何中慧 盧芳芳 徐 紅 王澤華 遲 博 況 燕*

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市530021；3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬內(nèi)科醫(yī)院婦產(chǎn)科；武漢市 430074)

靶向Dicer的RNA干擾對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響▲

何中慧1盧芳芳2徐 紅1王澤華3遲 博1況 燕1*

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，南寧市 530021；2 廣西醫(yī)科大學(xué)，南寧市530021；3 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬內(nèi)科醫(yī)院婦產(chǎn)科；武漢市 430074)

目的 探討Dicer抑制對(duì)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖和遷移能力的影響，以進(jìn)一步明確Dicer在卵巢癌生物學(xué)行為中的作用。方法 合成Dicer的小干擾RNA(Dicer siRNA)轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞并篩選有效siRNA，實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)Dicer的mRNA的表達(dá)，蛋白印跡法檢測(cè)Dicer蛋白的表達(dá)，MTT檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活力，Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期。結(jié)果 與未轉(zhuǎn)染組相比，siRNA1658轉(zhuǎn)染組Dicer基因mRNA的表達(dá)最低，為(0.194±0.002)，明顯低于siRNA1897轉(zhuǎn)染組的(0.535±0.015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，但與siRNA334組的(0.251±0.014)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，以未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞Dicer mRNA表達(dá)水平為100%，siDicer-A2780細(xì)胞Dicer的mRNA水平相對(duì)下降(0.157±0.012)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。以未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞Dicer的蛋白表達(dá)水平為100%，siDicer-A2780細(xì)胞Dicer的蛋白水平相對(duì)下降(0.153±0.021)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在種板后第3天、第4天、第5天，與對(duì)照組細(xì)胞比較，siDicer轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P均<0.05)。與對(duì)照組轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siDicer 96 h后，siDicer-A2780細(xì)胞的增殖活性平均上升了23%。細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示siDicer-A2780細(xì)胞中G0/G1期占(44.26±0.48)%，S期占(25.05±1.20)%，G2/M期占(21.53±0.77)%；對(duì)照組siNC-A2780細(xì)胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.80±0.24)%。siDicer-A2780細(xì)胞S期和G2/M細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加(P均<0.05)，而G0/G1期細(xì)胞則減少(P<0.001)。與對(duì)照組siNC-A2780細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)相比，抑制Dicer表達(dá)的siDicer-A2780 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)增加(3.99±0.29)倍(P<0.001)。結(jié)論 Dicer基因具有抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的能力。

卵巢癌；Dicer基因；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲；治療靶點(diǎn)

Dicer屬于核糖核酸酶III(RNaseIII)的家族成員，是微小分子RNA(miRNA)生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。作為miRNA的上游調(diào)控因子，Dicer下調(diào)可能通過(guò)降低miRNA的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的形成[1]。但目前關(guān)于Dicer對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響的報(bào)道甚少。為進(jìn)一步明確Dicer與卵巢腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)系，通過(guò)靶向干擾Dicer的小干擾RNA(siRNA)沉默Dicer基因，抑制Dicer基因在卵巢癌細(xì)胞A2780中的表達(dá)，探討Dicer抑制對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 人卵巢癌細(xì)胞A2780購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC),RPMl640培養(yǎng)液及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和熒光染料SYBR Green Real time PCR反應(yīng)液購(gòu)自日本Toyobo公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，兔抗人H3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bioworld Technology，鼠抗人Dicer多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cmz公司，Bradford蛋白定量試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL顯色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所，PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 小干擾RNA(siRNA) 小干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒載體Dicer-siRNA的設(shè)計(jì)合成，序列如表1。

