張 驍，張紅明，劉大男▲，李曉燕

(1．貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科，貴陽 550004；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南 250031)

二甲雙胍對飽和脂肪酸誘導的大鼠H9C2型心肌細胞損傷的保護作用研究*

張 驍1，張紅明2△，劉大男1▲，李曉燕2

(1．貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科，貴陽 550004；2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院，濟南 250031)

目的 探討二甲雙胍(Met)對飽和脂肪酸所誘導的大鼠H9C2型心肌細胞損傷作用的保護機制。方法 在對照、棕櫚酸(PA)及3種不同濃度梯度Met與PA聯(lián)合組培養(yǎng)液中培養(yǎng)大鼠H9C2型心肌細胞株24 h。采用蛋白質印跡法(Western blot)測定各組細胞核因子κB(NF-κB)p65、細胞間黏附因子(ICAM1)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的蛋白表達，實時熒光定量PCR測定各組細胞NF-κB、單核細胞趨化因子(CCL2)和ICAM1的mRNA表達。結果 與對照組相比，PA組的細胞中NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα蛋白表達量增加(P<0.05)；與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα的蛋白表達量隨Met濃度梯度增加表現(xiàn)為不同程度遞減(P<0.05)，p-AMPK蛋白表達量隨Met濃度增加而顯著增加(P<0.05)。與對照組相比，PA組CCL2、ICAM1的mRNA表達量增加(P<0.05)；與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細胞CCL2和ICAM1的mRNA表達量下降(P<0.05)。結論 Met可以減輕由飽和脂肪酸誘導細胞黏附因子和趨化因子表達增加而引起的大鼠H9C2型心肌細胞損傷。

二甲雙胍；NF-κB；趨化因子；腺苷酸活化蛋白激酶

飽和脂肪酸攝入過多是導致臨床上血脂異常癥的主要原因，可以增加動脈粥樣硬化和心血管事件發(fā)生的風險。棕櫚酸(palmitic acid，PA)作為飽和脂肪酸的一種可導致心肌細胞的損傷凋亡[1]。核因子κB(nuclear factor of κB，NF-κB)是一種廣泛存在于各種細胞中的轉錄調節(jié)因子，可以調控多種靶基因包括細胞間黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、單核細胞趨化因子[chemokine (C-C motif) ligand 2，CCL2]及多種免疫相關受體等，對于機體的炎癥反應、應激反應和細胞凋亡起主導作用[2]。近年來研究表明，二甲雙胍(metformin，Met)作為臨床上常用的治療2型糖尿病的一線藥物，能夠對損傷的血管內皮細胞起到一定程度保護作用[3-5]。對于這種保護作用的機制，過去有研究證實，可能是通過激活腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的途徑而實現(xiàn)的[6]。本實驗探討Met是否對飽和脂肪酸誘導損傷的心肌細胞起到同樣的保護作用，并對藥物的作用機制做進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 大鼠H9C2心肌細胞株(齊氏生物科技有限公司)，Met、PA(Sigma公司)，進口胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(HyClone公司)，NF-κB p65抗體、ICAM1抗體(Abcam公司)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、p-AMPK抗體(Santa公司)，RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒、熒光PCR試劑盒(TaKaRa公司)，引物由上海博尚生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組 采用H9C2型大鼠心肌細胞株在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)，每2天換液，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞，調整細胞濃度接種至6孔板，37 ℃、5%CO2孵育2 h。每兩個孔為一組進行編號，一共5組，依次分為對照組、PA組(300 μmol/L)、低濃度Met(1 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組、中濃度Met(2 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組、高濃度Met(4 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組，在無血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細胞至24 h。

1.2.2 藥物刺激的配制 83 mg Met溶于1 000 μL三蒸水過濾制成500 mmol/L的母液，-20 ℃保存。0.025 6 g PA溶于1 mL無水乙醇，60 ℃水浴完全溶解后加入20 μL 10 mol/L NaOH，顛倒混勻溶于不含飽和脂肪酸的牛血清清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液，振蕩混勻過濾制成10 mol/L PA母液，4 ℃存放。

