劉志武,姚立瓊,徐騰飛,賈永娟,趙多愛,田文成,汪曉強

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，蘭州 730000；2.蘭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，蘭州 730046；3.金昌市第一人民醫(yī)院檢驗科，甘肅金昌 737109；4.張掖市中醫(yī)院檢驗科，甘肅張掖 734000；5.康樂縣人民醫(yī)院檢驗科，甘肅臨夏 731500)

·調(diào)查研究·

甘肅地區(qū)碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)NDM-1型碳青霉烯酶情況分析

劉志武1,姚立瓊1,徐騰飛1,賈永娟2,趙多愛3,田文成4,汪曉強5

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，蘭州 730000；2.蘭州市第一人民醫(yī)院檢驗科，蘭州 730046；3.金昌市第一人民醫(yī)院檢驗科，甘肅金昌 737109；4.張掖市中醫(yī)院檢驗科，甘肅張掖 734000；5.康樂縣人民醫(yī)院檢驗科，甘肅臨夏 731500)

目的 調(diào)查研究甘肅地區(qū)產(chǎn)NDM-1型碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌現(xiàn)狀,為臨床感染防控提供依據(jù)。方法 收集甘肅地區(qū)8家醫(yī)院2015年至2016年臨床分離的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌65株，采用Vitek 2 Compact細(xì)菌鑒定儀鑒定到種,K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗,E-test法檢測碳青霉烯類藥物最低抑菌濃度(MIC)值，采用改良Hodge、E-test法測金屬酶和改良碳青霉烯類滅活試驗(mCIM)篩選blaNDM-1基因耐藥表型,PCR特異性擴(kuò)增blaNDM-1基因,并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序和BLAST比對分析。結(jié)果 65株實驗菌株中有39株在280 bp處擴(kuò)增出blaNDM-1基因目的條帶,經(jīng)測序和陽性結(jié)果比對證實為blaNDM-1基因，其陽性率為60%；65株實驗菌改良Hodge、E-test金屬酶和mCIM試驗陽性率分別為75.38%、70.77%、98.46%；39株blaNDM-1基因陽性腸桿菌科細(xì)菌改良Hodge、E-test金屬酶和mCIM試驗陽性率分別為74.36%、100%、100%。結(jié)論 甘肅地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌blaNDM-1基因檢出率較高,醫(yī)院應(yīng)加強防控。

甘肅；碳青霉烯酶；blaNDM-1；腸桿菌科

新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)是一種新的β內(nèi)酰胺酶，該酶可以水解單環(huán)類以外的一大類β-內(nèi)酰胺類抗生素。巰基化合物、EDTA及菲咯啉等絡(luò)合劑可抑制這類金酶的活性。但常見的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如舒巴坦、克拉維酸不能抑制其活性[1]。目前,含此酶的細(xì)菌往往廣譜耐藥,除對替加環(huán)素和多黏菌素仍敏感外,幾乎對所有抗生素耐藥[2],尤其對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥，給臨床抗感染治療帶來重大困難。本研究對甘肅地區(qū)碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行blaNDM-1基因檢測,了解blaNDM-1基因的流行情況,為臨床治療和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集甘肅地區(qū)2015年至2016年8家醫(yī)院(三級醫(yī)院4家、二級醫(yī)院4家)患者標(biāo)本中分離出的碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌共65株,按照美國臨床實驗室和標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)M100-S27指南[3]判讀,即亞胺培南、美羅培南抑菌圈直徑≤19 mm,厄他培南抑菌圈直徑≤18 mm,滿足任一條件即為試驗菌株，剔除同一患者的重復(fù)菌株，包括大腸埃希菌12株、肺炎克雷伯菌20株、陰溝腸桿菌21株、弗勞地檸檬酸桿菌7株、產(chǎn)酸克雷伯菌5株；標(biāo)本來源包括痰39株、血液6株、膽汁5株、尿液6株、引流液4株、膿液2株、胸腹水3株。陽性對照菌株為我院2010年分離的1株產(chǎn)酸克雷伯菌[4]，經(jīng)測序證實為攜帶blaNDM-1基因，陰性對照菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要試劑及儀器 藥敏紙片(英國Oxoid公司),包括厄他培南、美羅培南、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、氨曲南、氨芐西林/舒巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢西丁、復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢呋辛；厄他培南、美羅培南、亞胺培南及金屬酶E-test條(英國Oxoid公司)； ExTaq Mix及DNA marker 2000(大連寶生物公司)；Vitek 2 Compact全自動細(xì)菌鑒定儀及配套GN鑒定卡(法國生物梅里埃公司)；PCR基因擴(kuò)增儀(美國Perrin Elmer公司)；Quantity-one凝膠掃描成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；DYY-m電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 菌株鑒定及藥敏 所有實驗菌株全部采用Vitek 2 Compact全自動鑒定儀鑒定到種；K-B紙片擴(kuò)散法測定抗菌藥物抑菌圈直徑；E-test法測定厄他培南、亞胺培南、美羅培南的最小抑菌濃度(MIC)，根據(jù)CLSI M100-S27標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀,亞胺培南、美羅培南最低抑菌濃度(MIC)≥4 μg/mL,厄他培南最低抑菌濃度(MIC)≥2 μg/mL,符合任一條件即可判定碳青霉烯類耐藥。

