胡 靜 ， 韓彩霞 ， 趙 祥 ， 孟 詩 ， 張 妍 ， 李 瑩 ， 李 成 ， 李曉云 ， 宋銘忻

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

小鼠感染旋毛蟲后部分組織器官中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA表達(dá)的監(jiān)測

胡 靜 ， 韓彩霞 ， 趙 祥 ， 孟 詩 ， 張 妍 ， 李 瑩 ， 李 成 ， 李曉云 ， 宋銘忻

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

應(yīng)用熒光定量PCR方法，對感染旋毛蟲小鼠的小腸、肺臟、心臟和肌肉中NOD1受體及其信號(hào)傳導(dǎo)通路中接頭分子RIP2和下游分子NF-κB mRNA表達(dá)水平進(jìn)行監(jiān)測。結(jié)果在小腸和心臟中，旋毛蟲感染不同時(shí)期各目的基因表達(dá)量都有升高，分別于感染后4 d和14 d達(dá)到峰值，與對照組比均有極顯著差異(P<0.01)。在肺臟中，NOD1 mRNA表達(dá)量僅在感染后7 d略升高，而RIP2的mRNA表達(dá)量在不同感染期均升高，于感染后4 d達(dá)到峰值，與對照組比有極顯著差異(P<0.01)。在肌肉中，各目的基因在感染初期表達(dá)量變化不明顯，而于感染后21 d mRNA表達(dá)量明顯升高，28 d達(dá)到高峰，與對照組比有極顯著差異(P<0.01)。表明旋毛蟲感染對小鼠的小腸、心臟、肺臟和肌肉中NOD1、RIP2和NF-κB的表達(dá)水平均有不同程度的影響，這與旋毛蟲在宿主體內(nèi)移行途徑和不同寄生階段及其產(chǎn)生的各類抗原密切相關(guān)。

旋毛蟲 ； NOD1受體 ； 組織 ； 熒光定量PCR

旋毛蟲病是由旋毛蟲引起的一種重要的食源性人獸共患線蟲病。旋毛蟲可通過產(chǎn)生的各類抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，從而危害宿主健康。天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原體的第一道防線。NOD1受體是一種重要的天然免疫受體，廣泛存在于多種細(xì)胞和組織中[1-2]。一般認(rèn)為NOD1受體被病原體激活后可引起自身寡聚化，并通過N末端的CARD-CARD結(jié)構(gòu)域相互作用激活下游的受體相互作用蛋白2(Receptor interacting protein2，RIP2)，RIP2能夠激活Caspase-1、MAPKs、NF-κB等信號(hào)通路，誘導(dǎo)炎性因子TNF-α、IL-1β和趨化因子IL-18等分泌，引起一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)[3-4]。已有研究顯示，NOD1受體參與了許多病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲的免疫應(yīng)答[5-6]。而NLRs在旋毛蟲感染中的研究未見報(bào)道。

因此，為了研究旋毛蟲感染對小鼠NOD1-RIP2-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，本試驗(yàn)應(yīng)用熒光定量PCR方法對旋毛蟲感染不同時(shí)期小鼠的小腸、心臟、肺臟、肌肉中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA的表達(dá)量進(jìn)行相對定量分析，從而進(jìn)一步探討旋毛蟲感染與宿主免疫系統(tǒng)之間的相互作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及蟲種 黑龍江豬旋毛蟲蟲株由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存，2月齡昆明系小鼠，購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑和器材 rTag聚合酶、EcorI、HindIII、pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、TRIZol、MLV和RRI，均購自寶生物工程(大連)有限公司；提質(zhì)粒、膠回收試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Forma Scientific型超凈臺(tái)為上海博遜實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；7500熒光定量PCR儀為ABI公司產(chǎn)品；PCR儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 感染旋毛蟲小鼠小腸、心臟、肺臟、肌肉組織分離及樣品處理 將旋毛蟲肌幼蟲經(jīng)口感染小鼠，劑量為500蚴/只，對照組小鼠口服生理鹽水。旋毛蟲于感染后0.5、4、7、14、21、28 d和35 d分別從對照組和試驗(yàn)組中隨機(jī)取5只小鼠，脫頸處死后，在超凈工作臺(tái)中取其小腸、心臟、肺臟和肌肉，用DEPC配置的生理鹽水沖洗干凈，剪成約0.1 g小樣，濾紙吸干后，置凍存管中，于液氮中速凍后，用TRIZol法提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置-80 ℃保存?zhèn)溆肹7]。

