么乃全 ， 邸海洋 ， 李新殿 ， 張 敏 ， 李斯齊 ， 高云航 ， 徐鳳宇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 2.長(zhǎng)春動(dòng)植物公園 ， 吉林長(zhǎng)春130400 ；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 4.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 , 北京海淀100081)

火雞禽霍亂的病原鑒定及病理學(xué)觀察

么乃全1， 邸海洋2， 李新殿3， 張 敏4， 李斯齊1， 高云航1， 徐鳳宇1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 2.長(zhǎng)春動(dòng)植物公園 ， 吉林長(zhǎng)春130400 ；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118 ； 4.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 , 北京海淀100081)

對(duì)長(zhǎng)春某觀賞動(dòng)物園區(qū)疑似急性禽霍亂的火雞病例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，病原經(jīng)染色鑒定為革蘭陰性兩極濃染的球桿菌，進(jìn)一步16S rRNA序列測(cè)定與分析顯示，該病原為多殺性巴氏桿菌。病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)火雞肝臟淤血、細(xì)胞壞死；小腸呈卡他性出血性腸炎；肺臟充血、間質(zhì)增寬，符合禽霍亂病理組織學(xué)特點(diǎn)。藥敏試驗(yàn)顯示，該菌對(duì)阿米卡星、米諾環(huán)素、頭孢哌酮、慶大霉素敏感，采用敏感抗生素注射結(jié)合嚴(yán)格消毒措施控制了該病的發(fā)生和蔓延。

火雞 ； 多殺性巴氏桿菌 ； 鑒定 ； 病理學(xué)

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起禽類的一種敗血性、致死性傳染病，能感染所有禽類且多為致死性感染。該病仍是危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的主要細(xì)菌性疫病之一，發(fā)病率為10%～70%，病死率30%～80%[1]。健康攜帶病原或感染的禽類均是重要的傳染源[2]。成年火雞的易感性最高，發(fā)病最為嚴(yán)重，國(guó)內(nèi)禽霍亂病例主要見(jiàn)于雞、鴨和鵝，關(guān)于火雞發(fā)生禽霍亂的報(bào)道較少[3]。

2014年8月長(zhǎng)春市某觀賞動(dòng)物園區(qū)內(nèi)5只火雞相繼發(fā)生急性死亡，其中2只于夜間死亡，3只清晨見(jiàn)有精神委靡、不食、羽毛蓬亂的表現(xiàn)，于中午前后相繼死亡。為了確診該病，對(duì)死亡火雞進(jìn)行病理剖檢、病原分離鑒定及病理組織學(xué)觀察，確定引起此次疫情的病原為多殺性巴氏桿菌。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 犢牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物技術(shù)有限公司；TSA、TSB培養(yǎng)基，均為北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；PCR反應(yīng)預(yù)混液、DNA Marker、DNA純化回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；革蘭氏、美藍(lán)染色液均為實(shí)驗(yàn)室自行配制保存；蘇木素-伊紅染色試劑盒，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 菌株 多殺性巴氏桿菌C48-11(Pasteurellamultocida，CVCC 462)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。待鑒定的疑似火雞多殺性巴氏桿菌命名為PmccTk-1。

1.3 藥敏紙片 慶大霉素、卡那霉素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素、新霉素、紅霉素、頭孢氨芐、頭孢拉啶、哌拉西啉、羧芐西啉、苯唑西啉、阿米卡星、氨芐西林、頭孢哌酮、頭孢曲松、四環(huán)素、青霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿奇霉素、多粘菌素B的藥敏紙片，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4 病雞剖檢 按照常規(guī)剖檢術(shù)式進(jìn)行，心血及肝臟組織觸片制作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，革蘭染色、美藍(lán)染色參照《獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)診斷手冊(cè)》方法進(jìn)行[4]。

1.5 病原分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集病死雞的心血、肝臟，劃線接種于含10%犢牛血清的TSA平板培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h后觀察結(jié)果。

