田晨，趙宗江，張豐豐，張新雪，程明秀，王穎超，趙敬，楊美娟

益髓生血顆粒對AA大鼠CD4+CD25+Foxp3調(diào)節(jié)性T細胞的影響＊

田晨，趙宗江＊＊，張豐豐，張新雪，程明秀，王穎超，趙敬，楊美娟

（北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院北京100029）

目的：觀察益髓生血顆粒對再生障礙性貧血（Aplastic Anemia，AA）大鼠CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T Cell，Treg細胞）的影響及其治療AA的作用機制。方法：取雄性SD大鼠按體重隨機分組。其中模型組連續(xù)7周隔天皮下注射苯（1 mL·kg-1）、取材10天前開始腹腔注射環(huán)磷酰胺（25 mL·kg-1），連續(xù)3天，第4周將模型組大鼠按體重隨機分為模型組、司坦唑醇組、益髓生血顆粒組，灌胃給藥。正常組及模型對照組給予等體積生理鹽水。實驗結(jié)束時，檢測外周血WBC、RBC、HGB、PLT；制備血涂片、骨髓涂片；免疫組織化學法檢測脾組織Treg細胞Foxp3蛋白表達；RT-PCR法檢測骨髓組織Foxp3 mRNA的表達。結(jié)果：與正常組比較，模型組WBC、RBC、HGB、PLT均顯著減少（P＜0.01），血涂片示血細胞通透性差、白細胞減少、退化細胞增多，骨髓涂片示脂肪滴明顯增加、造血細胞均明顯降低、非造血細胞增多；經(jīng)益髓生血顆粒組治療后WBC、RBC、HGB、PLT均顯著增加（P＜0.01），血涂片及骨髓涂片顯示細胞通透性好轉(zhuǎn)、形態(tài)趨于正常、脂肪滴明顯減少，造血細胞均明顯增加，脾組織Foxp3蛋白及骨髓組織Foxp3 mRNA表達明顯升高（P＜0.01）。結(jié)論：益髓生血顆?？缮险{(diào)Foxp3的基因及蛋白表達，調(diào)控AA免疫功能，進而改善AA免疫環(huán)境，促進骨髓造血功能的恢復，發(fā)揮治療AA的重要作用。

再生障礙性貧血大鼠益髓生血顆粒CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞Foxp3

再生障礙性貧血（Aplastic Anemia，AA）患者多表現(xiàn)為貧血、出血、感染等。細胞免疫異常，特別是T細胞異常是AA的主要發(fā)病機制之一。近年研究證實CD4+CD25+Treg細胞在AA時中多存在數(shù)量及功能的異常[1,2]。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead/ winged Helix Transcription Factor P3，F(xiàn)oxP3）特異性表達于CD4+CD25+Treg細胞，是其特征性標志，可影響CD4+CD25+Treg細胞功能的發(fā)揮。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)AA大鼠存在免疫功能異常，如CD4+、CD8+T淋巴細胞數(shù)量及比例異常，Th1/Th2細胞失衡。基于“腎藏精”立方的益髓生血顆?？筛纳艫A大鼠T淋巴細胞群的紊亂，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞平衡[3，4]。為進一步研究其調(diào)節(jié)AA免疫功能的分子生物學機制，本研究采用苯與CTX聯(lián)合制備AA大鼠模型，觀察益髓生血顆粒對AA大鼠Foxp3蛋白及基因表達的影響，探尋CD4+CD25+Treg細胞在AA發(fā)病機制中的作用，為益髓生血顆粒治療AA的免疫機制及臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級、雄性SD大鼠55只，體重200±20 g（購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證：SCXR京2009-0007）。

1.2 實驗藥物

益髓生血顆粒（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院，批號：20110506），由熟地、山萸肉、補骨脂、阿膠、炙黃芪、何首烏等共11味中藥組成；司坦唑醇片（即康力龍，廣西南寧百會藥業(yè)，批號：100820）。

