王東超，魏穎，高佳琪，劉一冰，屈玲霞，劉永巧，徐暾海＊＊，劉銅華

UPLC-ESI-MSn法測定糖痹康顆粒入血成分研究＊

王東超1,2,3，魏穎1,2,3，高佳琪1,2,3，劉一冰1，屈玲霞1,2,3，劉永巧1,2,3，徐暾海1,2,3＊＊，劉銅華2,3

（1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)養(yǎng)生學教育部重點實驗室北京100029；3.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)養(yǎng)生學北京市重點實驗室北京100029）

目的：通過UPLC-ESI-MSn方法定性分析糖痹康顆粒（TBK）的入血成分，初步闡明糖痹康顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：采用UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，在電噴霧離子源的正、負離子模式下，對空白血清、糖痹康顆粒經(jīng)大鼠給藥后的含藥血清進行檢測。根據(jù)離子碎片信息，偶電子規(guī)律，氮規(guī)則等并結(jié)合相應(yīng)參考文獻，定性分析并鑒定入血成分。結(jié)果：糖痹康顆粒灌胃給藥后，在大鼠血清中發(fā)現(xiàn)15個入血成分，其中13個是以原型成分被吸收，其余2個可能為代謝產(chǎn)物。結(jié)論：糖痹康入血成分是各組方藥味配伍后共同作用的結(jié)果，在大鼠血清中，多數(shù)成分已經(jīng)被大鼠代謝吸收，少數(shù)以原型成分吸收。本實驗為糖痹康顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和體內(nèi)代謝研究提供參考。

糖痹康顆粒UPLC-ESI-MSn入血成分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)

糖痹康顆粒（專利申請?zhí)枺?00810167551.1）主要由黃芪、桂枝、黃連、延胡索、雞血藤、黃芩、女貞子、水蛭組成，具有益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀通絡(luò)功效，對治療糖尿病周圍神經(jīng)病變具有良好的效果[1-5]。臨床研究表明糖痹康顆粒對糖尿病周圍神經(jīng)病變患者的肢體麻木、疼痛、感覺異常等癥狀改善明顯，對神經(jīng)傳導速度和末梢微循環(huán)有明顯的改善作用[6]。糖痹康在臨床試驗中對糖尿病周圍神經(jīng)病變具有明顯改善，但是要進一步研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制，需要更深入的研究，本實驗初步研究了糖痹康顆粒經(jīng)SD大鼠口服后的入血成分，希望通過對入血成分的鑒定，找到使糖痹康發(fā)揮藥理作用的有效成分，為其作用機制研究提供參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Thermo Scientific TM LTQ Orbitrap XL hybrid FT?MS instrument高分辨率質(zhì)譜（德國Thermo公司）；ML54/02電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；3K15型Sigma低溫高速離心機（德國Sigma公司）；ACQUITY UPLC?BEH C18Column（130?，1.7μm，2.1 mm×100 mm，美國Waters公司）。

1.2 試劑

糖痹康顆粒為北京中醫(yī)藥大學提供（批號：20150401）；戊巴比妥鈉（德國Merck公司，批號：bm-007）；乙腈（色譜純，美國Sigma-aldrich公司）；甲酸（美國Fisher公司）；水為Millipore-Q自制超純水。

表1 取血清時間表

表2 TBK色譜梯度洗脫條件

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠30只，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SCXK-（軍）2012-0004，體重290-330 g，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，溫度20℃-25℃，濕度45%（40%-70%），光照12h（7:00-19:00），噪音＜60分貝。

2 實驗方法

2.1 給藥途徑和方法

將SD大鼠隨機分為TBK給藥組15只、正常組15只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，開始灌胃給藥。糖痹康按照成人劑量的10倍給藥；正常組給與相同體積蒸餾水。每日灌胃1次，連續(xù)灌胃7日。

2.2 含藥血清樣品采集

所有大鼠實驗前禁食12 h（自由飲水），大鼠稱重后，按照表1時間點麻醉（30 g·L-1至1 mL·kg-1的戊巴比妥鈉溶液）后肝門靜脈取血。收集血清，靜置2 h后，4℃，4 000 rpm離心15 min，取上清，作為各個時間點的含藥血清，備用。

2.3 含藥血清樣品處理

取空白及含藥血清各0.5 mL，加2.5 mL乙腈，渦旋30 s后，4℃，4 000 rpm離心10 min，取上清液，35℃下氮氣吹干，加200 μL甲醇，渦旋30 s，復溶，4℃，13 000 rpm離心10 min，取上清液，備用。

2.4 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18Column（130?，1.7μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進樣量：0.2 μL；梯度洗脫程序見表2。

