楊勇 李希珍 張慶賀+盧丹

[摘要]蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶既能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，又能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用。為了研究中藥蓮子心是否對(duì)該酶活性有影響，該文首先對(duì)蓮子心的化學(xué)成分進(jìn)行了提取分離，得到12個(gè)單體化合物，其中N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷和甘露醇為首次從該藥材中分離得到。隨后該文研究了蓮子心中主要的生物堿成分N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對(duì)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶活性的影響，首次發(fā)現(xiàn)它們均具有抑制蛋白二硫鍵異構(gòu)酶活性的作用，其中N甲基烏藥堿活性最強(qiáng)（IC50 14 μmol·L-1）。

[關(guān)鍵詞]蓮子心； 生物堿； 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶； 抗腫瘤

Studies on the chemical components of Nelumbinis Plumula and

the inhibitory activity on protein disulfide isomerase

YANG Yong1， LI Xizhen1，2， ZHANG Qinghe1， LU Dan1*

（1 School of Pharmaceutical Science， Jinlin University， Changchun 130021， China；

2 Cangzhou Medical College， Cangzhou 061000， China）

[Abstract]Increasing evidence suggested that protein disulfide isomerase supported the survival and progression of several cancers Nelumbinis Plumula is a Chinese traditional herb which showed antitumor activity To find if the Nelumbinis Plumula affect protein disulfide isomerase activity， we studied its chemical constituents， and 12 monomeric compounds were isolated by means of solvent extraction， silica gel column chromatography， preparative HPLC and recrystallization Among them， Nmethylcoclaurine， kaempferol， chrysoeriol7Oneohesperidoside and mannitol were obtained for the first time Following， we tested the compounds inhibitory activity on protein disulfide isomerase The results showed that Nmethylcoclaurine， neferine， liensinine and isoliensinine could inhibit the activity of protein disulfide isomerase in vitro， their IC50 values were 14， 29， 40 and 54 μmol·L-1， respectively

[Key words]Nelumbinis Plumula； alkaloid； protein disulfide isomerase； antitumor

蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）是一類在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中催化二硫鍵形成、斷裂、重組的氧化還原酶。研究表明PDI在淋巴癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、雄性生殖細(xì)胞癌、腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥中的表達(dá)顯著增高[12]。PDI在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用，既能抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[35]，又能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[67]。因此，以PDI為靶點(diǎn)研發(fā)新的抗癌藥物日益引起重視。蓮子心Nelumbinis Plumula是睡蓮科水生植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的成熟種子中的幼葉及胚根經(jīng)干燥而得。為2015年版《中國(guó)藥典》收錄藥材。研究表明，蓮子心主要活性成分為生物堿類化合物[810]，具有抗腫瘤[1113]、保護(hù)心血管功能[1416]、抑制肝纖維化[1718]等藥理作用。本研究利用溶液萃取和硅膠柱色譜、制備高效液相色譜法和重結(jié)晶等方法對(duì)蓮子心乙醇提取物中的化學(xué)成分進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)確證，共得到12個(gè)單體化合物，其中N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷、甘露醇為首次從蓮子心中分離得到。通過研究N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對(duì)PDI活性的影響，首次發(fā)現(xiàn)這些芐基異喹啉類生物堿具有抑制PDI活性的作用，即進(jìn)一步說明了蓮子心的抗腫瘤作用機(jī)制，又為尋找新的PDI抑制劑提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料

11儀器

Waters Model 500制備型高效液相色譜儀；Shodex R1201示差檢測(cè)器，N2000色譜工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；YMC半制備色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）；WRS2A型熔點(diǎn)測(cè)定儀（上海軒澄儀器有限公司）；ZF7 型手提式紫外檢測(cè)燈（上海寶山顧村電光儀器廠）；ARX600型和ARX500型核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；Synergy H1全功能微孔板檢測(cè)儀（美國(guó)Bio Tek），Gen5 209數(shù)據(jù)分析軟件，GraphPad Prism 7數(shù)據(jù)分析軟件。endprint

