鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中人叉頭框蛋白C2的水平變化及意義

鄒永平，李龍鶴

(海南省人民醫(yī)院，?？?70311)

目的 探討人叉頭框蛋白C2(FOXC2)在結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)變化及意義。方法 收集結(jié)直腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本40例份，使用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)癌組織和癌旁組織FOXC2 mRNA表達(dá)水平。采用Western blotting法檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8中FOXC2蛋白的表達(dá)。針對(duì)FOXC2基因設(shè)計(jì)4組shRNA干擾目的序列及無(wú)任何靶向位點(diǎn)的隨機(jī)序列，將序列剪切至慢病毒載體上，利用二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板中，分別標(biāo)記對(duì)照組、shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組，對(duì)照組加入插入隨機(jī)序列載體的慢病毒懸液，shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組分別加入插入4組shRNA干擾目的序列的慢病毒懸液，構(gòu)建穩(wěn)定knock-down FOXC2的細(xì)胞系。檢測(cè)各組FOXC2蛋白mRNA的表達(dá)。收集shFOXC2 1#組、shFOXC2 4#組及對(duì)照組(GV248細(xì)胞)的細(xì)胞，通過(guò)MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，劃痕修復(fù)試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，同時(shí)Western blotting法檢測(cè)E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、緊密連接蛋白1(Zo-1)、波形蛋白(Vimentin)的表達(dá)。結(jié)果 癌旁組織FOXC2 mRNA的表達(dá)量低于癌組織(P<0.05)。 HT29細(xì)胞系FOXC2蛋白表達(dá)量高于其他細(xì)胞系(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 4#組FOXC2蛋白表達(dá)量低，shFOXC2 1#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組FOXC2 mRNA表達(dá)量低(P均<0.05)。與對(duì)照組比較，shFOXC2 1#組、shFOXC2 4#組48、72 h細(xì)胞增殖活力、侵襲能力降低(P均<0.05)；E-cadherin、Zo-1蛋白表達(dá)量升高，Vimentin蛋白表達(dá)量降低(P均<0.05)。結(jié)論 FOXC2在人結(jié)直腸癌組織中水平升高，其可促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程的發(fā)生。

結(jié)直腸癌；人叉頭框蛋白C2；細(xì)胞增殖；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；細(xì)胞侵襲

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤，其發(fā)病率和病死率在全球呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。近年研究報(bào)道，人叉頭框蛋白C2(FOXC2)可能參與到部分惡性腫瘤的形成和發(fā)展，如乳腺癌上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、胰腺癌細(xì)胞增殖遷移的過(guò)程。2015年1～9月，本研究擬探討FOXC2在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及其對(duì)結(jié)直腸癌組織及細(xì)胞增殖、侵襲能力及EMT過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 組織、細(xì)胞及試劑儀器 結(jié)直腸癌組織40例份，相應(yīng)癌旁(距癌變邊緣15 cm)組織40例份，患者男26例，女14例；年齡32～70(52.3±11.9)歲；體質(zhì)量39.6～75.1(58.6±13.4)kg；TNM分期：Ⅰ期6例，ⅡA期10例，ⅡB期11例，Ⅲ期13例。取材后置于凍存管中液氮保存。實(shí)驗(yàn)所用的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院研究中心。一抗：FOXC2抗體(Abcam,ab55004)、E-cadherin抗體(Abcam, ab15148)、Zo-1抗體(Abcam, ab59720)、Vimentin抗體(Abcam, ab92547)、β-actin抗體(santa cruz, sc-4778)。二抗：山羊抗鼠IgG H&L (FITC，ab6785)，山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor?488，ab150077)。RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone)、Fetal Bovine Serum (Hyclone)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Maxima?First Strand cDNA Synthesis Kit, Fermentas)、定量PCR試劑盒(iQ SYBR Green Supermix, BioRad)、RNAiso Plus(TAKARA公司，9108)、Lipofectamine (Thermo Fisher Scientific公司，2000CAT)、細(xì)胞增殖能力檢測(cè)試劑盒(MTS, Promega)、BCA Assay Reagent(美國(guó)Pierce Chemical公司)、PVDF膜(Millpore公司)。