2.5 質(zhì)譜條件

正離子模式：毛細管溫度：350℃；鞘氣流速：40 arp；輔助鞘氣流速:20 arp；噴霧電壓：4 kV；源電流：100 μA；毛細管電壓：25 V；管透鏡電壓：110 V；負離子模式：毛細管溫度：350℃；鞘氣流速：40arp；輔助鞘氣流速：20arp；噴霧電壓：3 kV；源電流：100 μA；毛細管電壓：-35 V；管透鏡電壓：-110 V；樣品采用高分辨巧進行全掃描（Fullscan，F(xiàn)S），分辨率R設(shè)為30 000，掃描范圍m/z 50-1 500 amu；二級和三級質(zhì)譜采用動態(tài)DDS掃描，CID激活單位化25 q，激活時間30 ms，歸一化碰撞能量為35%，以離子阱打拿極檢測碎片離子。設(shè)置動態(tài)排除（DE），重復次數(shù)：30，重復時間：30 s，排除清單大?。?00，排除時間：60 s。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察

取“2.2”項下的含藥血清和空白血清進樣（圖1），雖然含藥血清和空白血清總離子流圖無明顯差異（圖2），可以精確提取出入血成分的離子流圖，表明內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾。

3.2 化學成分分析

含藥血清樣品按照“2.4”、“2.5”項下方法進樣，詳細分析，通過保留時間、精確分子量以及離子碎片信息解析色譜峰，進行成分指認和鑒定，從而確定TBK入血原型成分和可能的代謝產(chǎn)物。經(jīng)分析，共檢測出13種原型成分，2種代謝產(chǎn)物，可視為糖痹康顆粒的入血成分。

3.2.1 原型成分分析

通過體外TBK、含藥血清和空白血清的LC-MS/ MS分析，可以檢測到血清中多種成分（表3）。

3.2.2 代謝產(chǎn)物分析

在含藥血清中檢測到多種生物堿，故在血清中能夠檢測到生物堿代謝物的幾率很大。通過對m/z 50-550間主要離子的LC-MS/MS分析，2個二級質(zhì)譜中觀察到M-176，見表4。葡糖醛酸結(jié)合物是體內(nèi)最常見的的代謝產(chǎn)物存在形式[13-15]。由此推測這2個化合物是生物堿與葡萄糖醛酸結(jié)合物。在血清中，生物堿既以原形存在，也以與葡萄糖醛酸結(jié)合的形式存在。通過MS/MS數(shù)據(jù)推測2個這樣離子可能存在的結(jié)構(gòu)（圖2）。雖然明確是生物堿與葡萄糖醛酸結(jié)合物，但是生物體內(nèi)代謝復雜，TBK成分多樣且含有同分異構(gòu)現(xiàn)象，只依靠質(zhì)譜很難斷定其結(jié)構(gòu)，其代謝結(jié)構(gòu)可能還需要其他技術(shù)來鑒定區(qū)分。

圖1 含藥血清和空白血清總離子流圖

4 總結(jié)與討論

本實驗首次應(yīng)用UPLC-ESI-MSn對糖痹康顆粒入血成分進行分析，該方法效率高、穩(wěn)定性好、靈敏度高，能快速檢測出含量較低的化學成分，優(yōu)于其他方法。在血清處理的時間點上，分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、10、12 h時間點取血清，通過質(zhì)譜總離子流圖的信息比對，發(fā)現(xiàn)在0.5、1、1.5 h等時間點沒有發(fā)現(xiàn)不同，色譜信息大致相同，故選擇1 h進行數(shù)據(jù)分析。在血清處理上，為了在血清中獲得更多的數(shù)據(jù)信息，沒有采用SPE小柱法，通過比較乙腈沉淀法、甲醇沉淀法、乙酸乙酯沉淀法等方法，結(jié)果選擇了特征峰圖譜信息豐富的乙腈沉淀法。

在前期對糖痹康顆粒的體外成分研究中，發(fā)現(xiàn)該顆粒含有黃酮類、生物堿類、單萜苷類、苯乙醇苷類、酚酸類等50多種成分，但在本次實驗中，只檢測出13個原型成分和2個代謝產(chǎn)物，這些化合物可能來自黃芩、女貞子、黃連、延胡索。糖痹康顆粒的入血成分來源于該復方的各味組成方藥，黃芩中黃酮類成分具有抗炎作用，女貞子中紅景天苷具有養(yǎng)陰效用，黃連和延胡索中的生物堿類具有降糖作用，糖痹康顆粒治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥效也是各味藥材相輔相成作用的結(jié)果。本次實驗只發(fā)現(xiàn)少數(shù)原型成分和代謝產(chǎn)物，原因可能是生物機體內(nèi)代謝通路途徑復雜，多數(shù)已經(jīng)快速入血，并被機體代謝，只檢測到少數(shù)成分。通過本次實驗可以為糖痹康顆粒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究以及體內(nèi)活性作用機制提供參考。

圖2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)和M1（A）、M2（B）結(jié)構(gòu)圖

表3 入血化學成分鑒定表（正/負離子模式）

續(xù)表3

表4 2個代謝產(chǎn)物LC-MS/MS數(shù)據(jù)

1謝勤.糖痹顆粒對DM大鼠周圍神經(jīng)病變防治作用的機制研究.合肥:安徽中醫(yī)藥大學碩士學位論文,2014:39-41.