1.3 主要試劑

苯（北京化工廠，批號：20110808），環(huán)磷酰胺（山西普德藥業(yè)，批號：20101103），F(xiàn)oxp3抗體（英國Abcam艾美捷科技有限公司，批號：ab22510），山羊血清封閉液（北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW0130），GFVisionTMⅡ抗鼠/兔通用型免疫組織化學檢測試劑盒（DAKO基因科技公司，批號：GK500705），蘇木素染液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9610），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司，A3500，批號：0000073779），Go Taq?Green Mix（美國Promega公司，M1722，批號：0000040423），DEPC（美國Ameresco公司，批號：E14-25G），異丙醇（北京化工廠，批號：20150524），50×TAE（美國Ameresco公司，批號：13354C413），Goldview、DNA Marker（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，批號：20161201、20150801），F(xiàn)oxp3、GAPDH引物合成于生工生物有限公司。

1.4 主要儀器

L340099光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司），552BR電泳儀（美國Bio-RAD公司），153BR轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-RAD公司），C1000PCR儀（美國Bio-RAD公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組與處理

SD大鼠55只，適應性喂養(yǎng)1周后按體重隨機分為正常組10只，造模組45只。將造模組連續(xù)7周隔天皮下注射苯（1 mL·kg-1）、取材10天前開始腹腔注射環(huán)磷酰胺（25 mg·kg-1），連續(xù)3天，制備AA大鼠模型。將造模組大鼠按體重隨機分為模型組、司坦唑醇組、益髓生血組。第4周開始灌胃治療，司坦唑醇組、益髓生血組均按照為成人臨床用量的7倍計算灌胃，益髓生血組按3.5 g·kg-1灌胃給藥，司坦唑醇組按1.4 mg·kg-1灌胃給藥，灌胃劑量為1 mL·100 kg-1）。正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃，用藥治療4周。

2.2 標本采集

第8周末取材，腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL· 100 g-1）麻醉，股動脈取血1.5 mL于EDTA抗凝管中，搖動混勻，取其中一滴制備血涂片，其余用于檢測血常規(guī)；無菌摘取大鼠股骨并取少量制備骨髓涂片，剩余骨髓用鋁箔紙包裹（鋁箔紙需提前使用DEPC水處理），迅速在液氮中固定，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于RT-PCR實驗；無菌摘取大鼠脾組織并制備石蠟切片，用于免疫組織化學實驗。

2.3 外周血象檢查

血常規(guī)檢測AA大鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT等指標的變化。

2.4 外周血細胞及骨髓細胞形態(tài)的觀察

制作均勻的血涂片及骨髓涂片，經(jīng)瑞氏染色，染色步驟參照試劑說明進行，于普通光鏡下觀察各組大鼠血細胞及骨髓細胞的形態(tài)學改變。

2.5 免疫組織化學方法檢測脾組織Foxp3蛋白表達

將脾組織石蠟切片脫蠟至水，經(jīng)消除內(nèi)源性過氧化物酶活性、微波修復及10%山羊血清封閉后，一抗（Foxp3）濃度1∶100，二抗?jié)舛?∶500，DAB顯色，陰性對照用0.1 mol·L-1PBS代替一抗，蘇木素復染、脫水并封片。顯微鏡觀察，陽性表達為棕黃色顆粒；每組隨機選取8個視野，采用Image pro-Plus6.0進行圖像分析，測定陽性表達光密度值（IOD）表示脾組織Foxp3的相對表達量。

2.6 RT-PCR方法檢測骨髓組織Foxp3 mRNA表達

應用TrizoL法提取AA大鼠骨髓組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應條件如下：15 min（42℃），5 min（95℃），5 min（4℃）。以1μL cDNA為模板，擴增Foxp3、GAPDH，引物序列等詳見表1。PCR擴增條件如下：2 min（95℃）、1 min（95℃）、1 min（72℃），38個循環(huán)，5 min（72℃）。配置1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，恒壓100 V 30 min，紫外凝膠分析儀觀察、照相，用Fluor Chem軟件對特異性電泳條帶進行分析，以Foxp3/GAP?DH的IOD比值作為骨髓組織Foxp3 mRNA的相對表達量。

2.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 22.0進行分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學意義。