1.2 組織FOXC2 mRNA的檢測(cè) 采用RT-PCR法。TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA。紫外分光光度儀檢測(cè)RNA濃度，取RNA 5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用Cyber Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94 ℃ 4 min，擴(kuò)增條件 94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40 個(gè)循環(huán)。FOXC2上游引物：5′GATGCATTATCTTTGTCTCCTGATC3′；下游引物：5′GCTGCCCAGTTCTCAGCTCACAGGC3′；擴(kuò)增引物大小為319 bp。以β-actin為內(nèi)參基因，其上游引物序列為5′TGGCACCCAGCACAATGAA3′；下游引物序列為5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA3′；目的片段大小為186 bp。目的基因表達(dá)量以2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FOXC2蛋白的檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)HT29、SW620、SW480、LOVO、HCT116、LS174T、HCT8細(xì)胞中FOXC2蛋白表達(dá)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期2×106以上的待檢測(cè)細(xì)胞，IP裂解液冰上裂解1 h，15 000 g、15 min離心后提取上清液，收集蛋白質(zhì)，BCA 法行蛋白定量分析，配制10%丙烯酰胺膠，上樣，80 V穩(wěn)壓跑膠30 min，120 V穩(wěn)壓跑膠1 h，濕轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5 %脫脂奶粉封閉 1 h，一抗 4 ℃孵育過(guò)夜，二抗 37 ℃孵育 1.5 h，發(fā)光液曝光顯影。一抗?jié)舛缺葹?∶1 000，二抗?jié)舛缺葹?∶3 000，以β-actin作為內(nèi)參。ImageLab4.0軟件進(jìn)行灰度掃描，結(jié)果以相對(duì)灰度值表示。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定knock-down FOXC2細(xì)胞系的構(gòu)建 針對(duì)FOXC2基因設(shè)計(jì)4組shRNA干擾目的序列及無(wú)任何靶向位點(diǎn)的隨機(jī)序列，將序列剪切至慢病毒載體上，利用二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝成慢病毒懸液。將HT29接種至6孔板中，分別標(biāo)記對(duì)照組、shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組，對(duì)照組加入插入隨機(jī)序列載體的慢病毒懸液，shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組分別加入插入4組shRNA干擾目的序列的慢病毒懸液，構(gòu)建穩(wěn)定knock-down FOXC2的細(xì)胞系。具體方法如下：使用Lipofectamine 2000以2.5∶1的體積比將慢病毒shRNA質(zhì)粒(6 μg/dish)、packing質(zhì)粒(psPAX2, 4.5 μg/dish)和envelop質(zhì)粒(pMD2.G; 1.5 μg/dish)一并轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,7 h后更換正常培基，培養(yǎng)48 h，過(guò)濾收集上清液，并將帶有慢病毒的上清液感染HT29細(xì)胞，感染3 d后加入Polybrene，使用puromycin篩選穩(wěn)定細(xì)胞系，并進(jìn)行Western blotting驗(yàn)證。四組shRNA序列為shFOXC2#1:5′GGGAGCGGGAGGGGCGGCCC3′;shFOXC2#2：5′GGTGCGCGGGCGGCGGCGCT3′;shCtrl:5′GCTGTTTTTTGAGATTTCAG3′,shFOXC2#3:5′CCGGAGGCTGCCAGGAGCCC3′;shFOXC2#4:5′TTGCCCGGGGCGCGCCCTCC3′。檢測(cè)各組FOXC2蛋白及mRNA水平。方法同1.2、1.3。選取有效序列shFOXC2#1、shFOXC2#4進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