表1 siRNA載體Dicer-siRNA的設(shè)計(jì)合成

1.3 A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)以Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞作為Dicer-siRNA組(A2780-siDicer)，以negative control-siRNA轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞作為非特異性序列轉(zhuǎn)染組(A2780-siNC)，不作處理的作為未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(A2780)。卵巢癌細(xì)胞株A2780培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。收集細(xì)胞，將A2780細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板，次日，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)匯合至50%時(shí)，取Dicer-siRNA1658、Dicer-siRNA334、Dicer-siRNA1879、negative control-siRNA各100 pmol和脂質(zhì)體lipofectamine 2000 5 μ混勻并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染對(duì)照組則加入1 640培養(yǎng)液，具體操作按Lipofectamine 2 000說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

1.4 Dicer mRNA的表達(dá) Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，按Toyobo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。Dicer的上游引物為：5′- GTGGTTCGTTTTGATTTGCCC-3′，下游引物為：5′- CGTGTTGATTGTGACTCGTGGA -3′。以β-actin為內(nèi)參，上游引物5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游引物：5′- TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。在ABI 7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件，95℃1 min，95℃15 s，58℃15 s，72℃45 s，40個(gè)循環(huán)，用2-△△ct法計(jì)算Dicer /β-actin比值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分析熔解曲線，以鑒定產(chǎn)物的單一性。在PCR過(guò)程中設(shè)立無(wú)模板陰性對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Dicer蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，Bradford方法測(cè)定蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，鼠抗人Dicer多克隆抗體(1 ∶1 000；abcam) 4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗(1 ∶5 000；Santa Cruz)室溫孵育1 h后ECL化學(xué)發(fā)光觀察，以β-actin作為等量上樣的標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果應(yīng)用條帶密度分析軟件Quantity One軟件分析，計(jì)算 Dicer/β-actin比值表示Dicer蛋白的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞生長(zhǎng)活力 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度按2×103/孔接種96孔板，共接種5板。每日取1塊板，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150μL，用酶標(biāo)儀以570 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度(A570)值，計(jì)算光密度(OD)值，連續(xù)5 d，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.7 細(xì)胞體外遷移能力的測(cè)定 采用直徑6.5 mm、孔徑8 μm的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移能力的檢測(cè)，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，每個(gè)樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取平均值。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)周期，分析DNA含量，應(yīng)用相關(guān)軟件分析G0期、S期和G2期的細(xì)胞比例。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，計(jì)量資料結(jié)果用(x±s)表示, 兩組數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Dicer siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞并篩選有效siRNA 靶向干擾Dicer的三種siRNA334、siRNA1658、siRNA1897分別轉(zhuǎn)染到A2780細(xì)胞中，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因Dicer mRNA的表達(dá)。與未轉(zhuǎn)染組相比，siRNA1658轉(zhuǎn)染組Dicer基因mRNA的表達(dá)最低，為(0.194±0.002)，明顯低于siRNA1897轉(zhuǎn)染組的(0.535±0.015)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；與siRNA334組的(0.251±0.014)相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。因此，本研究選擇siRNA1658進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Dicer mRNA相對(duì)水平

圖1 Dicer-siRNA的篩選(1：小siRNA334；2：siRNA1658；3：siRNA1897)

2.2 轉(zhuǎn)染Dicer siRNA1658后A2780細(xì)胞的Dicer的沉默效率 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，以未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞Dicer基因的mRNA表達(dá)水平為100%，siDicer-A2780細(xì)胞Dicer基因的mRNA水平為(0.157±0.012)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。siNC-A2780轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Dicer基因的mRNA表達(dá)水平為(1.073±0.061)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明siRNA1658-Dicer能有效抑制Dicer的mRNA表達(dá)，見(jiàn)圖2。同時(shí)，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在蛋白水平驗(yàn)證了siRNA對(duì)Dicer的有效抑制。以未轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞Dicer基因的蛋白表達(dá)水平為100%，siDicer-A2780細(xì)胞Dicer基因的蛋白水平下降為(0.153±0.021)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而siNC-A2780轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Dicer基因的蛋白水平是未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞表達(dá)水平的(1.013±0.021)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