表1 Foxp3及GAPDH基因引物序列及其擴增產(chǎn)物大小

3 結(jié)果

3.1 益髓生血顆粒對AA大鼠一般狀態(tài)的影響

正常組大鼠精神活潑，毛發(fā)有光澤，二便及攝食正常；模型組大鼠精神狀態(tài)不佳，毛發(fā)干枯，皮毛松弛蓬亂，部分大鼠有明顯脫毛及皮損，大便溏稀，攝食減少，體態(tài)較消瘦，大鼠耳廓、唇口、爪甲蒼白色，呈明顯的貧血貌。與模型組比較，益髓生血組大鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，毛發(fā)色澤、二便及攝食等均有所改善，尤其是貧血癥狀改善明顯。

3.2 益髓生血顆粒對AA大鼠外周血象的影響

與正常組比較，模型組大鼠外周血中RBC、WBC、HGB、PLT均表達減少（P＜0.01）；與模型組比較，司坦唑醇組、益髓生血組RBC、HGB、PLT均表達增多，且有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05），司坦唑醇組、益髓生血組WBC均顯著性增多，具有極顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見表2）。

3.3 益髓生血顆粒對AA大鼠血細胞及骨髓細胞形態(tài)的影響

由圖1可見，正常組外周血細胞形態(tài)、數(shù)量均較正常且細胞分布均勻；與正常組比較，模型組外周血細胞數(shù)量減少、大小形態(tài)不均，且多呈散狀分布；與模型組比較，司坦唑醇組、益髓生血顆粒組外周血細胞形態(tài)趨于正常、退化細胞減少。

由圖2可見，正常組骨髓組織脂肪滴數(shù)量較少，造血細胞較多；模型組骨髓組織脂肪滴數(shù)量顯著增加，三系細胞均明顯降低，存在較多的非造血細胞，司坦唑醇組、益髓生血顆粒組骨髓組織脂肪滴減少，骨髓有核細胞數(shù)量增多，非造血細胞數(shù)量有所減少。

3.4 益髓生血顆粒對AA大鼠脾組織Foxp3蛋白表達的影響

由表3、圖3可知，F(xiàn)oxp3為CD4+CD25+Treg細胞的重要轉(zhuǎn)錄因子，定位于細胞核。本次脾組織免疫組化結(jié)果顯示：脾組織動脈周圍淋巴鞘附近Foxp3蛋白表達較多，少量表達于白髓與紅髓交界。與正常組比較，模型組脾組織Foxp3蛋白表達明顯減少（P＜0.01），與模型組比較，司坦唑醇組、益髓生血顆粒組脾組織Foxp3蛋白表達明顯增加（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 益髓生血顆粒對AA大鼠外周血象的影響（xˉ±s,n=6）

圖1 再生障礙性貧血大鼠血細胞涂片

圖2 再生障礙性貧血大鼠骨髓涂片

表3 益髓生血顆粒對AA大鼠脾組織Foxp3表達的影響（xˉ±s,n=8）

圖3 益髓生血顆粒對AA大鼠脾組織Foxp3蛋白表達的影響

3.5 益髓生血顆粒對骨髓組織Foxp3mRNA表達的影響

由表4、圖4可知，與正常組比較，模型組骨髓組織中Foxp3 mRNA表達明顯減少（P＜0.01），與模型組比較，司坦唑醇組、益髓生血顆粒組Foxp3 mRNA表達明顯增加（P＜0.05）。