12試藥

薄層色譜硅膠G（青島海洋化工有限公司），柱色譜硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司），十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS，北京綠百草科技發(fā)展有限公司），蓮心堿高氯酸鹽（批號(hào)111696200501，中國(guó)食品藥品檢定研究院），牛肝蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（P3818，Sigma），牛胰島素（I4011，Sigma），二硫蘇糖醇（DTT，D9779，Sigma），試劑為分析純，水為純凈水。蓮子心，購(gòu)于長(zhǎng)春中藥批發(fā)市場(chǎng)，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院王廣樹教授鑒定為蓮子心。

2方法

21提取與分離

取蓮子心10 kg，粉碎，用80%乙醇室溫浸提3次，乙醇用量分別為10，8，8倍，浸提時(shí)間分別為48，24，24 h，合并提取液，過濾，回收溶劑至無(wú)醇味，得到蓮子心提取物（21 kg）。提取物適當(dāng)稀釋后用石油醚萃取，回收溶劑得石油醚層（2712 g）和水層。水層濃縮至每毫升含有04 g生藥，用9%鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH 1～2，靜置，至析出沉淀不再增多，抽濾，得沉淀（109 g）和濾液。濾液用氨水調(diào)節(jié)pH 9～10，用氯仿萃取數(shù)次，回收氯仿得蓮子心總生物堿（1062 g）。

取石油醚部分100 g，經(jīng)過硅膠柱色譜分離（石油醚乙酸乙酯65∶1～1∶1），得到55個(gè)流分Fr1～55，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果合并為12個(gè)組分，其中Fr7經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚氯仿60∶1～1∶1；石油醚乙酸乙酯30∶1～1∶1）和甲醇重結(jié)晶得到化合物11（197 mg）。

取總生物堿106 g，經(jīng)過硅膠柱色譜（石油醚乙酸乙酯二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）得到98個(gè)流分，根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果合并成21個(gè)組分，其中Fr4經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結(jié)晶得到化合物1（204 mg）；組分Fr10采用硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1；石油醚乙酸乙酯二乙胺20∶1∶1～1∶1∶1）、反相硅膠柱色譜（甲醇水60∶40～100∶0）、半制備高效液相（YMC 20 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相甲醇水二乙胺800∶200∶01～750∶250∶01；流速10 mL·min-1；示差檢測(cè)器）進(jìn)行分離純化，甲醇重結(jié)晶，得到化合物2（208 mg）、化合物3（228 mg）和化合物4（215 mg）；組分Fr18經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚氯仿二乙胺60∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結(jié)晶得化合物12（214 mg）。

取沉淀部分100 g，蒸餾水洗至中性，甲醇溶解，過濾，濾液濃縮至每毫升含有02 g生藥，經(jīng)D101型大孔樹脂柱純化，依次用蒸餾水、10%乙醇、50%乙醇洗脫，收集50%乙醇洗脫液，蒸干（685 g），經(jīng)硅膠柱色譜（氯仿甲醇水40∶1∶1～1∶1∶1）得30個(gè)流分，F(xiàn)r7和Fr9經(jīng)甲醇重結(jié)晶得化合物10（218 mg）；和化合物8（178 mg）；Fr14經(jīng)硅膠柱色譜（乙酸乙酯甲醇水55∶1∶1～1∶1∶1，25∶1∶1～1∶1∶1）和甲醇重結(jié)晶得化合物5（184 mg）、化合物6（225 mg）、化合物7（231 mg）、化合物9（198 mg）。

進(jìn)一步研究化合物N甲基烏藥堿（Nmethycoclaurine，1）、甲基蓮心堿（neferine，2）、異蓮心堿（isoliensinine，3）和蓮心堿（liensinine，4）對(duì)PDI活性作用的影響。化合物結(jié)構(gòu)式見圖1。

22生物活性研究

221儲(chǔ)備液制備

取適量牛胰島素用01 mol·L-1 HCl溶液溶解制成濃度為13 mmol·L-1儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存。取適量DTT加去離子水制成05 mol·L-1 DTT儲(chǔ)備液，-18 ℃凍存。含01 mol·L-1磷酸二氫鉀和2 mmol·L-1 EDTA的pH 70的緩沖鹽儲(chǔ)備液，常溫保存。取適量PDI加上述緩沖液制成58 g·L-1 PDI儲(chǔ)備液，-18 ℃凍存。