Dicer mRNA相對(duì)表達(dá)水平

圖2 轉(zhuǎn)染siRNA后各組細(xì)胞Dicer mRNA的表達(dá)(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)Dicer蛋白表達(dá)水平

圖3 轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA)后各組細(xì)胞Dicer的蛋白表達(dá)(1：A2780；2：A2780-siNC；3：A2780-siDicer)

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)情況 在種板后第3天、第4天、第5天，siDicer轉(zhuǎn)染的A2780細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，與對(duì)照組細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.4 細(xì)胞增殖情況 與對(duì)照組轉(zhuǎn)染siNC的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染siDicer 96 h后，siDicer-A2780細(xì)胞的增殖活性平均上升了23%，見(jiàn)圖5。

圖5 Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞增殖的影響

(1：A2780-siNC；2：A2780-siDicer)

2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)周期情況 細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示siDicer-A2780細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞占(44.26±0.48)%，S期細(xì)胞占(25.05±1.2)%，G2/M期細(xì)胞占(21.53±0.77)%；對(duì)照組siNC-A2780細(xì)胞中G0/G1期占(52.79±1.11)%，S期占(20.01±1.22)%，G2/M期占(19.8±0.24)%。siDicer-A2780細(xì)胞S期和G2/M細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞明顯增加，而G0/G1期細(xì)胞則減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)見(jiàn)圖6。提示Dicer可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程從而影響卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。

圖6 Dicer-siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A2780細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

2.6 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果 在Transwell小室濾膜上，與對(duì)照組siNC-A2780細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)相比，抑制Dicer表達(dá)siDicer-A2780 細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)增加(3.99±0.29)倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖7。提示Dicer沉默能增強(qiáng)A2780的遷移能力，Dicer表達(dá)的下調(diào)有助于促進(jìn)卵巢癌疾病的進(jìn)展。

(a)

(b)

3 討 論

微小RNA(miRNA)是一組保守的非編碼小RNA。近年研究表明，miRNA表達(dá)失調(diào)與多種腫瘤相關(guān)[2-6]。對(duì)多種腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)存在miRNA的表達(dá)譜及其調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程的改變[7-8]，miRNAs在腫瘤形成過(guò)程中的作用引起研究者的關(guān)注。作為miRNA調(diào)控的關(guān)鍵因子，Dicer的異常改變可能會(huì)導(dǎo)致miRNA的異常表達(dá)，并且和很多癌癥相關(guān)。本研究結(jié)果表明，當(dāng)靶向抑制Dicer酶的siRNA抑制Dicer的表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生明顯變化，增殖與侵襲能力均明顯增強(qiáng)。結(jié)果提示，作為miRNA的關(guān)鍵調(diào)控因子，降低Dicer酶的表達(dá)可能導(dǎo)致成熟miRNA表達(dá)水平的降低，從而促進(jìn)腫瘤的形成。近來(lái)對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制Dicer的表達(dá)可以明顯增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性及人源胚胎腎HEK293T細(xì)胞的遷移能力[9]。而且，在分子水平，抑制人腫瘤細(xì)胞株U251，MCF-7和SCG7901中Dicer的表達(dá)可以提高細(xì)胞周期相關(guān)分子cyclin A和PCNA及侵襲促進(jìn)因子MMP-2和MMP-9的表達(dá)?；铙w實(shí)驗(yàn)表明，皮下注射腺病毒基因沉默Dicer的乳腺癌MCF-7細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。

