胡江濤 俞凌云 帥培強(qiáng) 于剛 何開蓉

摘要[目的]采用快速提取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（QuEChERS-HPLC-MS/MS）建立水果蔬菜中氯吡脲殘留的檢測(cè)方法。[方法]樣品經(jīng)含0.1%乙酸的乙腈溶液提取，經(jīng)QuEChERS法凈化后采用HPLC-MS/MS法測(cè)定其氯吡脲殘留量。[結(jié)果]該方法下氯吡脲在水果蔬菜中的檢出限（LOD）為1.0 μg/kg，定量限（LOQ）為5.0 μg/kg。在2.0～1000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2>0.999）。在100～5000 μg/kg的添加水平上，方法的平均回收率介于72.0%～115.0%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～9.8%。[結(jié)論]該方法適用于水果蔬菜中氯吡脲的測(cè)定。

關(guān)鍵詞檢測(cè)；氯吡脲；水果蔬菜；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào)TS207.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）17-0071-05

Abstract[Objective] A quick extraction method QuEChERSHPLCMS/MS was established to determine forechlorfenuron in fruits and vegetables. [Method] Fruits and vegetables were extracted with 0.1% acetic acid of acetonitrile solution and purified by QuEChERS， then forechlorfenuron residues were determined by HPLCMS/MS. [Result] The limits of detection （LODs） and low determination limit （LOQ） for the forechlorfenuron was 1.0 μg/kg and 5.0 μg/kg in fruits and vegetables， respectively. Regression equations of these hormones had a good linear relationship （R2>0.999） within 2.0-100.0 μg/L. The average recoveries of forechlorfenuron was in the range of 72.0%-115.0% with the coefficients of variation between 1.5% and 9.8% at the spiked levels of 10.0-500.0 μg/kg. [Conclusion] The method can be applied for the determination of the forechlorfenuron in fruits and vegetables.

Key wordsDetermination；Forechlorfenuron；Fruits and vegetables；HPLCMS/MS

基金項(xiàng)目四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015GZ0084，SK0604）；四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目（2012-001）。

作者簡(jiǎn)介胡江濤（1974—），男，四川遂寧人，高級(jí)工程師，碩士，從事食品理化檢驗(yàn)研究。

收稿日期2017-03-29

氯吡脲（Forechlorfenuron）是一種高效植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，商品名吡效隆，又稱為調(diào)吡脲、吡效隆醇、施特優(yōu)?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大多受益于植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（植物生長(zhǎng)激素），但這些激素的應(yīng)用雖然可以改善水果外觀、提高其產(chǎn)量，但其內(nèi)在質(zhì)量明顯下降[1]，更重要的是攝入過量激素可能對(duì)人體帶來潛在健康危害。

歐盟、日本等國(guó)家對(duì)氯吡脲的殘留量作出了限定。歐盟要求其成員國(guó)常規(guī)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的氯吡脲，防止其對(duì)環(huán)境可能產(chǎn)生的危害。日本“肯定列表”對(duì)果蔬中氯吡脲的限定，規(guī)定在香瓜、葡萄、梨、獼猴桃等水果蔬菜中的殘留限量值暫定為0.1 mg/kg；以色列規(guī)定梨、獼猴桃、葡萄中氯吡脲的殘留限量為0.01 mg/kg；韓國(guó)規(guī)定瓜類中氯吡脲的殘留限量值為005 mg/kg。我國(guó)在2009年農(nóng)業(yè)部NY 1500.75.1—2009中規(guī)定了西瓜、黃瓜、獼猴桃和葡萄中氯吡脲的殘留限量分別為0.1、0.1、0.05和0.05 mg/kg。查閱我國(guó)有關(guān)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的規(guī)定發(fā)現(xiàn)，目前還沒有相關(guān)的檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)產(chǎn)品說明多借鑒國(guó)外標(biāo)準(zhǔn)。

