唐海波 ， 陳鳳蓮 ， 饒桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 楊 磊 ， 吳健敏

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣西南寧530001)

竹鼠源致病性雷氏普羅威登斯菌的分離鑒定

唐海波 ， 陳鳳蓮 ， 饒桂波 ， 姜佳佳 ， 孟 菲 ， 白安斌 ， 楊 磊 ， 吳健敏

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣西南寧530001)

為確定南寧隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生竹鼠死亡的原因，從發(fā)病的竹鼠肝、肺及腎臟中分離得到2株可疑細(xì)菌, 經(jīng)形態(tài)觀察及16S rRNA 序列分析，鑒定兩株細(xì)菌均為雷氏普羅威登斯菌(Providenciarettgeri)。經(jīng)小鼠回歸試驗(yàn)證實(shí)該分離菌可致死小鼠。測(cè)序結(jié)果顯示，該菌16S rRNA與雷氏普羅威登斯菌(AB680422)同源性高達(dá)99.9%。藥敏試驗(yàn)顯示，對(duì)頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢氨芐等藥物高度敏感；對(duì)青霉素、氯霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等藥物有抗性。這些研究結(jié)果表明，雷氏普羅威登斯菌是隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)竹鼠致死的病原菌。本文在國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道了雷氏普羅威登斯菌對(duì)竹鼠有較強(qiáng)的致病性。

竹鼠 ； 雷氏普羅威登斯菌 ； 分離鑒定

竹鼠，亦稱竹貍、竹根鼠、茅根鼠等，在人工養(yǎng)殖類動(dòng)物中，竹鼠是最耐粗食的經(jīng)濟(jì)類動(dòng)物之一。其體大肉多，營(yíng)養(yǎng)豐富，味道鮮美，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。竹鼠在中國(guó)已被大規(guī)模養(yǎng)殖，成為具有經(jīng)濟(jì)效益的養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一。廣西是我國(guó)竹鼠養(yǎng)殖量最大的省份，廣西桂林、南寧、柳州、河池等地均已建立有竹鼠養(yǎng)殖基地(場(chǎng))。在國(guó)內(nèi)，竹鼠已進(jìn)入西南地區(qū)大中城市和城鎮(zhèn)的消費(fèi)市場(chǎng)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，廣西、廣東、香港、海南、福建、四川、湖南、上海等地每年消費(fèi)竹鼠600多萬只，且需求量以每年3%的速度遞增，全國(guó)竹鼠的生產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)急劇增長(zhǎng)的需要。

作為一項(xiàng)僅發(fā)展10多年的新型養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，竹鼠規(guī)?；B(yǎng)殖起步較晚，馴化時(shí)間不長(zhǎng)，無論在飼養(yǎng)、繁殖還是疫病防控方面均存在許多亟待研究的問題，特別是在進(jìn)行規(guī)模養(yǎng)殖后，隨著養(yǎng)殖方式的改變，竹鼠生活習(xí)性、機(jī)體性能等方面也隨之發(fā)生變化，從而引發(fā)出許多疾病。隨著竹鼠產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對(duì)其疫病病原及防控技術(shù)開展系統(tǒng)性研究已迫在眉睫。已知竹鼠的病原包括細(xì)菌、病毒、真菌及寄生蟲。其中，細(xì)菌疾病最為常見，已報(bào)道的有大腸桿菌、巴氏桿菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌等[1-4]。但是沒有關(guān)于雷氏普羅威登斯菌引起竹鼠發(fā)病的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 采樣及病理觀察 2015年3月，廣西南寧隆安縣某竹鼠養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生竹鼠死亡，病鼠被毛粗亂，消瘦，肛門糞便粘著。剖檢癥狀：腸道出血并伴有大量膠胨樣滲出物；肺出血、間質(zhì)增寬；肝臟色淺、偏黃；腎臟腫大、出血。肉眼觀察大體病理損傷后，取心、肝、脾、肺、腎及小腸，用中性福爾馬林[5]進(jìn)行固定后，送洛陽中科基因檢測(cè)診斷中心進(jìn)行切片與組織病理學(xué)觀察。

1.2 主要試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5%山羊鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、常規(guī)試劑為實(shí)驗(yàn)室自制；膠回收試劑盒、PCRmix，購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司；DS 2000 DNA Marker，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司; 4周齡的昆明系小鼠，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)。

1.3 細(xì)菌分離純化 分別采集病死竹鼠的心、肝、肺、腎及腸道滲出物，接種5%鮮血瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16～24 h，挑選形態(tài)特征一致的單個(gè)菌落反復(fù)劃線純化培養(yǎng)，觀察菌落顏色、形態(tài)特征，并分別挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。根據(jù)菌落、菌體形態(tài)、染色特性進(jìn)行初步判定，然后將典型菌落接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，進(jìn)行純化培養(yǎng)備用。