此外，通過(guò)靶向抑制miRNA成熟過(guò)程中包括Dicer酶在內(nèi)的幾個(gè)重要的酶，導(dǎo)致癌細(xì)胞miRNA水平顯著降低，癌細(xì)胞隨之出現(xiàn)進(jìn)一步惡化的表型。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，miRNA加工受損的細(xì)胞會(huì)加速形成腫瘤，且更具侵襲性。這些研究結(jié)果均表明Dicer酶起著一個(gè)抑癌基因的作用，降低其表達(dá)，可能全面抑制miRNAs的表達(dá)，可以導(dǎo)致腫瘤生物學(xué)特征的惡化，促進(jìn)腫瘤的形成。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，靶向Dicer酶的siRNA抑制A2780細(xì)胞Dicer的表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程。有意思的是，研究表明，降低乳腺癌MCF-7細(xì)胞Dicer的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致G1停滯并提高對(duì)鉑類藥物的敏感性，這表明Dicer調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用存在腫瘤類型特異性的差異。這可能和不同腫瘤存在miRNA的表達(dá)譜差異有一定的關(guān)系，這值得研究者進(jìn)一步探索。

綜上所述，我們的研究結(jié)果表明，沉默Dicer具有促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞A2780增殖和侵襲的能力，但仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)。對(duì)Dicer在卵巢癌腫瘤形成中的作用及其機(jī)制的深入研究，將為臨床治療卵巢癌提供新的治療靶點(diǎn)。

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Influence of RNA interference targeting Dicer on biological function of ovarian cancer cells

HEZhonghui1,LUFangfang2，XUHong1,WANGZehua3 ,CHIBo1,KUANGYan1*

(1DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；2theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China；3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan,Hubei430022,China)

Objective To investigate the effect of inhibition of Dicer on the proliferation and migration of ovarian carcinoma cell A2780, thus to further specify the role of Dicer in biological behavior of ovarian cancer. Methods The synthetic Dicer small interfering(Dicer siRNA) was transfected into A2780 cells and the effective siRNA was selected. The expression of Dicer mRNA and protein were detected by real-time quantitative PCR and Western blot respectively.The growth and viability of cells were measured by MTT. Cellmigration was measured by Transwell chambers.Cell cycle was detected by flow cytometry.Results The expression of Dicer mRNA in the siRNA1658 transfected group (0.194±0.002)was the lowest compared with the non-transfected group, and was significantly lower than that in the siRNA1897 group(0.535±0.015), (P<0.001).But there was no statistical difference in the expression of Dicer mRNA between the siRNA1658 transfected group and the siRNA334 group(0.251±0.014) (P>0.05).The result of real-time quantitative PCR showed that the Dicer mRNA level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.157±0.012) when the Dicer mRNA level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). Dicer protein level of siDicer-A2780 cell relatively decreased (0.153±0.021)when the Dicer protein level of non-transfected A2780 cell was defined as 100%(P<0.001). At the 3rd, 4th and 5th days,the proliferation of A2780 cells transfected by siDicer increased compared with the cells in the control group(allP<0.05). After 96 hours of transfection by siDicer, the proliferation activity of siDicer-A2780 cells increased by an average of 23% compared with the cells transfected by siNC in the control group.The result of cell cycle analysis showed that siDicer-A2780 cells at theG0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (44.26±0.48)%，(25.05±1.20)% and (21.53±0.77)% respectively. In the control group, siNC-A2780 cells at G0/G1 phase, S phase and G2/M phase accounted for (52.79±1.11)%，(20.01±1.22)% and (19.80±0.24)% respectively. The numbers of siDicer-A2780 cells at S phase and G2/M phase were more， but the number of cells at G0/G1 phase was less compared with the cells of the control group(P<0.001). Dicer-inhibited siDicer-A2780 cells penetrating membrane achieved (3.99±0.29)folds increase in the number compared to siNC-A2780 cells in the control group(P<0.001). Conclusion Dicer gene obtains the ability of inhibiting growth and invasion of ovarian cancer cells.

Ovarian cancer； Dicer gene；Cell proliferation；Cell invasion ；Therapy target

廣西高?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(編號(hào)：YB2014058 )，廣西碩士研究生科研創(chuàng)新課題(編號(hào)：YCSZ2014101)

R 737.31

A

1673-6575(2017)04-0459-06

10.11864/j.issn.1673.2017.04.03

2017-04-23

2017-06-18)

*通信作者