1.4 改良Hodge試驗[3]根據(jù)CLSI 2017版M100S-27指南推薦的方法，調(diào)0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝淮竽c埃希菌ATCC 25922,稀釋10倍后均勻涂于M-H平板,平板中間貼厄他培南(10 μg)紙片,自紙片外緣向平板邊緣劃線接種待檢菌,35 ℃培養(yǎng)24 h，待測菌株與大腸埃希菌ATCC 25922抑菌圈交匯處大腸埃希菌生長增強即為產(chǎn)碳青霉烯酶陽性菌株。

1.5 E-test法測金屬酶 將實驗菌懸液調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝?無菌棉簽均勻涂抹M-H平板,金屬酶E-test條貼M-H平板中央,35 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果,如亞胺培南/(亞胺培南+EDTA)的MIC比值≥8,判為金屬酶陽性。

1.6 改良碳青霉烯類滅活試驗(modified carbapenem inactivation method, mCIM)[5]挑取實驗菌株1 μL加入2 mL肉湯中,混勻后加入10 μg美羅培南紙片溫育4 h,大腸埃希菌ATCC 25922使用生理鹽水調(diào)0.5麥?zhǔn)蠞岫葐挝煌磕ǖ組-H平板,將肉湯中美羅培南紙片取出,貼于涂抹大腸埃希菌ATCC 25922的M-H平板中間,35 ℃培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，抑菌圈直徑≤15 mm為陽性。

1.7blaNDM-1基因檢測 用煮沸法提取細(xì)菌DNA,并測純度和濃度,PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。按文獻(xiàn)[6]設(shè)計引物,引物由大連寶生物公司合成,上游引物:5′-CAGCACACTTCCTATCTC-3′,下游引物:5′-CCGCAACCATCCCCTCTT-3′,產(chǎn)物長度292 bp。PCR反應(yīng)體系[7]共50 μL,包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL,10×PCR緩沖液5 μL,dNTP混合物4 μL,DNA模板1 μL,Taq酶0.25 μL,加滅菌蒸餾水補足至50 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延長1 min,共35個循環(huán)；72 ℃延長10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。PCR產(chǎn)物測序送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司完成,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，確認(rèn)基因型。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 K-B法藥敏結(jié)果顯示，阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素對65株實驗菌株的敏感性為90.1%、56.8%、51.4%、41.6%,其余抗菌藥物幾乎全部耐藥。E-test法檢測亞胺培南、美羅培南、厄他培南MIC值與K-B法結(jié)果一致,均為碳青霉烯類耐藥。

2.2 PCR檢測blaNDM-1基因結(jié)果 65株碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌blaNDM-1基因特異性引物擴(kuò)增后，電泳結(jié)果顯示39株在280 bp處可見明顯條帶，與陽性對照結(jié)果一致，部分PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后經(jīng)基因測序證實為blaNDM-1基因序列。