1.2.3 蛋白質印跡法(Western blot)測定NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達 各組H9C2心肌細胞樣本分別取160 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉2 h后，依分子量分別與兔抗大鼠NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK抗體混合后4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，與山羊抗兔IgG室溫下孵育2 h，加入ECL顯色底物，凝膠成像分析儀上成像。設β-actin為內參，用ImageJ軟件測定NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的灰度值并與內參進行比較。

1.2.4 實時熒光定量PCR測定NF-κB、ICAM1及CCL2的mRNA表達 在NCBI Gen Bank數(shù)據(jù)庫中查詢NF-κB、ICAM1、CCL2，采用Primer 5.0軟件設計引物。NF-κB：上游引物為5′-AAC AGA GAG GAT TTC GTT TCC G-3′，下游引物為5′-TTT GAC CTG AGG GTA AGA CTT CT-3′，擴增產物長度190 bp；ICAM1：上游引物為5′-ATG CCC AGA CAT CTG TGT CC-3′，下游引物為5′-GGG GTC TCT ATG CCC AAC AA-3′，擴增產物長度104 bp；CCL2：上游引物為5′-CAG CCA GAT GCA ATC AAT GCC-3′，下游引物為5′-TGG AAT CCT GAA CCC ACT TCT-3′，擴增產物長度112 bp。按照試劑盒說明書進行細胞總RNA的提取，采用逆轉錄試劑盒(20 μL體系)逆轉錄所得cDNA為模板進行PCR擴增目的片段，于LightCycler PCR儀上進行定量檢測，在加樣操作過程中注意避光，各反應液配置在冰上進行。反應條件：預變性，95 ℃ 30 s；PCR反應，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，隨后進行溶解曲線分析。結合擴增曲線及溶解曲線分析，將符合要求的樣本基因定量PCR原始數(shù)據(jù)取3次重復的平均值，經(jīng)β-actin校正，用Light Cycler 4.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

2 結 果

2.1 大鼠H9C2心肌細胞生長特點 使用倒置相差顯微鏡(Olympus公司)觀察，H9C2細胞貼壁生長，單個細胞形態(tài)以現(xiàn)梭型、三角形為主，細胞質為透明、細胞核圓形。見圖1。

A:×40；B：×200

圖1 大鼠H9C2細胞

2.2 各組細胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達水平 PA組細胞的NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα蛋白表達量明顯高于對照組(P<0.05)。與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細胞的NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達量隨Met濃度增加而明顯遞減(P<0.05)，Met+PA聯(lián)合組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ICAM1蛋白表達量明顯降低(P<0.05)，其中中濃度Met+PA聯(lián)合組細胞的ICAM1蛋白表達量最低(P<0.05)。隨著Met濃度梯度的增加，Met+PA聯(lián)合組細胞的p-AMPK蛋白表達量與對照組和PA組相比顯著增高(P<0.05)，其中中濃度Met+PA聯(lián)合組細胞的p-AMPK蛋白表達量最高(P<0.05)。見圖2、3。

*:P<0.05，與對照組相比；#:P<0.05，與PA組相比

圖2 各組NF-κB p65和ICAM1的蛋白表達

*：P<0.05，與對照組相比；#：P<0.05，與PA組相比

圖3 各組p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達

2.3 各組細胞NFκB、CCL2和ICAM1的mRNA表達水平 與對照組比較,PA組NF-κB的mRNA表達量有所增加但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，CCL2和ICAM1的mRNA表達量明顯增加(P<0.05)。與PA組相比，不同濃度的Met+PA聯(lián)合組細胞NF-κB的mRNA表達量逐漸減少但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Met+PA聯(lián)合組細胞CCL2和ICAM1的mRNA表達量隨Met濃度增加而減少(P<0.05)，Met+PA聯(lián)合組組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