222實(shí)驗(yàn)步驟

2221配制α溶液取1 μL DTT儲(chǔ)備液，加水999 μL稀釋至05 mmol·L-1，混勻，即得，置于冰浴中。

2222配制β溶液按照59∶1的比例，分別量取緩沖鹽儲(chǔ)備液與α溶液，混勻，即得，置于冰浴中。

2223配制γ溶液量取PDI儲(chǔ)備液適量，加β溶液稀釋至PDI濃度為16 μmol·L-1的溶液，混勻，即得，置于冰浴中。

2224配制δ溶液按照10∶1∶189的比例，依次量取胰島素儲(chǔ)備液、DTT儲(chǔ)備液、β溶液，輕輕混勻至溶液澄清，即得，置于冰浴中。

2225測(cè)定取黑色底透384孔板，在垂直相鄰的2個(gè)孔中分別加入β溶液39 μL，在接著垂直相鄰的2個(gè)孔中分別加入β溶液31 μL，在接著垂直相鄰的2個(gè)孔中分別加入γ溶液31 μL，在接著垂直相鄰的孔（Sample）中分別加入γ溶液31 μL，加入個(gè)數(shù)等于供試品溶液的個(gè)數(shù)的2倍。在前3對(duì)反應(yīng)中加入DMSO 1 μL，在其他反應(yīng)中加入供試品溶液1 μL。37 ℃孵育1 h。取出，除第1反應(yīng)的2個(gè)孔外，其余孔中分別加入δ溶液8 μL。立即置Bio Tek微孔板監(jiān)測(cè)儀620 nm下測(cè)定吸光值，每5 min讀數(shù)1次，檢測(cè)2 h。

23實(shí)驗(yàn)原理

胰島素的A，B 2條鏈?zhǔn)峭ㄟ^2個(gè)二硫鍵連接在一起的，PDI還原酶破壞二硫鍵，A鏈保持溶解狀態(tài)，B鏈發(fā)生聚合導(dǎo)致吸光度（540～650 nm）增加。因此通過檢測(cè)反應(yīng)液吸光度可測(cè)定PDI的活性。

3結(jié)果

31PDI抑制活性

該4種生物堿均能抑制PDI活性，并且25 μmol·L-1的抑制效果都是最好，更接近只加胰島素組的吸收值，見圖1。而031 μmol·L-1時(shí)，4種生物堿抑制活性明顯低于其他濃度，但依然有明顯的抑制效果。其中Nmethycolaurine組中，當(dāng)濃度為25 μmol·L-1時(shí)（IP+25 μmol·L-1曲線），其吸收曲線與單純加入insulin的曲線基本重合，表明25 μmol·L-1的Nmethycolaurine可以把實(shí)驗(yàn)體系中的PDI活性基本完全抑制，見圖2A。當(dāng)藥物濃度遞減時(shí)，抑制程度也遞減。Neferine組中，IP+25 μmol·L-1曲線雖然沒有與Insulin曲線重合，但也非常接近?？梢娖涓邼舛纫种菩Ч^好。Liensinine組中，031，091 μmol·L-1抑制效果接近；而83 μmol·L-1曲線與25 μmol·L-1曲線幾乎重合，暗示濃度超過83 μmol·L-1時(shí)，liensinine對(duì)PDI的抑制效果已經(jīng)飽和。endprint

為量化上述4種生物堿在抑制PDI活性中的差異，計(jì)算上述4種生物堿分別在031，093，83，25 μmol·L-1下的抑制效率，通過5個(gè)點(diǎn)模擬濃度與抑制程度的曲線，見圖3。其中Nmethycolaurine曲線在給定濃度下，均在其他3個(gè)曲線上方，其抑制效果最好（與圖2推斷一致），IC50也是4組數(shù)據(jù)中最小。根據(jù)本次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，4種生物堿對(duì)PDI的抑制強(qiáng)度由高到低可能是Nmethycoclaurine（IC50 14 μmol·L-1），neferine（IC50 29 μmol·L-1），liensinine（IC50 40 μmol·L-1）以及 isoliensinine（IC50 54 μmol·L-1）。其中Nmethycoclaurine與isoliensinine之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=003）。