1.4 16S rRNA基因序列測(cè)定及分析 取分離純化菌按細(xì)菌基因組抽提試劑盒說明書提取DNA，以提取的DNA模板，利用16S rRNA 基因擴(kuò)增引物(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′/5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)[6]進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s，33個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min；回收PCR 產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，利用BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)，采用MEGA 5.0 的Neighbor-Joing(NJ)[7]法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 藥物敏感性檢測(cè) 采用Kirby-Bauer 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圈直徑(IZD)，進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，取平均值。依據(jù)CLSI 的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，判定分離菌株對(duì)藥物的敏感性。

1.6 分離菌對(duì)小鼠的致病性試驗(yàn) 取體重18～22 g健康昆明系小鼠，分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各5只，試驗(yàn)組按照7.1×107CFU/mL濃度，每只小鼠腹腔接種菌液0.2 mL，對(duì)照組腹腔接種等量滅菌肉湯培養(yǎng)基，隔離飼養(yǎng)。注射后連續(xù)觀察記錄小鼠發(fā)病死亡情況，剖檢發(fā)病死亡小鼠，并從內(nèi)臟器官中分離細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 竹鼠發(fā)病情況及剖檢病變 該養(yǎng)殖場(chǎng)位于廣西南寧隆安縣南圩鎮(zhèn)，遠(yuǎn)離村屯，已有3年養(yǎng)殖時(shí)間，共存欄800多只。半個(gè)多月前開始發(fā)病，幼鼠、成年鼠均有死亡，主要癥狀是精神沉郁，食欲下降，體況偏瘦，肛門糞便粘著，陸續(xù)死亡，累計(jì)死亡共22只。部分組織器官病變?nèi)缰胁宀拾鎴D1所示，兩側(cè)肺葉有出血點(diǎn)、出血斑，肺間質(zhì)增寬；腸道出血并伴有大量膠胨樣滲出物；肝臟顏色變淺、變黃，腎臟腫大、出血。

2.2 發(fā)病竹鼠病理組織學(xué)變化 上述病變組織器官經(jīng)切片后進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。H.E.染色結(jié)果如中插彩版圖2所示，肺泡內(nèi)有大量紅細(xì)胞聚集，肺間質(zhì)增寬，有炎性細(xì)胞侵潤(rùn)；腸黏膜脫落，杯狀細(xì)胞增多，內(nèi)有部分漿液性滲出物；肝內(nèi)有大量脂肪泡，并有炎性細(xì)胞，部分血管有白細(xì)胞聚集，形成血管套；腎小球腫脹，腎小管出血，內(nèi)有大量紅細(xì)胞。

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 從發(fā)病竹鼠的肝、肺、腎分離到兩株革蘭陰性菌，挑取典型的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)觀察，可見分離菌株在TSA平板上形成表面光滑、邊緣整齊、圓形隆起的白色菌落。革蘭染色為兩端鈍圓，無芽孢，無莢膜，多數(shù)單個(gè)存在的革蘭陰性桿菌。

2.4 分離菌16S rRNA基因的擴(kuò)增及序列分析 分離菌株P(guān)CR產(chǎn)物測(cè)序和序列分析發(fā)現(xiàn)，所獲得的DNA片段為1 200 bp左右，同源性比對(duì)顯示，兩株分離菌16S rRNA基因100%同源，與雷氏普羅威登斯菌 NR_042413、AB680422等菌株16S rRNA基因存在99.6%～99.9%的同源性。進(jìn)一步將其與GenBank 中登錄的雷氏普羅威登斯菌菌株的16S rRNA 序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，進(jìn)化樹顯示，該分離菌與AB680422株遺傳關(guān)系最近，處于同一小分支上。結(jié)合分離菌株的形態(tài)特征，確定分離株為雷氏普羅威登斯菌，并將其命名為15-11-3/7。

圖3 分離菌16S rRNA 基因進(jìn)化樹

2.5 分離菌藥敏特性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果見表1。分離菌對(duì)頭孢吡肟、頭孢唑林、頭孢氨芐、亞胺培南等4種藥物高度敏感；對(duì)多黏菌素，鏈霉素，恩諾沙星，慶大霉素，氧氟沙星，萬古霉素，阿奇霉素，環(huán)丙沙星，林可霉素等9種藥物中度敏感；對(duì)青霉素、氯霉素、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、磺胺異惡唑等5種藥物有抗性。