隨著儀器分析的不斷發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用分析法在農(nóng)獸殘留分析檢測(cè)中占據(jù)了重要的地位，特別是三重四極桿質(zhì)譜的出現(xiàn)，相比傳統(tǒng)的高效液相色譜法，液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜在農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中具有一定的優(yōu)勢(shì)[2-3]。多年來，液相色譜法[4-7]廣泛地用于各種藥物的檢測(cè)，但方法的前處理較復(fù)雜，檢測(cè)器的靈敏度也不能達(dá)到目前各國(guó)限量要求，且每個(gè)樣品通常需要過一次甚至幾次固相萃取小柱，不能適應(yīng)于大量樣品的快速檢測(cè)。

該研究建立了一種QuEChERS提取，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水果蔬菜中氯吡脲的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，同時(shí)凈化效果好，回收率穩(wěn)定，易于掌握。

1材料與方法

1.1材料

供試蔬菜水果樣品：葡萄、獼猴桃、水蜜桃、黃瓜、草莓、枇杷、西瓜、西紅柿、西芹、苦瓜、茄子、蘋果、櫻桃，市售。

氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥96%，美國(guó)Sigma公司；乙腈，色譜純，德國(guó)CNW技術(shù)有限公司；正己烷、冰乙酸、無水乙酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉和無水硫酸鎂，分析純，成都科龍化工有限公司；氯化鈉：450 ℃灼燒4 h，密封備用；無水硫酸鈉和無水硫酸鎂：650 ℃灼燒4 h，貯藏干燥器中備用；

N-丙基乙二胺（PSA，粒度40 μm）、十八烷基硅烷鍵合相（C18，粒度50 μm），購(gòu)于北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心。

主要儀器設(shè)備：

超高效液相色譜（Waters ACQUITY UPLC）-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（Aglient 6510）聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI）；渦旋混合器，上海精宏；超聲波清洗器；J2-21離心機(jī)、樣品粉碎機(jī)、組織搗碎機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特；高速組織勻漿機(jī)，日本TAITEC。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.0 mg/mL氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，置-18 ℃冰箱中保存。根據(jù)需要用乙腈將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用現(xiàn)配。

1.3儀器條件

1.3.1色譜條件。

色譜柱：MG-II C18柱（2.1 mm×150.0 mm ×5.0 μm）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相：A（乙腈），B（0.1%乙酸水溶液）。等度洗脫條件為乙腈∶0.1%乙酸水溶液（V/V）=6∶4。

1.3.2質(zhì)譜條件。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；定量離子對(duì)308.9/288.9（m/z）；定性離子對(duì)為308.9/288.9（m/z）和308.9/92.9（m/z）。

1.4樣品處理

樣品進(jìn)行粉碎提取，獲得提取液。

稱取005 g N-丙基乙二胺（PSA），0.1 g C18，0.15 g無水硫酸鎂置于10 mL具塞玻璃離心管中，準(zhǔn)確加入2.0 mL樣品提取液至離心管中，渦旋振蕩1 min，以5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min。取上清液1 mL過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1凈化方法的優(yōu)化

2.1.1提取液的選擇。

乙腈是一種良好的提取劑，在現(xiàn)代的農(nóng)獸殘留檢測(cè)中常用來作為提取劑。乙腈可以與水任意比混溶，可與樣品組織細(xì)胞中待測(cè)物有效接觸，當(dāng)加入鹽后又能迅速與水分層，且乙腈本身對(duì)樣品中的糖、脂肪和蛋白質(zhì)的溶解性較小，對(duì)蛋白有沉淀作用。該研究考察了含有01%乙酸的乙腈和乙腈作為提取劑的提取效率，發(fā)現(xiàn)兩者并沒有多大差別。氯吡脲在弱酸性至中性條件下是非常穩(wěn)定的，在堿性環(huán)境下易分解，為保持氯吡脲在樣品前處理中的穩(wěn)定，方法在提取液乙腈中加了0.1%乙酸，以保護(hù)待測(cè)物在提取過程中和檢測(cè)過程中的穩(wěn)定態(tài)。