32化合物提取分離和結(jié)構(gòu)鑒定

本研究從蓮子心乙醇提取物中分離鑒定了12個(gè)單體化合物。首次分離出N甲基烏藥堿、山柰酚、金圣草素7O新橘皮糖苷以及甘露醇。

化合物1白色粉末（甲醇），mp 180～182 ℃。TLC檢測(cè)，置紫外光燈（365 nm）下檢視為藍(lán)色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱顯色，日光下檢視為橘黃色斑點(diǎn)。ESIMS m/z 300 [M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：363（2H，m，H1），277（1H，m，H3a），313（1H，m，H3b），268（1H，m，H4a），272（1H，m，H4b），652（1H，s，H5），638（1H，s，H8），273（1H，m，H11a），302（1H，m，H11b），699（2H，d，J=84 Hz，H2′，6′），669（2H，d，J=84 Hz，H3′，5′），364（3H，s，OCH3），243（3H，s，NCH3），915（1H，s，7OH），871（1H，s，4′OH）；13CNMR（DMSOd6，150 MHz） δ：641（C1），465（C3），245（C4），1144（C5），1452（C6），1443（C7），1115（C8），1303（C9），1261（C10），395（C11），1280（C1′），1301（C2′，6′），1149（C3′，5′），1551（C4′），552（OCH3），423（NCH3）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[19]對(duì)比，確定化合物1為N甲基烏藥堿（Nmethycoclaurine）。

化合物2淡黃色粉末（甲醇），mp 59～61 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。TCL檢測(cè)，置紫外光燈（364 nm）下檢視為藍(lán)色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱日光燈下檢視為橘黃色斑點(diǎn)。ESIMS m/z 626 [M+H]+。13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：644（C1），423（2NCH3），468（C3），254（C4），1290（C4a），1111（C5），1473（C6），558（6OCH3），1483（C7），1122（C8），1303（C8a），406（C9），1317（C10），1302（C11），1132（C12），1442（C13），555（C13OCH3），1133（C14），1302（C15），647（C1′），426（2′NCH3），474（C3′），258（C4′），1257（C4′a），1110（C5′），1464（C6′），549（6′OCH3），1472（C7′），556（7′OCH3），1194（C8′），1299（C8′a），403（C9′），1298（C10′），1226（C11′），1439（C12′），1576（C13′），1171（C14′），1244（C15′）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[20]對(duì)比，確定化合物2為甲基蓮心堿（neferine）。

化合物3淡黃色粉末（甲醇），mp 70～72 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。TCL檢測(cè)，置紫外光燈（365 nm）下檢視為藍(lán)色熒光，改良的碘化鉍鉀為顯色劑，105 ℃加熱日光燈下檢視為橘黃色斑點(diǎn)。ESIMS m/z 612 [M+H]+。13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：642（C1），422（2NCH3），460（C3），249（C4），1304（C4a），1109（C5），1445（C6），549（6OCH3），1455（C7），1133（C8），1312（C8a），402（C9），1314（C10），1302（C11），1132（C12），1427（C13），552（C13OCH3），1140（C14），1302（C15），645（C1′），424（2′NCH3），469（C3′），258（C4′），1253（C4′a），1122（C5′），1433（C6′），555（6′OCH3），1453（C7′），1191（C8′），1301（C8′a），396（C9′），1316（C10′），1110（C11′），1487（C12′），1576（C13′），1157（C14′），1251（C15′）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[20]對(duì)比，確定化合物3為異蓮心堿（isoliensinine）

化合物4白色無(wú)定形粉末（甲醇），mp 96～98 ℃，易溶于甲醇、氯仿，微溶于石油醚。以蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，進(jìn)行TLC檢驗(yàn)。分別以3個(gè)溶劑系統(tǒng)展開：氯仿甲醇二乙胺（20∶1∶1）、乙酸乙酯甲醇二乙胺（18∶1∶1）和丙酮甲醇二乙胺（30∶1∶1），以改良的碘化鉍鉀為顯色劑?；衔?色譜中，在與蓮心堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；置紫外光燈（365 nm）下檢視，顯相同的熒光斑點(diǎn)，Rf分別為053，039，051。因此確定化合物4為蓮心堿（liensinine）。