1.6 藥敏試驗(yàn) 經(jīng)10%血清TSB培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后的菌液，均勻涂布于TSA平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，24 h后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 16S rRNA基因序列分析 參照試劑盒方法提取細(xì)菌基因組DNA，16S rRNA通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行目的基因的PCR擴(kuò)增。方法參照文獻(xiàn)[5]，預(yù)期片段大小約為1 500 bp，測(cè)序后與GenBank中公布的基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.8 病理組織學(xué)檢查 采集病死火雞心、肝、肺和腸等組織經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟制片、H.E.染色，供病理組織學(xué)檢查。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢結(jié)果 死亡火雞的剖檢病理特征十分相似，胸腔壁和腹膜可見(jiàn)大量出血斑點(diǎn)；心包淡黃色積液，心外膜及心冠脂肪有出血斑點(diǎn)(見(jiàn)封二彩版圖1)；肝臟腫大，表面有大量灰白色壞死斑點(diǎn)(見(jiàn)封二彩版圖2)；肺部充血、水腫(見(jiàn)封二彩版圖3)；腺胃乳頭間大量出血點(diǎn)(見(jiàn)封二彩版圖4)；十二指腸高度充血、出血、水腫，腸腔內(nèi)大量膠胨樣凝血塊(見(jiàn)封二彩版圖5)；氣管中積有多量黏液，黏膜散在出血點(diǎn)；睪丸充血、腫大(見(jiàn)封二彩版圖6)。

2.2 病料涂片染色鑒定結(jié)果 病死火雞心血、肝臟涂片經(jīng)革蘭染色鏡檢可見(jiàn)紅色球桿菌(見(jiàn)封二彩版圖7)，美藍(lán)染色鏡檢可見(jiàn)兩端著色短小桿菌(見(jiàn)封二彩版圖8)，符合巴氏桿菌的染色特征。

2.3 病原分離鑒定結(jié)果 在TSA培養(yǎng)基上可見(jiàn)面光滑、透明的、露滴狀小菌落，革蘭、美藍(lán)染色鏡檢結(jié)果與病料染色結(jié)果一致。

2.4 16S rRNA序列測(cè)定及分析 擴(kuò)增的16S rRNA基因序列與GenBank中已公布基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)，MegAlign軟件分析結(jié)果如圖13所示，與C48-11等幾種禽源多殺性巴氏桿菌的同源性均在98%以上，參照相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道[6]，可以確定該菌株為多殺性巴氏桿菌。

圖13 火雞巴氏桿菌16S rRNA序列同源性分析

1:PmccTk-1; 2:CVCC C48-11; 3:HPs-1; 5:NCTC 10204; 6:HIM830-7T; 7:PM106; 8:HaiNGoosePm2012

2.5 病理組織學(xué)觀察結(jié)果 肝臟靜脈淤血、擴(kuò)張，管腔與竇內(nèi)充有大量紅細(xì)胞，部分肝細(xì)胞壞死，胞核溶解、空泡化(見(jiàn)封二彩版圖9)；心肌纖維斷裂、崩解，部分胞核消失，間質(zhì)中存在紅細(xì)胞和白細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)封二彩版圖10)；小腸黏膜固有層明顯充血、出血，白細(xì)胞浸潤(rùn)，腸黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，呈卡他性出血性腸炎(見(jiàn)封二彩版圖11)；肺臟中小靜脈擴(kuò)張充血，間隔增寬，可見(jiàn)多量白細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)封二彩版圖12)。

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果顯示，該菌株對(duì)卡那霉素、多西環(huán)素、新霉素、紅霉素、頭孢氨芐、頭孢拉啶、哌拉西啉、羧芐西啉、苯唑西啉、氨芐西林、頭孢曲松、四環(huán)素、青霉素、頭孢唑啉、頭孢他啶、阿奇霉素、多黏菌素B表現(xiàn)出不同程度的耐藥性；而對(duì)阿米卡星、米諾環(huán)素、頭孢哌酮、慶大霉素較為敏感。