1.4 熒光定量PCR方法的建立

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上登陸的小鼠NOD1 mRNA參考序列(登錄號(hào)：NM_001171007.1)、RIP2 mRNA參考序列(登錄號(hào)：NM_138952.3)、NF-κB mRNA參考序列(登錄號(hào)：NM_008689.2)和GAPDH mRNA參考序列(登錄號(hào)：NM_008084.3)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，應(yīng)用Oligo 7.0軟件分析引物特異性。NOD1基因上游引物：5′-CCTTGCTTTAGCCGTCTCAC-3′，下游引物：5′-CCCGCCCTCACTTGTTATT-3′；RIP2基因上游引物：5′-GCTGGGATGGTATCGTTT-3′，下游引物5′-GTCCTTGTAGGTTTGGTGC-3′；NF-κB基因熒光定量上游引物：5′-TGGAGGCATGTTCGGTAGTGG-3′，下游引物：5′-GGCGATGGGTTCCGTCTTG-3′；GAPDH基因上游引物：5′-CCAGCCTCGTCCCGTAGACA-3′，下游引物：5′-ATACTCAGCACCGGCCTCACCC-3′；。預(yù)期擴(kuò)增片段分別為231 bp、274 bp、298 bp和289 bp。上述引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建 以小鼠cDNA為模板用PCR方法擴(kuò)增1.4.1中各目的基因片段，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，將驗(yàn)證正確的PCR產(chǎn)物回收純化，連接在pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于37 ℃溫箱培養(yǎng)12 h后，將PCR和雙酶切鑒定正確的克隆菌液送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序，并利用生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對。陽性菌液使用全式金柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測定質(zhì)粒的濃度，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒10倍稀釋5個(gè)濃度。反應(yīng)條件為： 95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL，SYBRRPremixExTaqII(Tli RnaseH Plus)10 μL，上下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，稀釋后的模板0.5 μL，ddH2O 8.1 μL。并以起始模板質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度(lg)為X軸，獲得的Ct值為Y軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過熔解曲線情況分析引物特異性，并計(jì)算擴(kuò)增效率。

1.5 待測樣品NOD1、RIP2和NF-κB mRNA表達(dá)水平的測定 將各組樣品反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA作為模板，對各組樣品中的相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行測定，得到待測樣品的Ct值。△△Ct法計(jì)算目的基因的表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用EXCEL、ABI7500Fast、SPSS 21.0和GraphPad Prism 5對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量PCR檢測NOD1、RIP2、NF-κB和GAPDH mRNA表達(dá)水平方法建立

2.1.1 目的基因片段的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增NOD1、RIP2、NF-κB和GAPDH目的基因片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測各目的條帶與預(yù)期大小相符。目的片段經(jīng)克隆后，菌液送去測序，結(jié)果用DNAMAN序列比對分析，大小分別為231 bp、274 bp、298 bp和289 bp，與目的基因大小相符。將各目的基因片段測序正確的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，PCR擴(kuò)增，紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒的濃度。

2.1.2 NOD1、RIP2、NF-κB和GAPDH熒光定量PCR檢測方法的建立 分別以目的基因重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。結(jié)果表明，NOD1、RIP2、NF-κB和GAPDH熔解曲線峰值單一，說明引物特異性良好。應(yīng)用ABI7500Fast熒光定量PCR儀進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，根據(jù)其模板數(shù)與Ct值之間存在的線性關(guān)系(y代表Ct值；x代表起始模板數(shù))，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，直線回歸方程分別如下：y=-3.360x+14.639(R2=1)，y=-3.375x+14.720(R2=1)，y=-3.329x+13.622(R2=1)和y=-3.269x+11.890(R2=0.999)。研究結(jié)果顯示，各目的基因相關(guān)系數(shù)都在0.99～1之間，擴(kuò)增效率均在0.8～1.2之間，可以用△△Ct進(jìn)行相對定量分析，見圖 1～4。