化合物5黃色粉末（甲醇），mp 188～190 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應(yīng)陽(yáng)性，提示結(jié)構(gòu)中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性。ESIMS m/z 612 [M+H]+。13CNMR（CD3OD，125 MHz）δ：1594（C2），1356（C3），1795（C4），1632（C5），1010（C6），1663（C7），948（C8），1586（C9），1056（C10），1232（C1′），1176（C2′），1458（C3′），1499（C4′），1160（C5′），1235（C6′）1047（Glc1），787（Glc2），758（Glc3），714（Glc4），773（Glc5），685（Glc6），1024（Rha1），723（Rha2），722（Rha3），741（Rha4），689（Rha5），179（Rha6）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[21]對(duì)比，確定化合物5為蘆?。╮utin，quercetin3Orutinoside）。endprint

化合物6黃色針晶（甲醇），mp 329～331 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應(yīng)呈陽(yáng)性，提示結(jié)構(gòu)中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESIMS m/z 287[M+H]+。1HNMR（C5D5N，500 MHz）δ：694（1H，s，H3），673（2H，s，H6，H8），792（1H，d，J=25 Hz，H2′），730（1H，d，J=80 Hz，H5′），754（1H，d，J=80 Hz，H6′）；DEPTQSP（C5D5N，125 MHz）δ：1659（C2），1050（C3），1838（C4），1595（C5），1009（C6），1668（C7），958（C8），1642（C9），1060（C10），1206（C1′），1156（C2′），1487（C3′），1526（C4′），1179（C5′），1240（C6′）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[22]對(duì)比，確定化合物6為木犀草素（luteolin，3′，4′，5，7tetrahydroxyflavone）。

化合物7黃色粉末（甲醇），mp 218～222 ℃。鹽酸鎂粉反應(yīng)呈陽(yáng)性，Molish反應(yīng)呈陽(yáng)性。ESIMS m/z 465[M+H]+。1HNMR（CD3OD，600 MHz）δ：622（1H，s，H6），641（1H，s，H8），761（1H，d，J=84 Hz，H2′），689（1H，d，J=84 Hz，H5′），760（1H，dd，J=84，20 Hz，H6′），527（1H，d，J=77 Hz，Glc1）；13CNMR（CD3OD，150 MHz）δ：1570（C2），1342（C3），1781（C4），1616（C5），985（C6），1646（C7），933（C8），1576（C9），1043（C10），1216（C1′），1146（C2′），1445（C3′），1484（C4′），1161（C5′），1218（C6′），1029（Glc1），743（Glc2），769（Glc3），698（Glc4），767（Glc5），611（Glc6）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[23]對(duì)比，確定化合物7為金絲桃苷（hyperoside，quercetin3Ogalactoside）。

化合物8黃色無(wú)定形粉末（甲醇），mp 268～270 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應(yīng)陽(yáng)性，提示結(jié)構(gòu)中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，Molish 反應(yīng)陽(yáng)性。ESIMS m/z 433[M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：678（1H，s，H3），628（1H，s，H6），802（2H，d，J=90 Hz，H2′，6′），689（2H，d，J=90 Hz，H3′，5′），500（1H，d，J=108 Hz，Glc1），378（1H，d，J=102 Hz，Glc2），460（1H，m，Glc3），384（1H，t，J=90 Hz，Glc4），354（1H，m，Glc5），498（1H，d，J=102 Hz，Glc6），479（1H，d，J=102 Hz，Glc6）；13CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1644（C2），1029（C3），1826（C4），1616（C5），986（C6），1631（C7），1045（C8），1565（C9），1051（C10），1221（C1′），1294（C2′），1163（C3′），1609（C4′），1162（C5′），1294（C6′），738（Glc1），713（Glc2），791（Glc3），710（Glc4），823（Glc5），618（Glc6）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[24]對(duì)比，確定化合物8為牡荊苷（vitexin，apigenin8CβDglucopyranoside）。

化合物9黃色粉末（甲醇），mp 226～228 ℃。三氯化鐵鐵氰化鉀反應(yīng)陽(yáng)性，提示結(jié)構(gòu)中有酚羥基存在；鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性。ESIMS m/z 285[M-H]-。13 CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1468（C2），1357（C3），1759（C4），1607（C5），982（C6），1640（C7），935（C8），1562（C9），1030（C10），1217（C1′），1295（C2′），1154（C3′），1592（C4′），1154（C5′），1295（C6′）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[25]對(duì)比，確定化合物9為山柰酚（kaempferol，3，4′，5，7tetrahydroxyflavone）。