注: M,DNA marker；1～15,試驗菌株；16,陽性對照；17,陰性對照。

圖1 部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 改良Hodge、E-test法測金屬酶和mCIM試驗結(jié)果 65株碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌中有49株改良Hodge試驗陽性,陽性率為75.38%(49/65)；46株E-test金屬酶試驗陽性,陽性率為70.77%(46/65)；63株mCIM試驗陽性,陽性率為98.46%(64/65)。39株產(chǎn)blaNDM-1基因陽性菌株中，包括大腸埃希菌7株(17.9%)、肺炎克雷伯菌11株(28.2%)、陰溝腸桿菌14株(35.9%)、弗勞地檸檬酸桿菌5株(12.8%)、產(chǎn)酸克雷伯菌2株(5.1%)。其中，29株改良Hodge試驗陽性,陽性率為74.36%(29/39),E-test金屬酶試驗及mCIM試驗陽性率為100%(39/39)。

3 討論

本研究對臨床分離65株碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行blaNDM-1基因檢測,檢測出39株陽性,全部來自三級綜合醫(yī)院,二級醫(yī)院未發(fā)現(xiàn)陽性菌株,陽性率為60%,其余26株blaNDM-1基因陰性菌株耐藥機制尚未檢測,有待進(jìn)一步研究。陽性菌株患者信息顯示,危重患者、重大術(shù)后患者、腎病、血液病等老幼體質(zhì)較弱患者容易感染,具體機制尚不清楚。

藥敏結(jié)果顯示，65株實驗菌株均呈多重耐藥,除阿米卡星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素敏感性為90.1%、56.8%、51.4%、41.6%以外,其余抗菌藥物幾乎全部耐藥,尤其包括亞胺培南、美羅培南在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類、氨曲南、復(fù)方磺胺甲噁唑和呋喃妥因等藥物呈高水平耐藥,建議臨床輕、中度感染根據(jù)藥敏結(jié)果選擇抗菌藥物使用,對于重度感染者建議按文獻(xiàn)推薦藥物進(jìn)行治療,如替加環(huán)素聯(lián)合氨基糖苷類、替加環(huán)素聯(lián)合磷霉素、替加環(huán)素聯(lián)合多黏菌素等。但替加環(huán)素和多黏菌素臨床治療效果相關(guān)的文獻(xiàn)較少,建議臨床根據(jù)治療效果不斷調(diào)整治療方案。

65株實驗菌株改良Hodge、E-test金屬酶和mCIM試驗陽性率分別為75.38%、70.77%、98.46%；39株攜帶blaNDM-1基因的腸桿菌科細(xì)菌改良Hodge、E-test金屬酶和mCIM試驗陽性率分別為74.36%、100%、100%。改良Hodge和mCIM試驗檢測碳青霉烯酶,研究結(jié)果顯示mCIM試驗篩選產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌比改良Hodge試驗表現(xiàn)出較高的靈敏度,在一定程度上提高了KPC、NDM、OXA型等碳青霉烯酶檢出率。而E-test法檢測金屬酶。沒有哪一種表型試驗可完全檢測出所有碳青霉烯酶,因此建議臨床實驗室選擇mCIM聯(lián)合E-test金屬酶試驗檢測碳青霉烯酶及其金屬酶。

本研究證實甘肅地區(qū)腸桿菌科細(xì)菌blaNDM-1基因檢出率較高，主要在綜合性三級醫(yī)院部分科室局部流行,尤其以重癥監(jiān)護(hù)室較為突出,臨床及醫(yī)院感染管理部門應(yīng)高度重視并采取相應(yīng)措施,及時做好blaNDM-1基因的檢測工作。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.07.20

甘肅省青年基金(1506RJYA261)。

劉志武，1983年生，男，主管技師，大學(xué)本科，從事臨床微生物檢驗工作，E-mail: 375301519@qq.com。

R446.5

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2017-05-03)