*：P>0.05，與對照組相比；#：P>0.05，與PA組相比；a：P<0.05，與對照組相比；b：P<0.05，與 PA組相比

圖4 各組細胞的NF-κB、CCL2和ICAM1的mRNA表達

3 討 論

高濃度飽和脂肪酸環(huán)境下的血管內皮細胞損傷與脂質形成是動脈粥樣硬化形成的始動因素，長時間受這種高危因素影響還能夠引起心肌細胞的大量損傷凋亡[7]，嚴重危害了人類的健康。Met作為一款常用的降糖藥物在近年來國內外的前沿研究中有了很多新的發(fā)現(xiàn)，除了已熟知的抗動脈粥樣硬化的作用之外，還發(fā)現(xiàn)它對脊髓損傷的神經(jīng)細胞抗炎抗凋亡的作用及降低前列腺癌的發(fā)病率的作用等[8-9]。更有報道認為，Met是一種個體在感染源環(huán)境中的潛在心肌保護劑[10]。

本研究以大鼠H9C2型心肌細胞為基礎，通過高濃度飽和脂肪酸誘導細胞凋亡損傷，驗證Met對上述受損心肌細胞的保護作用。有研究證明，動脈粥樣硬化斑塊的形成與細胞黏附因子和趨化因子的增多有著至關重要的關系[11]。Yan等[12]發(fā)現(xiàn)，高濃度軟脂酸誘導人臍靜脈內皮細胞時，可使核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB，IκB)磷酸化增加，使其對NF-κB的抑制作用減弱。在本實驗中，PA能夠引起細胞NF-κB、p-IκBα、ICAM1的蛋白表達明顯升高，也可以誘導CCL2和ICAM1的mRNA表達量上調，這說明高濃度飽和脂肪酸一方面可以通過增加細胞黏附因子和趨化因子的表達促進粥樣斑塊的形成，造成心腦血管疾病的發(fā)生，另一方面可以使IκB蛋白磷酸化從而降低其對NF-κB的抑制作用，使細胞內NF-κB表達增多啟動炎癥反應，引起細胞的凋亡與損傷。實驗結果顯示，在同等濃度PA條件的細胞組中，Met能夠顯著降低細胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα的蛋白表達和CCL2、ICAM1的mRNA表達，且表達程度隨Met濃度梯度增加而下降，這表明Met能夠減輕PA誘導的H9C2型心肌細胞損傷，并且對受損細胞的保護作用在一定范圍內隨Met濃度的增加而增強。另外，本實驗對藥物的作用機制進一步研究發(fā)現(xiàn)，Met能夠顯著增強受損細胞p-AMPK的蛋白表達，與Met濃度增加呈正相關。這也證實了飽和脂肪酸誘導的細胞損傷可以通過AMPK通路的激活而減輕[6]，繼而增加脂肪酸氧化分解，減少由NF-κB介導的免疫反應、炎癥反應與細胞凋亡，使細胞黏附因子和趨化因子表達降低。

綜上所述，激活AMPK通路很可能是Met對飽和脂肪酸誘導的心肌細胞損傷保護作用的機制，深入探討其機制，有助于證實Met在高脂肪酸血癥時對心肌細胞的保護作用，對臨床上血脂異常癥患者降低心血管事件的發(fā)生率及受損心肌組織的恢復提供了新的思路。

[1]王小芳，張金盈，趙曉燕，等．二甲雙胍對原代心肌細胞凋亡的影響[J]．臨床心血管病雜志，2013，26(4)：1001-1439．

[2]李利，方強．核因子-κB的結構和功能研究及與全身炎癥反應綜合征的關系[J]．國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊)，2005，26(11)：792-794．

[3]Xu W,Deng YY,Yang L,et al.Metformin ameliorates the proinflammatory state in patients with carotid artery atherosclerosis through sirtuin 1 induction[J].Transl Res,2015,166(5):451-458.

[4]宋娜娜，丁文惠．二甲雙胍心血管保護效應的研究進展[J]．中國糖尿病雜志，2013，21(12)：1140-1141．

[5]Ghosh S,Lakshmanan AP,Hwang MJ,et al.Metformin improves endothelial function in aortic tissue and microvascular endothelial cells subjected to diabetic hyperglycaemic conditions[J].Biochem Pharmacol,2015,98(3):412-421.