表1 雷氏普羅威登斯菌15-11-3/7藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 致病性試驗(yàn)結(jié)果 小鼠腹腔接種攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠在攻毒4 h后出現(xiàn)精神沉郁，呼吸急促，攻毒24～36 h后全部死亡，對(duì)照組小鼠均健活。剖檢死亡小鼠，發(fā)現(xiàn)肝臟變色、腎臟腫大、腸系膜淋巴結(jié)出血。將從死亡小鼠內(nèi)臟器官中分離到的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色，鏡檢顯示分離菌與接種菌是一致的細(xì)菌。

3 討論

本試驗(yàn)從患病的竹鼠內(nèi)臟分離到兩株細(xì)菌?；诜蛛x菌的形態(tài)學(xué)觀察及16S rRNA序列分析，確定兩株致病菌均為雷氏普羅威登斯菌。該菌16S-rRNA基因序列與雷氏普羅威登斯菌(AB680422)同源性高達(dá)99.9%，且遺傳關(guān)系最近，處于同一小分支上。這是國(guó)內(nèi)外首次從竹鼠體內(nèi)分離到雷氏普羅威登斯菌。

雷氏普羅威登菌屬腸桿菌科、普羅威登斯菌屬，是人獸共患的條件性致病菌，廣泛分布于土壤、水體、下水道等自然環(huán)境以及蒼蠅、鳥、貓、狗、牛、羊等的體表或腸道[8]。2006年衛(wèi)生部把它列入人間傳染的病原微生物名錄。在人體主要可致人泌尿系統(tǒng)及腸道外感染，并引起感染醫(yī)院的暴發(fā)流行。已報(bào)道引起人和動(dòng)物尿路感染、傷口感染、眼結(jié)膜炎、腹瀉、肺炎等多種病癥[9-11]。食物在加工、運(yùn)輸、銷售過程中很容易受該菌污染，引起食物中毒事件[12]。該菌也是一種動(dòng)物的條件致病菌，戰(zhàn)文斌等[13]首次從國(guó)內(nèi)發(fā)病對(duì)蝦中分離出該菌，王建昌等[15]報(bào)道了從進(jìn)口美國(guó)種豬新鮮糞便樣品中分離到雷氏普羅威登斯菌，秦毅斌等[16]從腹瀉的仔豬內(nèi)臟器官中分離到了該菌。雷氏普羅威登斯菌的致病機(jī)理比較復(fù)雜，對(duì)竹鼠所造成的疾病和癥狀，未曾報(bào)道。本試驗(yàn)分離得到的雷氏普羅威登斯菌，經(jīng)接種小鼠顯示了很強(qiáng)的致病性，這對(duì)竹鼠相關(guān)疾病的防治具有重要意義。

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Isolation and identification of Providencia rettgeri from the diseased Bamboo rats

TANG Hai-bo , CHEN Feng-lian , RAO Gui-bo , JIANG Jia-jia , MENG Fei , BAI AN-bin , YANG Lei , WU Jian-min

(Guangxi Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Guangxi Veterinary Research Institute, Nanning 530001, China)

To determine the pathogenic bacteria infecting the bamboo rats in the Longan of Nanning, two strains were isolated from the lung, liver and kidney of diseased bamboo rats. Identification by the morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis, demonstrated that the pathogenic bacteria were Providencia rettgeri. The pathogenic test showed that the isolate was highly pathogenic to the adult mice. Their 16S rRNA was closely related to Providencia rettgeri (AB680422) with a homology of 99.9%. The susceptibility test to antibiotis demonstrated that the Providencia rettgeri was highly sensitive to cefepime, cefazolin, cephalexin, etc., and resistant to penicillin, chloramphenicol, florfenicol, compound sulfamethoxazole, etc. These findings suggest that Providencia rettgeri is the pathogen of the dead bamboo rats in Longan of Nanning. This is the first report, showing that Providencia rettgeri has strong pathogenicity to bamboo rats at home and abroad.

Bamboo rat ; Providencia rettgeri ; Isolation and identification

WU Jian-min

2016-10-25

廣西水產(chǎn)畜牧局科技推廣應(yīng)用項(xiàng)目(桂漁牧科201452004); 廣西基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(桂科專項(xiàng)15-4)

唐海波(1983-)，男，助理研究員，博士，主要從事動(dòng)物傳染病防治與分子病毒學(xué)研究，E-mail：thb514@163.com

陳鳳蓮(1972-)，女，研究員，碩士，主要從事分子病毒學(xué)和動(dòng)物傳染病研究，E-mail：c11212003@sina.com

吳健敏，E-mail：wu-jm20@163.com

S864.7

A

0529-6005(2017)07-0035-03

注：陳鳳蓮與唐海波對(duì)本文具有同等貢獻(xiàn)