王可新，姚宏波，王 碩，劉子墨，廉 潔*

（齊齊哈爾醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，1.卓越1班，2.組胚教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

1 實驗材料及儀器

1.1 一般資料

SD級大鼠、DMEM培養(yǎng)基、Hanks液、20%完全培養(yǎng)基、雙抗、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素和鏈霉素、EDTA溶液

1.2 儀器

倒置顯微鏡、培養(yǎng)瓶、眼科鑷、眼科剪、二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機、超凈工作臺、離心管、培養(yǎng)瓶、玻璃吸管、膠帽、注射器、小燒杯、細胞培養(yǎng)板

2 實驗方法

2.1 細胞的提取與培養(yǎng)

（1）取大鼠脫頸處死，浸泡于75%的乙醇溶液中20～30 min，無菌潔凈工作臺上，取大鼠雙側后肢股骨，置入小燒杯中，用適量Hanks液清洗2～3次，洗去血污。

（2）用眼科剪剪開兩端骨骺，暴露骨髓腔，一端置于離心管上方，另一端用注射器抽取Hanks液注入骨髓腔，沖出骨髓。反復沖洗至液體不再渾濁為止。離心10分鐘，骨髓下沉，用吸管吸出多余的Hanks液。

（3）用培養(yǎng)液清洗1次，加入20%培養(yǎng)液5 mL，放入培養(yǎng)瓶，置于37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱。

（4）第二日換液，觀察細胞貼壁情況。以后每3～4天更換培養(yǎng)基一次，當細胞融合80%～90%時，按1：2進行傳代培養(yǎng)。

（5）利用倒置顯微鏡下分別對原代培養(yǎng)的細胞和傳代培養(yǎng)的細胞進行觀察，觀察其生長特點。

（6）利用HE染色法對細胞進行染色，光鏡下觀察大鼠骨髓間充質干細胞的形態(tài)特征。

2.2 細胞的換液方法：

（1）37℃水浴中放入PBS及10%培養(yǎng)液，10分鐘。

（2）操作臺及實驗室內(nèi)紫外照射20-30分鐘。

（3）紫外結束，開排風，點酒精燈，戴好手套，用酒精棉球擦拭工作臺及手。

（4）取出培養(yǎng)瓶，用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶瓶口、體及底。

（5）在操作箱中，打開培養(yǎng)瓶，過火，倒掉培養(yǎng)液。

（6）PBS、培養(yǎng)液打開封口膜，過火，注射器分別插入瓶口。

（7）用PBS沖洗2次，加入5毫升培養(yǎng)液，蓋好瓶蓋，放入培養(yǎng)箱。

（8）將PBS、培養(yǎng)液封口膜封口，放入4℃冰箱。

2.3 細胞的傳代培養(yǎng)：

（1）待原代細胞長到80%-90%，細胞狀態(tài)接近融合時，于此時進行細胞的傳代培養(yǎng)。

（2）無菌條件下，在經(jīng)過紫外線殺菌后的操作臺內(nèi)，倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液。

（3）Hanks液清洗培養(yǎng)瓶1-2次后，向其中加入1毫升胰蛋白酶和EDTA混合液（體積比為1:1），蓋好瓶蓋蓋，放置于37℃培養(yǎng)箱中溫育2-4分鐘。

（4）顯微鏡下觀察，若細胞回縮，細胞間隙變大，甚至漂浮起來，此時需立即停止消化。

（5）輕輕吸除消化液，加Hanks液清洗培養(yǎng)瓶1次，去除殘存的消化液。

（6）向培養(yǎng)瓶中加入培養(yǎng)液2毫升，用吸管反復吹打貼壁細胞，制成細胞懸液。

（7）用計數(shù)板計數(shù)懸液濃度約10^5/ml接種于新培養(yǎng)瓶中。

2.4 細胞的分化誘導鑒定：

（1）取生長狀態(tài)良好的第三代骨髓間充質干細胞以10^8/ml接種于預先置有小蓋玻片的6孔板中，將其放入37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

（2）待細胞達到70%-80%融合后，加入分化誘導液。

（3）每3天換液一次，誘導14天后，對培養(yǎng)的細胞進行細胞分化水平的鑒定。

3 觀察指標：

（1）細胞形態(tài)學觀察。

（2）細胞多向分化能力的鑒定。

4 結 果

（1）在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞呈圓形，大小不一，胞體透亮，折光率強。

（2）培養(yǎng)24 h后，可以觀察到大量貼壁細胞，細胞形狀呈短棒狀。

（3）培養(yǎng)48 h后，細胞可呈扁平形，短梭形，小圓形或多角形，呈貼壁生長的狀態(tài)。

（4）培養(yǎng)3、4天后，貼壁細胞數(shù)量增多。

（5）培養(yǎng)6、7天后，細胞大量增殖并出現(xiàn)融合現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)胞體略大，細胞間排列緊密，大多數(shù)細胞呈梭形。

（6）將細胞傳代培養(yǎng)至3、4代后，細胞體積較大，細胞呈梭形或紡錘形，此時細胞的核漿比例較小。

（7）在細胞誘導分化14天后，細胞出現(xiàn)類似神經(jīng)元樣細胞的改變，細胞形態(tài)各異，呈錐體形、球形、星形、梨形等。

（7）神經(jīng)元細胞的表型特征將在第三代骨髓間充質細胞的培養(yǎng)中表現(xiàn)出來，這說明體外分離培養(yǎng)的細胞為骨髓間充質干細胞。

5 討 論

骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells ，BMSCs）是一種存在于骨髓基質內(nèi)的，由中胚層細胞分化而來的具有多向分化潛能的干細胞。細胞處于未分化狀態(tài)，增殖能力強，可在體外進行大量的培養(yǎng)，而且取材方便，自體移植不會發(fā)生免疫排斥反應，更與醫(yī)學倫理問題無關。因此骨髓間充質干細胞的提取分化為治療神經(jīng)退行性疾病的提供的全新的探索空間。然而，骨髓間充質干細胞的含量在骨髓中所占比例極小，如果想要利用間充質干細胞進行研究和治療，必須對其進行體外的分離培養(yǎng)及擴增。

骨髓間充質干細胞具有多向分化的潛能，易于誘導為脂肪細胞、成骨細胞、心肌細胞，神經(jīng)細胞及其他細胞。這種特性使其在中樞神經(jīng)系相關統(tǒng)疾病的治療中具有十分明顯的優(yōu)勢。進行骨髓間充質干細胞的體外培養(yǎng)，誘導其定向分化為神經(jīng)元樣細胞，研究分化方法，可實現(xiàn)個體化治療的目的，為臨床使用提供了極大的便利，為骨髓間充質干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷病變的修復過程起到的重要作用提供了理論基奠，并對研究修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究進一步實驗提供了可行性極大地實驗研究方案；為治療神經(jīng)退行性疾病提供更多的治療方案，為患者增加治愈的希望，盡可能減輕患者的經(jīng)濟負擔，并對推進間充質干細胞研究的進程具有極其重要的意義。

骨髓間充質干細胞是用于治療組織修復和重建的種子細胞，為骨髓間充質干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)損傷病變修復過程起到的作用提供理論基奠，并對研究修復神經(jīng)系統(tǒng)損傷的進一步實驗提供可行性實驗研究方案，具有極大的發(fā)展空間。

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