4 討論

AA是以全血細胞減少為主要特點的血液疾病，多出現(xiàn)貧血、出血、感染等臨床癥狀。中醫(yī)依據(jù)其臨床特點將AA歸為“虛勞”、“血虛”、“髓勞”等疾病范疇。AA以貧血為其主要癥狀，中醫(yī)學認為，血液化生與腎藏精密切相關，《醫(yī)精經(jīng)義》曰：“腎藏精，精生髓，髓生骨…精足則髓足”，《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問》曰：“骨髓堅固，氣血皆從”，精髓化生血液主要取決于腎。AA的基本病機在于腎虛，腎不藏精、生髓，髓不化血[7]，血化不足，則出現(xiàn)血虛表現(xiàn)，如面色蒼白、頭暈乏力、心悸氣短、唇甲色淡、眩暈耳鳴等癥狀，故腎是AA發(fā)病的本臟所在。目前，“以腎為本、從腎論治”是治療AA的主流觀點[8]，臨床療效也在實踐中不斷提高。在“腎藏精，生髓化血”理論指導下，以補腎填精、益髓生血為治療大法，輔以健脾疏肝、活血化瘀等，調(diào)整陰陽，調(diào)理五臟，化生氣血。王運律[9,10]治療AA以“補腎為本、辨明陰陽”為原則，健脾補腎，脾腎相協(xié)，精血相生，改善骨髓造血功能。莊海峰等[11]用補腎法治療慢性AA患者36例，分為腎陽虛型、腎陰虛型、腎陰陽兩虛型三型，經(jīng)補腎治療后，患者臨床癥狀較前明顯好轉(zhuǎn)，說明補腎法治療AA療效明顯，并減少西藥不良反應。故本團隊依據(jù)AA的基本病機及在“腎藏精，生髓化血”的中醫(yī)經(jīng)典理論的指導下組方遣藥，組成益髓生血顆粒。益髓生血顆粒以補腎益髓為主、輔以健脾養(yǎng)肝，在治療AA時具有較好的臨床療效。益髓生血顆粒中以山茱萸、何首烏為君藥，重在滋補腎陰，輔以補骨脂生發(fā)陽氣，使陰得陽升而泉源不竭，同時輔以健脾化瘀之味，使血化有源。

表4 益髓生血顆粒對AA大鼠骨髓Foxp3表達的影響（xˉ±s,n=3）

圖4 益髓生血顆粒對AA大鼠骨髓Foxp3 mRNA表達的影響

現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，AA時多存在T淋巴細胞的異常激活及分泌過多現(xiàn)象，致使造血負調(diào)控因子表達增加，進而誘導造血干細胞凋亡，最終發(fā)展為骨髓造血功能衰竭[12，13]。其發(fā)病環(huán)節(jié)以細胞免疫異常為主，其中除免疫激活導致活化的效應性細胞增多如Th1/Th2比例升高，CD8+T細胞增加、CD4+/CD8+比值降低，甚至倒置[14,15]，還伴有自身免疫耐受被打破的過程。Sakaguchi等[16]在1995年首次報道了CD4+CD25+Treg細胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞群。研究證實[17]，CD4+CD25+Treg細胞具有免疫抑制作用，可抑制CD4+、CD8+T細胞的增殖與活化，抑制初始T細胞和記憶性T細胞增殖。CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量缺乏或功能缺陷會導致機體免疫功能失常，CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量缺陷是AA患者免疫耐受破壞的重要原因之一[18]。動物實驗顯示[19]，向AA小鼠模型中注入CD4+CD25+Treg細胞后小鼠骨髓造血功能較前改善。CD4+CD25+Treg細胞與Foxp3基因的表達與機體的免疫狀態(tài)有著緊密的聯(lián)系。Foxp3是CD4+CD25+Treg細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，被公認為是其最具有特異性的分子標志物[20]，是一正向調(diào)節(jié)蛋白，可調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細胞發(fā)育和功能，可影響AA時免疫耐受[21]。課題組前期研究證實了AA大鼠外周血存在T細胞的異常活化，其中CD3、CD4細胞數(shù)量顯著降低，CD8細胞數(shù)量相對增多，CD4+/CD8+比值降低，甚至出現(xiàn)倒置。脾組織、骨髓作為主要的免疫器官，在AA的發(fā)病中起著重要的作用。T-bet、GATA-3分別為Th1、Th2細胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子，AA大鼠脾組織、骨髓中T-bet蛋白表達增加，GATA-3蛋白表達降低，經(jīng)益髓生血顆粒治療后，IFN-γ、T-bet蛋白表達顯著降低，GATA-3蛋白表達顯著增加，證實益髓生血顆?？烧{(diào)節(jié)Th1/Th2，調(diào)節(jié)AA免疫系統(tǒng)、延緩疾病進展[4]。本研究角度從具有特異性免疫調(diào)節(jié)作用的Treg細胞入手，探討益髓生血顆粒調(diào)控AA免疫耐受的作用機制。