化合物10淡黃色粉末（甲醇），mp 128～129 ℃，易溶于甲醇，不溶于氯仿、乙酸乙酯。三氯化鐵鐵氰化鉀反應(yīng)陽(yáng)性，提示結(jié)構(gòu)中含有酚羥基；鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性。ESIMS m/z 609[M+H]+。1HNMR（DMSOd6，600 MHz）δ：693（1H，s，H3），636（1H，d，J=24 Hz，H6），681（1H，d，J=24 Hz，H8），752（1H，d，J=24 Hz，H2′），751（1H，dd，J=90，2，4 Hz，H5′），691（1H，d，J=90 Hz，H6′），383（3H，s，3′OCH3），516（1H，d，J=78 Hz，Glc1），528（1H，d，J=60 Hz，Rha1），115（3H，d，J=66 Hz，Rha6）；13 CNMR（DMSOd6，150 MHz）δ：1641（C2），1034（C3），1819（C4），1600（C5），993（C6），1625（C7），946（C8），1569（C9），1054（C10），1212（C1′），1103（C2′），1508（C3′），559（3′OCH3），1480（C4′），1157（C5′），1203（C6′），979（Glc1），771（Glc2），770（Glc3），696（Glc4），763（Glc5），604（Glc6），1004（Rha1），704（Rha2），703（Rha3），718（Rha4），682（Rha5），179（Rha6）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[26]對(duì)比，確定化合物10為金圣草素7O新橘皮糖苷（chrysoeriol7Oneohesperidoside）。endprint

化合物11白色無(wú)定型粉末（甲醇），溶于甲醇、乙醚等有機(jī)溶劑，不溶于水。1HNMR（CDCl3，600 MHz）δ：088（3H，t，J=78 Hz，CH3），126（26H，m，13×CH2），159（2H，br s，CH2CH2Cl），342（2H，s，CH2Cl）；13CNMR（CDCl3，150 MHz）δ：178（C1），232（C2），334（C3），297（C4～13），319（C14），227（C15），141（C16）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[27]對(duì)比，確定化合物11為氯代正十六烷（1chlorohexadecane）。

化合物12白色斜方狀針晶（甲醇），mp 166～168 ℃，易溶于水，略溶于乙醇。1HNMR（D2O，500 MHz）δ：372（4H，m，H1，6），361（2H，dd，J=10，61 Hz，H2，5）、361（2H，dd，J=130，70 Hz，H3，4）。13CNMR（D2O，125 MHz）δ：645（C1，C6），706（C2，C5），724（C3，C4）。經(jīng)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[30]對(duì)比，確定化合物12為甘露醇（Dmannitol）。

4討論

芐基異喹啉類生物堿是生物堿中一類重要生理活性極強(qiáng)的生物堿，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在抗腫瘤方面顯示了較強(qiáng)的活性[31]。蓮子心中的生物堿屬于此類生物堿，蓮子心的抗腫瘤活性已有很多報(bào)道[1113]，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）參與腫瘤的病理過程也已得到證實(shí)[17]。為了了解PDI是否與來源于蓮子心的生物堿有相互作用，研究了蓮子心中的N甲基烏藥堿、蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿對(duì)PDI的抑制效果，其中N甲基烏藥堿為首次從蓮子心中分離得到。

研究發(fā)現(xiàn)上述4種生物堿均有抑制PDI活性的作用。通過計(jì)算IC50，發(fā)現(xiàn)4種生物堿對(duì)PDI的抑制強(qiáng)度由高到低可能是N甲基烏藥堿，甲基蓮心堿，蓮心堿以及異蓮心堿。目前數(shù)據(jù)顯示N甲基烏藥堿與異蓮心堿之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（

P<005）。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看只有N甲基烏藥堿是單芐基異喹啉型生物堿，甲基蓮心堿，蓮心堿以及異蓮心堿均為雙芐基異喹啉型生物堿，但由于數(shù)據(jù)量的局限，無(wú)法確定單芐基異喹啉型生物堿對(duì)PDI抑制活性強(qiáng)于雙芐基異喹啉型生物堿。研究表明，N甲基烏藥堿等可以作為PDI活性的體外模型中的抑制劑。然而，在體內(nèi)病理環(huán)境下，N甲基烏藥堿能否依然抑制PDI活性而達(dá)到治療效果還需要更多的深入研究。

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[責(zé)任編輯丁廣治]endprint