1.5 knock-down FOXC2細(xì)胞系增殖活力的檢測(cè) 采用MTS法。收集shFOXC2 1#組、shFOXC2 4#組及對(duì)照組(GV248細(xì)胞)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔接種至96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL(設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別檢測(cè)0(細(xì)胞貼壁后)、24、48、72 h的細(xì)胞增殖活力，MTS液與培基以1∶9的比例混合均勻，混勻后于生化培養(yǎng)箱中37 ℃孵育1 h后用多孔板酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度，相對(duì)增殖能力以各時(shí)間點(diǎn)OD值與0 h OD值的比值表示。

1.6 knock-down FOXC2細(xì)胞系侵襲能力的檢測(cè) 采用劃痕修復(fù)試驗(yàn)。收集1.5中三組的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將1×106細(xì)胞接種至標(biāo)記筆劃線的水平6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后100 μl移液槍頭垂直劃線進(jìn)行劃痕，每孔5條。分別在劃痕后及24 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行拍照，結(jié)果以×200顯微鏡視野中劃痕面積與視野總面積比值表示劃痕大小。

1.7 knock-down FOXC2細(xì)胞系E-cadherin、Zo-1以及Vimentin蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blotting法。收集1.5中的三組細(xì)胞，方法同1.3，結(jié)果以相對(duì)灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1 組織FOXC2 mRNA的表達(dá) 結(jié)直腸癌組織中FOXC2的mRNA水平(0.214±0.007)高于正常癌旁組織(0.070±0.008)(t=13.71，P<0.01)。

2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中FOXC2蛋白的表達(dá) HCT116、SW620、SW480、LOVO、HT29、LS174T、HCT8細(xì)胞系中FOXC2蛋白表達(dá)量分別為0.062±0.009、0.115±0.016、0.174±0.013、0.208±0.022、0.439±0.030、0.173±0.019、0.027±0.005，HT29細(xì)胞系FOXC2蛋白表達(dá)量高于其他細(xì)胞系(P均<0.05)。

2.3 5組FOXC2蛋白及mRNA表達(dá)量比較 對(duì)照組、shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組FOXC2蛋白表達(dá)量分別為0.834±0.155、0.151±0.043、0.526±0.077、0.742±0.102、0.179±0.038，F(xiàn)OXC2 mRNA表達(dá)量分別為0.307±0.043、0.056±0.020、0.241±0.077、0.206±0.035、0.074±0.012。與對(duì)照組比較，shFOXC2 1#組、shFOXC2 2#組、shFOXC2 4#組FOXC2蛋白表達(dá)量低，shFOXC2 1#組、shFOXC2 3#組、shFOXC2 4#組FOXC2 mRNA表達(dá)量低(P均<0.05)。

2.4 knock-down FOXC2細(xì)胞系不同時(shí)間增殖活力比較 見(jiàn)表1。

表1 knock-down FOXC2細(xì)胞系不同時(shí)間增殖活力比較±s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.5 knock-down FOXC2細(xì)胞系侵襲能力變化 對(duì)照組劃痕面積與總面積比為17.58±3.91，shFOXC2#1及shFOXC2#4組分別為5.83±1.51及6.41±1.28，與對(duì)照組相比，knock-down FOXC2細(xì)胞系劃痕面積與總面積比低(P均<0.05)。

2.6 knock-down FOXC2細(xì)胞系E-cadherin、Zo-1和Vimentin蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組、shFOXC2 1#組、shFOXC2 4#組E-cadherin蛋白表達(dá)量分別為0.358±0.049、0.740±0.102、0.591±0.084，Zo-1蛋白表達(dá)量分別為0.262±0.047、0.405±0.072、0.679±0.114，Vimentin蛋白表達(dá)量分別為0.633±0.095、0.294±0.031、0.280±0.064。與對(duì)照組比較，shFOXC2#1及shFOXC2#4組E-cadherin、Zo-1蛋白表達(dá)量高，Vimentin蛋白表達(dá)量低(P均<0.05)。

