周艷，曹頂國

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250023)

雞miR NA的研究進(jìn)展*

周艷，曹頂國**

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心，山東濟(jì)南250023)

miRNA(microRNA)是一類非編碼的、長(zhǎng)度約為21～26nt的單鏈小分子RNA。miRNA廣泛存在于真核生物中，序列特異、高度保守。近來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA廣泛參與有機(jī)體各個(gè)生物學(xué)過程，本文就miRNA的發(fā)現(xiàn)、作用機(jī)制以及在雞生長(zhǎng)發(fā)育、生殖以及疫病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 miRNA發(fā)現(xiàn)

1993年，VictorAmbros,ColleaguesRosalind Lee和Rhonda Feinbaum首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)lin-4，其產(chǎn)生2個(gè)小RNA轉(zhuǎn)錄本。一個(gè)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度約22nt，另外一個(gè)約61nt。通過與Lin-14基因3' UTR的互補(bǔ)序列結(jié)合從而調(diào)控lin-14的表達(dá)[1-2]。Reinhart BJ.等(2000)在線蟲中發(fā)現(xiàn)let-7編碼21核苷酸RNA，并且在lin-14、lin-28、lin-41、lin-42 and daf-12基因3'UTR有互補(bǔ)元件，同lin-4一樣對(duì)線蟲發(fā)育具有時(shí)空調(diào)節(jié)作用[3]。隨后Lagos-Quintana等[4]Lau等[5]、Lee and Ambros[6]于2001年分別發(fā)表了在果蠅、人和蠕蟲中發(fā)現(xiàn)的大約20個(gè)、30個(gè)和60個(gè)大量表達(dá)的、類似lin-4和let-7長(zhǎng)度的小RNAs，稱之為microRNA(miRNA)。

現(xiàn)代分子技術(shù)尤其是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)以及生物信息學(xué)的發(fā)展，為miRNA的研究提供了前所未有的平臺(tái)，大量的成熟miRNAs和前體小RNA被鑒定出來。2014年6月，miRBase數(shù)據(jù)庫正式發(fā)布了21.0版本，包含223個(gè)物種的35828條成熟miRNA信息。與20.0版本相比更新了大量的數(shù)據(jù)，miRNAs發(fā)夾前體序列新增4196條，成熟miRNAs新增5441條，包括17個(gè)物種的第一個(gè)miRNAs。169條發(fā)夾前體序列和353條成熟序列更新名稱。72條錯(cuò)誤注釋和重復(fù)序列被刪除。其中雞[Gallus gallus]發(fā)夾前體miRNAs序列達(dá)740條，成熟miRNAs序列994條，部分物種的miRNA數(shù)見表1。

表1 部分物種的miRNA種類數(shù)

2 miRNA的特征

miRNA一般具有以下幾個(gè)特征：①長(zhǎng)度通常在21～26nt；②是內(nèi)源性、非編碼的小RNA分子，不具有開放閱讀框；③成熟miRNA的序列在鄰近物種甚至不同物種間具有高度進(jìn)化保守性[4,7]；④廣泛存在于真核生物中，表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)空性[8-9]；⑤成熟miRNA都是由長(zhǎng)度為60～80nt、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體經(jīng)過Dicer酶剪切加工而來[10-11]。

3 miRNA的作用機(jī)制及功能

miRNA通過與靶基因3'UTR上存在的不完全或者完全互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合來抑制靶基因的翻譯或降解靶mRNA[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在靶基因的5'端或者編碼區(qū)也存在miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，而且miRNA對(duì)靶基因的作用不僅限于翻譯抑制和降解，在某些情況下可能對(duì)靶基因的翻譯和轉(zhuǎn)錄起正調(diào)控作用。已有研究表明miRNA主要與細(xì)胞增殖[14]、凋亡[15-16]、神經(jīng)發(fā)育[17]、造血過程[18-19]，以及與人類的某些疾病如癌癥[20-21]、心血管病[22-23]等相關(guān)。

4 雞miRNA的相關(guān)研究

作為重要調(diào)控因子，miRNA在家禽中的功能研究也成為熱點(diǎn)，已有研究表明其在雞生長(zhǎng)發(fā)育、生殖、疫病等重要生物學(xué)過程均發(fā)揮重要作用。