2.1.2提取方式及溫度的選擇。

該試驗(yàn)比較了超聲提取和機(jī)械振蕩提取，發(fā)現(xiàn)超聲提取的回收率要稍微高一些。原因是超聲提取中超聲波可以破壞細(xì)胞壁，使乙腈能更好地滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行萃取，而機(jī)械振蕩無法破壞細(xì)胞壁。因此該方法選擇用超聲提取的方式。

超聲提取的水浴溫度對(duì)回收率也有影響，如果溫度過低，不利于溶劑滲透到樣品內(nèi)部提取，特別是畜禽產(chǎn)品，油脂在低溫下要凝固，不利于提取。因此要保持適當(dāng)?shù)奶崛囟龋摲椒ㄟx擇超聲提取溫度為30 ℃。

2.1.3凈化方法選擇。

QuEChERS是近年來國(guó)際上興起的快速高效多殘留檢測(cè)前處理技術(shù)。2003年，美國(guó)農(nóng)業(yè)部專家Steven博士提出了QuEChERS（ quick，easy，cheap，effective，rugged and safe）快速多農(nóng)殘檢測(cè)方法，它是一種快速、簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、適用面廣的樣品前處理方法。在該方法出現(xiàn)后的幾年間，歐盟每年已有超過100個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加此方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，證明這種方法在實(shí)驗(yàn)室間取得成功。目前，該方法已被很多國(guó)家列為農(nóng)藥殘留分析標(biāo)準(zhǔn)分析方法，如AOAC Official method 2007（01）、英國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法BS EN 155662：2008等[8-10]。研究過程中在總結(jié)多年的應(yīng)用基礎(chǔ)上對(duì)該方法進(jìn)行了一些改進(jìn)，加入了C18固相吸附劑，對(duì)試樣中的蛋白質(zhì)、脂肪酸、色素有一定的吸附。

C18固相吸附劑是一種非極性吸附劑，可以吸附高分子量的非極性干擾物質(zhì)，特別適用于低脂類水果蔬菜的凈化，對(duì)樣品中的蛋白、脂質(zhì)物質(zhì)、部分維生素、色素和甾醇等雜質(zhì)也有一定的吸附作用。

PSA是一類性質(zhì)與氨基柱固相萃取小柱填料相同的固相吸附劑，不同的是PSA有2個(gè)氨基，它們的主要作用力是極性和陰離子交換作用。它常用來消除各種有機(jī)酸、部分色素以及蛋白質(zhì)、糖類和脂肪酸。

石墨化碳黑（GCB）主要是用來去除類甾體、葉綠素等色素。該研究考察了NH2類填料和GCB的實(shí)際效果，發(fā)現(xiàn)NH2可去除90%以上的脂肪酸和50%左右的色素；GCB可去除90%以上的色素，但對(duì)脂肪酸的凈化能力僅有10%左右。筆者考察GCB對(duì)氯吡脲的吸附情況時(shí)，發(fā)現(xiàn)GCB對(duì)氯吡脲有較強(qiáng)的吸附作用，故在該試驗(yàn)中放棄了加入GCB來進(jìn)行凈化的手段。

2.1.4吸附劑用量的影響。

該試驗(yàn)考查了C18和PSA吸附劑對(duì)氯吡脲的吸留作用。吸取濃度為100 μg/L的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)液分別用2種固相吸附劑凈化。測(cè)定結(jié)果見表1。

由上述試驗(yàn)可以得出如下結(jié)論，C18吸附劑對(duì)氯吡脲基本無吸附，用量200 mg時(shí)回收率仍在80%以上，而PSA對(duì)氯吡脲吸附有影響，PSA增大到100 mg以上回收率下降得較快。無水硫酸鈉和無水硫酸鎂對(duì)待測(cè)物基本無吸附。因此該試驗(yàn)方法選擇用2 mL提取液，加入50 mg PSA、100 mg C18和200 mg無水硫酸鎂。