[6]程瑩，母義明，汪保安，等．激活的一磷酸腺苷活化蛋白激酶對軟脂酸誘導的血管內皮細胞損傷的保護作用[J]．第二軍醫(yī)大學學報，2006，27(9)：957-960．

[7]張治宇，趙彤，袁志忠，等．飽和脂肪酸致乳鼠心肌細胞損傷凋亡的代謝機制[J]．心臟雜志，2009，21(5)：652-656．

[8]Wang C,Liu C,Gao K,et al.Metformin preconditioning provide neuroprotection through enhancement of autophagy and suppression of inflammation and apoptosis after spinal cord injury[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,477(4):534-540.

[9]Pennanen P,Syvül H,Blüuer M,et al.The effects of metformin and simvastatin on the growth of LNCaP and RWPE-1 prostate epithelial cell lines[J].Eur J Pharmacol,2016,788(2):160-167.

[10]Tzanavari T,Varela A,Theocharis S,et al.Metformin protects against infection-induced myocardial dysfunction[J].Metabolism,2016,65(10):1447-1458.

[11]Bosamirjanic-Azaric B,Rizzo M,LjubomirSormaz,et al.Atorvastatin in stable angina patients lowers CCL2 and ICAM1 expression:Pleiotropic evidence from plasma mRNA analyses[J].Clin Biochem,2013,46(15):1526-1531.

[12]Yan S,Zhang X,Zheng H,et al.Clematichinenoside inhibits VCAM-1 and ICAM-1 expression in TNF-α-treated endothelial cells via NADPH oxidase-dependent IκB kinase/NF-κB pathway[J].Free Radic Biol Med,2015,78(3):190-201.

Protective effect of metformin on H9C2 rat myocardial cell damage induced by saturated fatty acid*

ZhangXiao1，ZhangHongming2△,LiuDanan1▲,LiXiaoyan2

(1.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;2.GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan,Shandong250031,China)

Objective To investigate the mechanisms of metformin (Met) for protecting H9C2 myocardial cells damage induced by saturated fatty acids (palmitic acid,PA) in rats.Methods Rat H9C2 myocardial cell lines in blank control group,PA group and three different concentrations of metformin and PA combination groups were cultured for 24 h.Then Western blot was adopted to detect the protein expression of nuclear factor κB p65 (NFκB p65),intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM1),phosphorylated inhibitor of nuclear factor κB (p-IκBα) and phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase(p-AMPK);the quantitative real-time PCR(qRT-PCR) was used to detect the mRNA expression of nuclear factor of nuclear factor κB(NFκB),chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) andintercellular cell adhesion molecule-1(ICAM1).Results Compared with the control groups,the protein expression of NFκB p65,p-IκBα and ICAM1 in the PA group was increased (P<0.05);compared with the PA group,the protein expression of NFκB p65,IκBα and ICAM1 in the Met+PA combination groups was decreased in various degrees with the Met concentration increase (allP<0.05),while the protein expression of p-AMPK was significantly risen with the Met concentration increase (allP<0.05).Compared with the control group,the mRNA expression of CCL2 and ICAM1 in the PA group was increased (P<0.05);compared with the PA group,the mRNA expression of CCL2 and ICAM1 in the Met+PA combination groups was decreased (P<0.05).Conclusion Met can alleviate H9C2 myocardial cellular damage caused by saturated fatty acid inducing increase of CCL2 and ICAM1 expression.

metformin;NF-Kappa B;chemokine;adenosine activated protein kinase

全軍后勤科研重大項目(AWS13C008)。 作者簡介:張驍(1990-)，碩士，主要從事高血壓、高血脂機制的病理生理研究?！?/p>

，E-mail：13295416075@163.com?！ㄐ抛髡撸珽-mail:liudanau2000@sina.com。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.002

R542.2

A

1671-8348(2017)20-2741-03

2017-02-05

2017-04-10)