4.1 miRNA與雞生長(zhǎng)發(fā)育miRNA廣泛參與雞胚早期生長(zhǎng)、發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化等一系列生命過程。2006年，Darnell等采用高通量原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)在雞胚器官形成過程中有部分miRNAs表達(dá)快速上調(diào)[24]。2008年，Glazov等[25]和Hicks等[26]均構(gòu)建了雞胚不同發(fā)育時(shí)間段的miRNAs文庫，分別新發(fā)現(xiàn)了449個(gè)和14個(gè)新的miRNAs。除了在雞胚生長(zhǎng)中發(fā)揮作用外，Hicks等(2009)進(jìn)一步研究了miRNAs在雞免疫器官形成中的作用，證實(shí)miRNAs與法氏囊和淋巴細(xì)胞發(fā)育分化有關(guān)[27]。此外，miRNAs被發(fā)現(xiàn)在雞骨骼肌、胸肌生長(zhǎng)和脂肪沉積中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Li等(2011)研究了蛋雞和肉雞骨骼肌中miRNAs的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)miRNAs在蛋雞和肉雞的骨骼肌中差異表達(dá)，這些miRNAs的部分靶基因與肌肉形成有關(guān)[28]。Lin等(2012)年比較了矮小型雞和正常雞的骨骼肌中的miRNAs表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-1623,miR-181b，let-7b和miR-128的表達(dá)量存在差異，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)let-7b通過與生長(zhǎng)激素受體基因(GHR)的3'端結(jié)合，調(diào)控GHR的表達(dá)。細(xì)胞因子信號(hào)3基因(SOCS3)通過let-7b介導(dǎo)GHR的表達(dá)，對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)和脂肪沉積發(fā)揮重要的調(diào)控作用[29]。Ouyang H等（2015）比較了隱性白洛克雞和杏花雞胸肌中的miRNAs表達(dá)，共發(fā)現(xiàn)921個(gè)miRNAs、miR-34c、miR-223、miR-146b-3p、miR-21和miR-205a被認(rèn)為是調(diào)控雞生長(zhǎng)的功能miRNAs[30]。

4.2 miRNA與雞性別分化及卵巢卵泡發(fā)育近來研究表明，多個(gè)miRNAs參與雞早期性腺發(fā)育和性別分化及卵巢卵泡發(fā)育等生殖相關(guān)的生物學(xué)過程。Bannister等(2009)采用基因芯片研究發(fā)現(xiàn)MIR202*在雞胚睪丸發(fā)育過程中表達(dá)上調(diào)[31]。隨后其采用雌激素誘導(dǎo)的性別轉(zhuǎn)換模型再次表明，MIR202*表達(dá)下調(diào)，則導(dǎo)致睪丸相關(guān)基因DMRT1和SOX9表達(dá)下調(diào)，卵巢相關(guān)基因FOXL2和CYP19A1(aromatase)表達(dá)上調(diào)。相反，MIR202*表達(dá)上調(diào)，則導(dǎo)致睪丸相關(guān)基因DMRT1和SOX9表達(dá)上調(diào)，卵巢相關(guān)基因FOXL2和CYP19A1 (aromatase)表達(dá)下調(diào)，證明MIR202*表達(dá)上調(diào)與雞胚性腺分化和睪丸發(fā)育過程一致[32]。此外ggamiR-363[33]和gga-miR-551b和gga-miR-1599[34]都被發(fā)現(xiàn)可能涉及早期雞胚性腺發(fā)育過程。Cutting等(2012)也發(fā)現(xiàn)miR-101在公雞中高表達(dá)，但是在性腺分化后的母雞中表達(dá)顯著增加[35]。此外，多個(gè)miRNAs被鑒定參與雞卵巢卵泡發(fā)育，Kang等(2013)采用Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)對(duì)雞性成熟前后卵巢中的miRNAs進(jìn)行了鑒定，獲得了203個(gè)在雞卵巢表達(dá)的miRNAs，其中有93個(gè)在性成熟前后的卵巢中表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)[36]。本課題組采用Illumina Solexa測(cè)序方法分析高、低汶上蘆花雞個(gè)體卵巢組織中差異表達(dá)的miRNAs。以低產(chǎn)雞卵巢為對(duì)照，在高產(chǎn)雞卵巢中共篩選到72個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中13個(gè)表達(dá)上調(diào)，59個(gè)表達(dá)下調(diào)[37]。