3 討論

FOXC2屬于人forkhead家族的轉(zhuǎn)錄因子，在正常機(jī)體中參與脂肪代謝的調(diào)節(jié)、淋巴與血管的生成以及對(duì)胰島素敏感性的影響。近年研究指出，在多種惡性腫瘤中，多條途徑的激活能夠促進(jìn)FOXC2表達(dá)，包括TGF-β、TGF-α、WNT、Snai1/FOXC2信號(hào)通路，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Hollier等[1]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXC2在乳腺癌細(xì)胞中能促進(jìn)EMT及干細(xì)胞性轉(zhuǎn)化過(guò)程，通過(guò)使用PDGFR-β小分子抑制劑舒尼替尼下調(diào)FOXC2的表達(dá)能夠降低乳腺癌細(xì)胞干細(xì)胞性及轉(zhuǎn)移的趨勢(shì)。Mortazavi等[2]證明非小細(xì)胞肺癌中FOXC2通過(guò)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)促使細(xì)胞喪失極性，細(xì)胞間黏附作用減弱。Paranjape等[3]的研究顯示,FOXC2在前列腺癌細(xì)胞中促進(jìn)其產(chǎn)生干細(xì)胞特性的細(xì)胞表型，其也在子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌中高表達(dá)，并且與子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌的惡性程度密切相關(guān)，F(xiàn)OXC2促進(jìn)血管生成的作用可能在其中發(fā)揮作用?；|(zhì)金屬蛋白酶是降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要酶類(lèi)，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。FOXC2不僅促進(jìn)EMT的發(fā)生，同時(shí)與基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)也有一定的相關(guān)性。Nishida等[4]的研究指出在食管癌中，患者FOXC2的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶2及基質(zhì)金屬蛋白酶9的表達(dá)呈正相關(guān)，提示其可能促進(jìn)食管癌的侵襲轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致不良預(yù)后。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織相比癌旁正常組織FOXC2 mRNA表達(dá)量升高，提示高表達(dá)的FOXC2可能在癌癥發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中起一定的作用。我們進(jìn)一步通過(guò)慢病毒感染構(gòu)建穩(wěn)定shFOXC2的HT29細(xì)胞系，MTS的結(jié)果顯示FOXC2下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞增殖能力低于對(duì)照組，提示FOXC2在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖中起到一定的促進(jìn)作用。劃痕修復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果顯示，F(xiàn)OXC2下調(diào)后，細(xì)胞侵襲遷移能力減弱，表明FOXC2在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用。對(duì)此，我們進(jìn)一步對(duì)shFOXC2細(xì)胞系EMT相關(guān)分子進(jìn)行檢測(cè)，包括E-cadherin、Zo-1及Vimentin。E-cadherin的減少或缺失是EMT最主要的標(biāo)志性變化，其不僅是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間連接黏附的重要分子，還在維持細(xì)胞極性方面起著重要作用。許多研究顯示，E-cadherin的下調(diào)對(duì)于上皮細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。Zo-1在細(xì)胞中起封閉細(xì)胞間間隙的作用，其下調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞間緊密連接中斷，促進(jìn)癌細(xì)胞擴(kuò)散[5]，Vimentin是成纖維細(xì)胞中等纖維的主要成分，其表達(dá)上調(diào)提示EMT程度加重。本試驗(yàn)中，HT29細(xì)胞下調(diào)FOXC2后，E-cadherin、Zo-1蛋白表達(dá)上調(diào)，Vimentin蛋白表達(dá)下調(diào)，提示FOXC2對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過(guò)程有促進(jìn)作用，綜上，認(rèn)為FOXC2對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有促進(jìn)作用。在接下來(lái)的研究中，我們將提取細(xì)胞質(zhì)胞核蛋白對(duì)FOXC2進(jìn)行定位，同時(shí)通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證FOXC2的促癌作用，并研究分子間相互作用探究FOXC2的作用機(jī)制，確定其可能的靶標(biāo)分子，為結(jié)直腸癌的臨床診治以及診斷提供新的依據(jù)。

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A

1002-266X(2017)29-0033-03

2016-12-13)