圖1 NOD1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 RIP2基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 NF-κB基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 GAPDH基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 旋毛蟲感染小鼠不同時(shí)期的小腸、心臟、肺臟和肌肉中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA表達(dá)量測定 研究結(jié)果表明，旋毛蟲感染小鼠不同時(shí)期的小腸、心臟、肺臟和肌肉中，NOD1、RIP2和N-F-κB mRNA相對表達(dá)量與對照組相比，總體均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。小腸中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA的表達(dá)量，都于感染后0.5 d升高，4 d達(dá)到峰值，分別約為對照組1.7倍、2.4倍和3.1倍，其后呈下降趨勢。心臟中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA的表達(dá)量，于感染后0.5 d開始逐漸升高，都于14 d達(dá)到最高，分別約為對照組的2.3倍、3.8倍和2.0倍，其后呈下降狀態(tài)。肺臟中NOD1和RIP2 mRNA相對表達(dá)量，于感染后0.5 d逐漸升高，分別于7 d和4 d達(dá)最大值，約為對照組1.7倍和2.0倍；而NF-κB mRNA相對表達(dá)量于感染后0.5 d為最高值，約為對照組1.5倍，其后各目的基因相對表達(dá)量呈下降態(tài)勢。肌肉中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA的表達(dá)量，都于感染后0.5 d逐漸上升，21 d開始顯著升高，28 d達(dá)最高峰，分別約為對照組的3.8倍、10倍和7.2倍，而后開始顯著降低。見圖5～8。

3 討論

旋毛蟲經(jīng)口感染后，3～5 d在腸上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)育成可交配的雌雄成蟲，感染后5～7 d，雌蟲開始產(chǎn)出新生幼蟲，而后新生幼蟲隨淋巴液和血液循環(huán)到達(dá)宿主各器官組織，于感染后21 d開始，新生幼蟲陸續(xù)達(dá)到肌肉中并開始形成包囊型肌幼蟲，42 d完全形成包囊，并具感染性[8]。旋毛蟲在移行與寄生過程中，可通過表面抗原、蟲體抗原、桿細(xì)胞顆粒相關(guān)抗原和排泄分泌(ES)抗原與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，而引起宿主的免疫應(yīng)答[9]。

圖5 小腸中各目的基因mRNA相對表達(dá)量

圖6 心臟中各目的基因mRNA相對表達(dá)量

圖7 肺中各目的基因mRNA相對表達(dá)量

圖8 肌肉中各目的基因mRNA相對表達(dá)量

本研究選擇了旋毛蟲感染后主要移行與寄生的器官組織-小腸、心臟、肺臟和肌肉，來探討NOD1受體在旋毛蟲感染中的作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，上述各器官組織中存在NOD1受體，目前研究認(rèn)為，NOD1受體的特異性配體是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的二氨基庚二酸(-D-gly-meso-diaminopimelic acid，iE-DAP)，而本研究結(jié)果提示，旋毛蟲抗原中可能含有與其對應(yīng)的配體，但由于旋毛蟲抗原種類和成分非常復(fù)雜，還不知道旋毛蟲的哪類抗原成分和結(jié)構(gòu)能激活該受體。同時(shí)，由試驗(yàn)結(jié)果可以看出，旋毛蟲感染小鼠后，各器官組織中NOD1、RIP2和NF-κB mRNA表達(dá)量升高降低的變化趨勢與旋毛蟲在宿主體內(nèi)移行途徑和不同寄生階段有關(guān)，這也與旋毛蟲各類抗原在不同器官組織內(nèi)出現(xiàn)的時(shí)間不同相關(guān)。小腸、心臟和肺臟內(nèi)的各目的基因變化在旋毛蟲感染小鼠的早期寄生與移行過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而肌肉內(nèi)的各目的基因變化在旋毛蟲感染后期，即在旋毛蟲肌幼蟲成囊過程中呈現(xiàn)先高后低的態(tài)勢。從上述各器官組織中各目的基因變化趨勢還可看出，旋毛蟲感染先引起宿主免疫增強(qiáng)，后導(dǎo)致出現(xiàn)免疫耐受現(xiàn)象。