研究結(jié)果表明，AA大鼠Foxp3蛋白及mRNA表達下降，說明調(diào)節(jié)性T細胞減少，故而調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制作用減弱，導致T細胞異?；罨鹪僬?。經(jīng)益髓生血顆粒治療后，脾組織Foxp3蛋白、骨髓組織Foxp3 mRNA顯著高于模型組，提示補腎益髓生血法可能通過增加Foxp3表達來調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg細胞，發(fā)揮免疫抑制作用，進而促進骨髓造血功能的恢復。本研究闡明了益髓生血顆粒對AA大鼠免疫調(diào)節(jié)作用機制，部分闡明了益髓生血顆粒治療AA的作用機制，為臨床治療AA提供新的思路和方向。

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Effect of Yisui Shengxue Granules on CD4+CD25+Foxp3 Regulatory T Cells ofAplasticAnemia in Rats

Tian Chen,Zhao Zongjiang,Zhang Fengfeng,Zhang Xinxue,Cheng Mingxiu, Wang Yinchao,Zhao Jing,Yang Meijuan
(College of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

This paper was aimed to observe the effect of Yisui Shengxue(YSSX)granules on CD4+CD25+regulatory T cells(Treg cells)and its treatment mechanism in aplastic anemia(AA)rats.Male SD rats were selected and randomly divided into different groups according to their weight.In the model group,subcutaneous injection of benzene(1 mL·kg-1) was given every other day for 7 consecutive weeks.Ten days before the rats were sacrificed,intraperitoneal injection of CTX(25 mL·kg-1)was given for 3 consecutive days.On the 4thweek,model rats were divided into the model group, stanozolol group,and the YSSX granules group.Intragastric administration of corresponding drug was given.Same volume of normal saline was given to the normal group and the model group.At the end of the experiment,WBC,RBC, HGB and PLT in peripheral blood were detected.Blood smear and bone marrow smear were prepared.The Foxp3 protein expression of Treg cells in spleen tissues was detected by immunohistochemistry(IHC).RT-PCR was used to detect the Foxp3 mRNA expression in bone marrow tissues.The results showed that compared with the normal group,WBC,RBC, HGB and PLT in the model group were significantly reduced(P＜0.01).The blood smear showed poor permeability of blood cells,reduced WBCs,and increased degenerated cells.The bone marrow smear indicated significantly increased fat drops,significantly reduced hematopoietic cells,and increased nonhematopoietic cells.After the treatment of YSSX granules,WBC,RBC,HGB and PLT were significantly increased(P＜0.01).Both the blood smear and bone marrow smear showed cell permeability improvement,cell form returns to normal,fat drops significantly reduced,significantly increased hematopoietic cells,significantly increased Foxp3 protein expression in spleen tissues and Foxp3 mRNA expression in bone marrow tissues(P＜0.01).It was concluded that YSSX granules can upregulate both gene and protein expression of Foxp3,regulate AA immune function in order to improve the AA immune environment,promote the recovery of bone marrow hematopoietic function,which played an important role in AA treatment.

Aplastic anemia,rat,Yisui Shengxue granules,CD4+CD25+,regulatory T cells,Foxp3

10.11842/wst.2017.05.008

R96

A

（責任編輯：陳寧，責任譯審：王晶）

2017-05-06

修回日期：2017-06-05

＊北京中醫(yī)藥大學自主選題項目（2013360YZH010222）：課題名稱：益髓生血顆粒對再生障礙性貧血大鼠CD4CD25 Foxp3Treg調(diào)節(jié)性T細胞的影響，負責人：田晨；科學技術(shù)部國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973計劃”項目（2010CB530400）：基于“腎藏精”的臟象理論基礎研究，負責人：王擁軍；科學技術(shù)部國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973計劃”項目（2010CB530406）：從障礙性貧血探討“腎生髓”理論的研究，負責人：吳志奎。

＊＊通訊作者：趙宗江，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治慢性腎病與障礙性貧血的基礎與臨床研究。