.2 水稻紋枯病調(diào)查指標(biāo)灰度關(guān)聯(lián)分析

由表2可知，抽穗期第3次調(diào)查指標(biāo)病級、相對病斑長度、病斑長度與其絕對病斑高度灰色關(guān)聯(lián)度分別為0.900 8、0.915 7、0.956 1；絕對病斑高度、相對病斑長度、病斑長度與其病級的灰色關(guān)聯(lián)度分別為0.936 8、0.908 1、0.904 6。分蘗末期接種的3次調(diào)查中，病級、絕對病斑高度與抽穗期第3次調(diào)查的絕對病斑長度和病級的灰色關(guān)聯(lián)度呈上升趨勢，且分蘗末期接種的第3次調(diào)查中其灰色相關(guān)度分別為0.891 2、0.888 6和0.911 1、0.903 0。結(jié)果表明，分蘗末期第3次調(diào)查指標(biāo)病級和絕對病斑高度可作為重要參考指標(biāo)。苗期鑒定的單株病情指數(shù)與抽穗期接種的絕對病斑高度和病級的灰色相關(guān)度分別為0.746 1和0.787 9，表明苗期鑒定的調(diào)查指標(biāo)與成株期鑒定的結(jié)果具有一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論與討論

建立和完善科學(xué)的紋枯病接種鑒定體系，無論是從植物保護(hù)的角度還是抗病育種的角度都是首要進(jìn)行的工作。目前，人們對南方稻區(qū)水稻紋枯病的抗性鑒定體系開展了大量研究[1-5]，但水稻紋枯病的發(fā)病與其小環(huán)境的氣候條件有密切關(guān)系，關(guān)于寒地稻作區(qū)的發(fā)病規(guī)律有少量報(bào)道[14-15]，探索和改良出適合寒地水稻紋枯病抗性鑒定的方法和評價(jià)指標(biāo)對于寒地水稻紋枯病的抗性育種和分子機(jī)理研究具有重要意義。

該研究根據(jù)寒地氣溫條件將苗期鑒定法進(jìn)行了改善，在溫室內(nèi)建立大型水槽，并將試驗(yàn)材料種植于營養(yǎng)缽中，在水槽中注水保證秧苗的需水以及濕度的提供；同時(shí)在水槽外加蓋鐵架，在鐵架上覆蓋塑料薄膜保溫，中午強(qiáng)光下覆蓋遮陽網(wǎng)，保證水稻紋枯病發(fā)病的最適溫度及濕度。該方法簡單易行、成本低，適用于大量試驗(yàn)材料的鑒定。

為探索出最佳的成株期接種的調(diào)查時(shí)期，該研究在接種后15 d每隔7 d進(jìn)行一次調(diào)查，調(diào)查病級、絕對病斑高度、相對病斑長度和病斑長度，第3次調(diào)查時(shí)各試驗(yàn)材料發(fā)病均勻，能夠反映出各試驗(yàn)材料間差異?；疑P(guān)聯(lián)分析能夠客觀地反映出各調(diào)查指標(biāo)間關(guān)系，從調(diào)查指標(biāo)來看，絕對病斑高度、相對病斑長度和病斑長度主觀性誤差更小，其數(shù)值變化更適于遺傳定位研究，病級可作為抗性鑒定的可靠、快速調(diào)查指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1] 潘學(xué)彪，RUSH M C.美國的水稻紋枯病抗病遺傳育種研究[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，18（1）：57-63.

[2] 潘學(xué)彪，RUSH MILTON C.兩個(gè)水稻改良抗源對紋枯病抗性的遺傳研究[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，18（2）：1-6.

[3] 潘學(xué)彪，陳宗祥，徐敬友，等.不同接種調(diào)查方法對抗水稻紋枯病遺傳研究的影響[J].江蘇農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1997，18（3）：27-32.

[4] 陳宗祥，鄒軍煌，徐敬友，等.對水稻紋枯病抗源的初步研究[J].中國水稻科學(xué)，2000，14（1）：15-18.

[5] 左示敏，張亞芳，殷躍軍，等.田間水稻紋枯病抗性鑒定體系的確立與完善[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2006，27（4）：57-61，111.

[6] RUSH M C，HOFF B J，MCLLRATH W O.A uniform disease rating system for rice disease in the United States[C]//Proc 16th Rice Tech Working Group.Lake Charles，Louisana，USA：[s.n]，1976：64.

[7] WASANO K，ORO S，KIDO Y.The syringe inoculation method for selecting rice plants resistant to sheath blight， Rhizoctonia solani[J].Jpn Trop Agric，1983，27：131-134.

[8] 過崇儉，陳志誼，王法明.水稻紋枯病菌Thanatephorus cucumeris（Frank）Donk致病力分化及品種抗性鑒定技術(shù)的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1985，18（5）：50-57.

[9] 付冬.水稻抗紋枯病QTLs定位及抗病候選基因發(fā)掘[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011：18-19.

[10] 李愛宏.水稻抗紋枯病基因工程育種研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2002：25.

[11] 謝學(xué)文.水稻抗紋枯病QTL定位及抗病導(dǎo)入系構(gòu)建[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2009：9-10.

[12] 譚彩霞.水稻抗紋枯病近等基因系的構(gòu)建[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2004：15-16.

[13] 潘學(xué)彪，鄒軍煌，陳宗祥，等.水稻品種Jasmine85抗紋枯病主效QTLs的分子標(biāo)記定位[J].科學(xué)通報(bào)，1999，44（15）：1629-1635.

[14] 李貴臣.寒地水稻紋枯病的發(fā)生與防治[J].北方水稻，2012，42（6）：59，66.

[15] 宋成艷，王桂玲，孟慶忠，等.寒地水稻紋枯病初步研究[J].植物保護(hù)，2002，28（2）：8-11.

[16] 趙玉坤，高根來，王向東，等.灰色關(guān)聯(lián)分析方法在作物育種上的應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：1032-1034.

[17] 彭紹裘，范坤成.水稻紋枯病研究論文選集[C].長沙：湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，1997.