2.1.5渦旋振蕩時(shí)間的影響。

C18吸附劑和PSA吸附劑與樣液接觸時(shí)間也有影響。該試驗(yàn)考察了對(duì)加標(biāo)樣品渦旋振蕩1、2、3、4和5 min時(shí)，吸附劑對(duì)氯吡脲的吸留作用。測(cè)定結(jié)果表明，回收率的變化不大，在10%內(nèi)波動(dòng)。因此渦旋振蕩時(shí)間對(duì)氯吡脲影響不大，但為了規(guī)范統(tǒng)一操作，規(guī)定提取液中加入吸附劑后，每份試樣凈化時(shí)渦旋的時(shí)間準(zhǔn)確定為1 min。處理好的試樣液應(yīng)盡快離心，過濾膜上機(jī)測(cè)定。

2.2儀器條件的優(yōu)化

2.2.1色譜條件的優(yōu)化。

在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定時(shí)，在流動(dòng)相中加入低濃度的甲酸或乙酸胺溶液，有利于目標(biāo)化合物離子化，可以提高靈敏度和分離度，使色譜峰形對(duì)稱、尖銳。通過試驗(yàn)驗(yàn)證選擇乙腈+0.1%乙酸水溶液作為流動(dòng)相。等度洗脫條件為乙腈∶0.1%乙酸水溶液（V/V）=6∶4。氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)（10 μg/L）的總離子流圖及MRM圖如圖1所示。

2.2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化。

采用注射泵直接進(jìn)樣方式，以10 μL/min流速將氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子源中，在正離子檢測(cè)方式下對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到分子離子峰，對(duì)該分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析（子離子掃描），得到碎片離子信息，獲得該物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖，見圖2和圖3。然后對(duì)去簇電壓（DP）、碰撞氣能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化，使分子離子和特征碎片離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最佳。并優(yōu)化霧化氣、氣簾氣、輔助加熱器、離子源溫度、電噴霧電壓，使目標(biāo)化合物的離子化效率達(dá)到最佳。得到的質(zhì)譜條件如下：

離子源為電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓（IS）5 200 V，離子源溫度（TEM）450 ℃；碰撞氣壓力（CAD）20.68 kPa；霧化氣壓力（GS1）68.95 kPa；氣簾氣壓力（CUR）62.05 kPa；其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.3分析方法的評(píng)價(jià)

2.3.1線性范圍和測(cè)定低限。

根據(jù)氯吡脲的靈敏度，分別配成2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L一系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量10 μL，峰保留時(shí)間和子離子峰度比定性，用峰面積對(duì)其定量，其線性范圍2.0～100.0 μg/L、線性方程Y=1 210X+893（其中X為氯吡脲頂量濃度，Y為峰面積），線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法的檢出限（LOD）為1.0 μg/kg，定量限（LOQ）為5.0 μg/kg。

2.3.2方法的回收率和精密度。

分別按試樣中氯吡脲限量水平進(jìn)行加標(biāo)5.0～50 μg/kg含量水平標(biāo)準(zhǔn)液，每一添加濃度重復(fù)10份樣品，按上述試驗(yàn)方法測(cè)定，得到添加濃度范圍的回收率見表3。測(cè)定回收率和室內(nèi)精密度，方法的總體平均回收率72.0%～115.0%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～9.8%。

3結(jié)論

該試驗(yàn)建立了高效快速提取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（QuEChERS-HPLC-MS/MS）測(cè)定水果蔬菜中氯吡脲殘留的檢測(cè)方法。試驗(yàn)選擇有代表性的13種水果蔬菜進(jìn)行了方法研究，方法的測(cè)定低限（LOD）為1.0 μg/kg，方法的總體平均回收率為72.0%～115.0%，方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～9.8%。該方法操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，同時(shí)凈化效果好，回收率穩(wěn)定，適用于水果蔬菜中氯吡脲的測(cè)定。

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