2易文明.糖痹康治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效觀察及機制研究,北京:北京中醫(yī)藥大學博士學位論文,2015:47-56.

3張雅嫻.糖痹康方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的隨機對照研究.蘭州:甘肅中醫(yī)學院碩士學位論文,2014:11-20.

4梁雪梅,田文秀.中藥復方糖痹康對2型糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的療效觀察.現(xiàn)代預防醫(yī)學,2015,42(14):2587-2589.

5張宏,劉銅華.糖痹康對高糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞的保護作用.中華中醫(yī)藥學刊,2012,30(6):1248-1251.

6呂翠巖,張勝容,趙文景,等.糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度的影響.時珍國醫(yī)國藥,2015,26(7):196-1598.

7趙保勝,董玲,劉洋,等.黃芩水提物的代謝特征譜研究.中國實驗方劑學雜志,2011,17(18):144-148.

8陳平平,董婉茹,曹敏,等.黃芩血清藥物化學的初步研究.中醫(yī)藥信息,2010,27(5):32-34.

9苗鳳茹,劉光宇,林力.延胡索總生物堿大鼠灌胃給藥后入血成分的定性研究.中國實驗方劑學雜志,2013,19(1):166-170.

10鮑天冬,李玉潔,楊慶,等.LC/MS測定大鼠灌胃黃連提取物后血漿中小檗堿、巴馬汀及其藥物動力學研究.中國實驗方劑學雜志, 2010,16(13):186-189.

11陳健龍,張玉玲,董宇,等.LC-MS/MS同時測定大鼠血漿中4種黃連生物堿的含量.中國實驗方劑學雜志,2013,19(13):174-178.

12程星燁,石鉞,孫虹,等.延胡索活性部位入血成分的LC-MS/MS研究.藥學學報,2009,44(2):167-174.

13 Ding B,Zhou T T,Fan G R,et al.Qualitative and quantitative determination of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo W.T.Wang by LC-MS/MS and LC-DAD.J Pharm Biomed Anal,2007,45(2)：219-226.

14 Deng Y T,Liao Q F,Li S H.Simultaneous determination of berberine, palmatine and jatrorrhizine by liquid chromatographytandem mass spec?trometry in rat plasma and its application in a pharmacokinetic study af?ter oral administration of coptisevodia herb couple.J Chromatogr B, 2008,863(2)：195-205.

15 Cheng X Y,Zhong D F,Jiang H,et al.Characterization of some glucuro?nide conjugates by electrospray ion trap mass spectrometry.Acta Pharm Sin,1998,33(11)：849-554.

Research on Component Determination of Tang-Bi-Kang Granules in Rat Serum by UPLC-ESI-MSnMethod

Wang Dongchao1,2,3,Wei Ying1,2,3,Gao Jiaqi1,2,3,Liu Yibing1,Qu Lingxia1,2,3, Liu Yongqiao1,2,3,Xu Tunhai1,2,3,Liu Tonghua2,3
(1.Collage of Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China; 2.Key Laboratory on Health Cultivation,the Ministry of Education,Beijing 100029,China; 3.Beijing Key Laboratory of Health Cultivation,Beijing 100029,China)

Through comprehensively characterizing components in blood after oral administration of Tang-Bi-Kang (TBK)granules by UPLC-ESI-MSn,this study was aimed to explain the pharmaceutical material basis of TBK initially. UPLC-LTQ-Orbitrap was used under both positive and negative ion modes of electrospray ionization.The blank serum and rat serum after oral administration of TBK were analyzed.Components in rat serum were identif i ed and characterized based on ion fragment information,evenelectron law,nitrogen rule and so on.Reference data was used to establish the UPLC-ESI-MSnmethod.The results showed that after oral administration of TBK granules,15 components were detected in the serum,of which 13 components were taken as the prototype to blood and 2 metabolites.It was concluded that constituents of TBK granules in rat serum were generated from compatibility of all herbal medicines.In rat serum,most of the components had been absorbed by rat’s metabolism;a few were absorbed as the prototype.This research provided references for pharmacodynamic material basis and metabolism of TBL granules in vivo.

Tang-Bi-Kang granules,UPLC-ESI-MSn,components in serum,pharmaceutical material basis

10.11842/wst.2017.05.012

R917

A

（責任編輯：韓馥蔓，責任譯審：王晶）

2017-04-17

修回日期：2017-05-20

＊科學技術(shù)部國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2012ZX09102201-001）：治療糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物糖痹康臨床前研究，負責人：劉銅華；北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊—中醫(yī)藥干預糖尿病及其并發(fā)癥研究團隊（2011-CXTD-19），負責人：劉銅華。

＊＊通訊作者：徐暾海，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥活性成分及其質(zhì)量控制研究。