以上研究結(jié)果揭示，旋毛蟲感染可通過激活主要器官組織中NOD1-RIP2-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路，而與宿主免疫系統(tǒng)相互作用，并導(dǎo)致宿主出現(xiàn)免疫耐受。但由于旋毛蟲與宿主之間相互作用的復(fù)雜性，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[1] Janeway C A,Medzhitov R. Innate immune recognition[J]. Annu Rev Immunol,2002,20: 197-216.

[2] Inohara N,Koseki T,del Peso L,etal.Nod1,an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB[J]. J Biol Chem,1999,274(21): 14 560-14 567.

[3] Keestra A M,Winter M G,Klein-Douwel D,etal. A Salmonella virulence factor activates the NOD1/NOD2 signaling pathway[J]. M Bio,2011,2(6): e00266-11.

[4] Park J H,Kim Y G,McDonald C,etal. RICK/RIP2 mediates innate respomses induced through Nod1 and Nod2 but not TLRs[J]. J Immunol,2007,178(4): 2 380-2 386.

[5] Loving C L,Osorio M,Kim Y G,etal. Nod1/Nod2-mediated recognition plays a critical role in induction of adaptive immunity to anthrax after acrosol exposure[J]. Infect Immun,2009,77(10): 4 529-4 537.

[6] Cho K A,Jun Y H,Suh J W,etal.Orientiatsutsugamushiinduced endothelial cell activation ria the NOD1-1L-32 pathway[J]. Microb Pathog,2010,49(3): 95-104.

[7] 李曉云,徐佳,李巍,等.感染旋毛蟲小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TLR4及細(xì)胞因子的變化[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2014,36(10): 801-804.[8] Bruschi F.The immune response to the parasitic nematodeTrichinellaand the ways to escape it From experimental studies to implications for human infection[J]. Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord，2002,2(3): 269-80.

[9] 馬鳴旺,申麗潔.旋毛蟲抗原的研究進(jìn)展[J].中國病原生物學(xué)雜志,2008,3(8):631-634.

The monitoring of the mRNA expressions of NOD1,RIP2, NF-κB in mice tissues and organs afterTrichinella spiralis infection

HU Jing , HAN Cai-xia , ZHAO Xiang , MENG Shi , ZHANG Yan , LI Ying , LI Cheng , LI Xiao-yun , SONG Ming-xin

(Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China)

In this study, mRNA expressions of NOD1 receptor, adaptor molecule RIP2 and downstream molecule NF-κB in small intestines, lungs, hearts and muscles of the Trichinella spiralis infected mice were analyzedby fluorescent quantitative PCR. Results indicated that the target gene expressions were significantly (p<0.01)elevated in small intestines and hearts during different phases of Trichinella spiralis infection, reaching peak values at day 4 and day 14 after infection, respectively. In lung, the mRNA expression level of NOD1 was only slightly elevated at day 7 after infection, and mRNA expression level of RIP2 was significantly (P<0.01) elevated at different infection stages, and reached peak value at day 4 after infection. In muscle, the mRNA expression levels of target genes were all significantly increased (P<0.01)at day 21, 28 and 35 after infection, and reached peak value in at day 28. The results show that the expression levels of NOD1, RIP2, and NF-κB in small intestine, lung, heart and muscle of mice are affected by the infection with Trichinella spiralis at different degrees, and all these are closely related with the shift way of Trichinella spiralis in the host and different parasitic stages and all kinds of antigen produced by them.

Trichinella spiralis ； NOD1 receptor ； Tissues ； Fluorescent quantitative PCR

SONG Ming-xin

2016-12-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172312)

胡靜(1990-)，女，碩士，研究方向?yàn)榧纳x病及其分子生物學(xué)，E-mail:249397913@qq.com

宋銘忻，E-mail:songmx@neau.edu.cn

S855.9

A

0529-6005(2017)07-0003-04