3 討論

此次火雞發(fā)生禽霍亂的病程短、病死率高，瀕死前的臨床特征不明顯，剖檢病理變化卻較典型，符合禽霍亂病變特點(diǎn)。病原經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和16S rRNA序列鑒定進(jìn)一步證實(shí)為多殺性巴氏桿菌。病理組織學(xué)觀察可見(jiàn)火雞肝臟淤血、細(xì)胞壞死；心肌纖維斷裂，白細(xì)胞浸潤(rùn)；小腸黏膜固有層充血、出血，呈卡他性出血性腸炎；肺臟充血、間質(zhì)增寬。符合禽霍亂的病理組織學(xué)特點(diǎn)。

該園區(qū)火雞在發(fā)生禽霍亂前一直于舍內(nèi)飼養(yǎng)，轉(zhuǎn)到室外的飼養(yǎng)區(qū)周圍為其他觀賞禽類，推測(cè)此次禽霍亂的暴發(fā)很可能是由其他觀賞禽類傳播所致。火雞在飼養(yǎng)過(guò)程中未曾進(jìn)行過(guò)疫苗免疫，也未投喂過(guò)各種抗菌藥物，從而導(dǎo)致急性感染的發(fā)生。通過(guò)敏感抗生素注射結(jié)合嚴(yán)格的消毒措施，此次疫情得到了控制。

火雞對(duì)多殺性巴氏桿菌的易感性極高，發(fā)病多為最急性感染，具有很高的致死率，因此在火雞養(yǎng)殖中應(yīng)十分注意禽霍亂的防控。若有條件可用地區(qū)流行的血清型多價(jià)滅活疫苗或自家滅活疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，同時(shí)應(yīng)注意不能與家禽混養(yǎng)，防止家禽攜帶病原發(fā)生傳播，動(dòng)物觀賞園區(qū)注意火雞不與其他觀賞禽類混養(yǎng)。

[1] 施少華, 程龍飛, 傅光華，等. 檢測(cè)禽多殺性巴氏桿菌PCR方法的建立[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 24(3): 201-204.

[2] Christensen J P, Bisgaard M. Fowl cholera[J].RevSciTech, 2000, 19(2): 626-637.

[3] 廖素環(huán), 韋天超, 騫慧，等. 一起火雞禽霍亂的診治[J]. 養(yǎng)禽與禽病防治, 2011, 8:36-37.

[4] 么乃全, 王全凱, 姜秀云，等. 鴨疫里氏桿菌外膜微孔蛋白基因的克隆和序列分析及PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué), 2013, 43(07):723-727.

[5] 廖延雄. 獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)診斷手冊(cè)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1995:59-61.

[6] Fry N K, Warwick S, Saunders N A,etal. The use 16S ribosomal RNA analyses to investigate phylogeny of the familyLegionellaceae[J].JGenMicr-obiol, 1991, 137(5):1 215-1 222.

Pathogen Identification and Pathological Observation of Turkey Fowl Cholera

YAO Nai-quan1, DI Hai-yang2, LI Xin-dian3, ZHANG Min4, LI Si-qi1, GAO Yun-hang1, XU Feng-yu1

(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Changchun Animal and plant park, Changchun 130061, China; 3.College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 4. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081，China)

Laboratory diagnosis was carried out for turkeys of an ornamental zoo in Changchun suspected acute fowl cholera by clinical diagnosis. The microscopic examination of isolated pathogen showed that it was a kind of small Gram negative bacilli with bipolar staining characteristics. 16S rRNA sequence analysis indicated the strain wasPasteurellamultocida. Histopathological observation consist with characteristics of fowl cholera with liver congestion and cell necrosis, catarrhal hemorrhagic enteritis, lung congestion and interstitial width increased. Susceptibility test showed the strain was sensitive to amikacin, minocycline, cefoperazone, gentamicin. Disease outbreak was controlled by sensitive antibiotic injection combined with strict disinfection measures.

Turkey ;Pasteurellamultocida; Identification ; Pathology

XU Feng-yu

2016-03-04

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201405)；吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2016192)

么乃全(1980-)，男，講師，博士生，從事動(dòng)物傳染病診斷及免疫研究，E-mail:ynq1980@163.com

徐鳳宇，E-mail: xvfengyv2002@126.com

S832

A

0529-6005(2017)07-0045-02