4.3 miRNA與雞疫病發(fā)生作為功能廣泛的調(diào)控因子，miRNAs在雞馬立克氏病、禽流感、支原體、法氏囊等疾病發(fā)生過程中同樣發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Burnside等(2008)采用深度測(cè)序技術(shù)分別檢測(cè)了馬立克氏病毒(MDV)感染的和未感染的雞胚胎成纖維細(xì)胞(CEF)的miRNAs表達(dá)量，結(jié)果表明let-7和miR-199a-1等miRNAs在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)[38]。Lian等(2012)發(fā)現(xiàn)在MDV感染的腫瘤脾臟和肝臟淋巴瘤中，gga-miR-181a、gga-miR-26a、gga-miR-221、gga-miR-222、gga-miR-199*和gga-miR-140*表達(dá)下調(diào)，gga-miR-146c表達(dá)上調(diào)[39]。2015年，Li等證實(shí)gga-miR-26a靶向NEK6抑制MDV細(xì)胞增殖[40]。隨后gga-miR-130a[41]和gga-miR-219b[42]分別被發(fā)現(xiàn)通過靶基因抑制MDV細(xì)胞增殖。

Wang等(2012)研究了禽流感病毒(AIV)感染的肉雞肺部的miRNAs表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)108個(gè)在AIV感染的肺部高表達(dá)，而只有13個(gè)在對(duì)照中高表達(dá)，該結(jié)果與蛋雞中的趨勢(shì)相反，因此蛋雞和肉雞中關(guān)于AIV感染的宿主免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制可能不同。多重比較分析結(jié)果表明，gga-miR-34a、122-1、122-2、146a、155、206、1719、1594和1599是肉雞肺部AIV感染的宿主免疫應(yīng)答調(diào)控的重要候選miRNAs[43]。Peng等2015研究了感染和非感染H9N2雞胚成纖維細(xì)胞中的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了48個(gè)差異表達(dá)miRNAs，其中g(shù)ga-miR-146c、gga-miR-181a、gga-miR-181b、gga-miR-30b、gga-miR-30c、gga-miR-30e和gga-miR-455被發(fā)現(xiàn)在其他類型的禽流感病毒感染的細(xì)胞中也差異表達(dá)[44]。在A549細(xì)胞中，miR-584-5p和miR-1249被發(fā)現(xiàn)下調(diào)PB2的表達(dá)從而抑制H5N1和H1N1的復(fù)制[45]。Zhao等（2017）發(fā)現(xiàn)gga-miR-99a通過靶向SMARCA5在雞支原體感染中發(fā)揮重要作用[46]。歐陽偉等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，在傳染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒感染的CEF中，有17個(gè)表達(dá)上調(diào)，17個(gè)表達(dá)下調(diào)，在IBDV強(qiáng)毒感染雞法氏囊組織細(xì)胞中，30個(gè)表達(dá)上調(diào)，18個(gè)表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明，IBDV感染可導(dǎo)致內(nèi)源性miRNAs表達(dá)發(fā)生變化，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種代謝和信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)生異常，引起細(xì)胞及組織器官發(fā)生病理學(xué)變化[47]。ggamiR-2127也被發(fā)現(xiàn)通過下調(diào)雞p53調(diào)控IBDV天然免疫反應(yīng)[48]。

5 展望

雞miRNA研究的廣泛開展使人們對(duì)其功能和發(fā)揮的作用有了更多的認(rèn)識(shí)和理解。但是目前鑒定的miRNA大多局限于與某種生物學(xué)過程相關(guān)或者單一靶基因的鑒定，而一個(gè)miRNA可同時(shí)調(diào)控上百個(gè)基因，一個(gè)基因也可以同時(shí)受到多個(gè)miRNAs的調(diào)控，因此單一調(diào)控關(guān)系鑒定無法準(zhǔn)確闡述其對(duì)生物學(xué)過程的調(diào)控機(jī)制。只有全面深入的解析miRNA多元化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，才能更好的闡明其在雞重要經(jīng)濟(jì)性狀中發(fā)揮的調(diào)控作用，而這也將是下一步的研究重點(diǎn)。

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([33-48]參考文獻(xiàn)省略，如有需要請(qǐng)聯(lián)系本編輯部。)

Q753

A

1673-1085（2017）08-0050-04

2017-07-19

山東省自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZR2014CZ003）；山東省自然基金（ZR2014YL024）；山東省農(nóng)科院青年基金（2014QNM14）。

周艷（1979-），女，漢，山東新泰人，副研究員，博士，主要研究方向：家禽遺傳育種。

**通訊作者：曹頂國(1973-)，男，漢，山東嘉祥人，研究員，主要研究方向：家禽遺傳育種，Email：cdgjqs@163.com。