樊金焱，劉玉玲，邰國香，孫選，楊德勝

(青島市海慈醫(yī)療集團，山東青島266033)

·臨床研究·

外周血中Th17/Treg細胞及炎癥因子水平與宮頸病變程度、HPV危險分型的關系

樊金焱，劉玉玲，邰國香，孫選，楊德勝

(青島市海慈醫(yī)療集團，山東青島266033)

目的 探討外周血輔助性T17細胞/調(diào)節(jié)性T細胞(Th17/Treg細胞)及炎癥因子水平與宮頸病變程度、人乳頭瘤狀病毒(HPV)危險分型的關系。方法 宮頸病變患者120例，根據(jù)HPV危險分型分為高危型組82例，低危型組38例；根據(jù)病理分型分為宮頸癌(CC組)47例、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ～Ⅲ(CIN組)45例、慢性宮頸炎(CCS組)28例，檢測各組外周血Th17/Treg細胞及血清炎癥因子IL-17、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)、IL-23水平，分析外周血Th17/Treg細胞與炎癥因子及宮頸病變程度和HPV感染危險分型的相關性。結(jié)果 CC組與CIN組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及Th17/Treg細胞，血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較CCS組高，且CC組亦高于CIN組(P均<0.05)。高危型組外周血上述指標均高于低危型組(P均<0.05)。Pearson相關分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg細胞與血清IL-17、TGF-β、IL-23水平及宮頸病變程度、HPV感染危險分型均呈正相關(r分別為0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。結(jié)論 外周血Th17/Treg細胞及炎癥因子水平升高與宮頸癌變、HPV感染高危型有關。

宮頸病變；輔助性T17細胞；調(diào)節(jié)性T細胞；人乳頭瘤狀病毒

宮頸癌為臨床婦科常見惡性腫瘤，且呈年輕化趨勢發(fā)展，逐漸成為當前社會關注重點。臨床研究發(fā)現(xiàn)，約90%或以上宮頸癌患者合并伴有高危類型HPV感染[1，2]。因此，宮頸癌發(fā)病與HPV感染之間存在密切聯(lián)系，同時，伴隨宮頸HPV疫苗順利研制問世并得以臨床應用，有關宮頸癌的免疫療法逐漸成為研究熱點。雖然關于HPV免疫逃逸主要機制尚未明確，但已有多項報道證實，輔助性T17(Th17)細胞以及調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞均參與宮頸癌HPV免疫逃逸過程，且宮頸癌患者Th17及Treg細胞水平發(fā)生明顯變化[3]。有學者提出，Th17/Treg細胞和宮頸病變HPV感染之間存在一定相關性，對其進行深入研究探討，有助于宮頸癌治療及預防工作順利進行，并且有助于HPV感染臨床病情預測[4，5]。2014年3月～2016年12月，本文探討了外周血Th17/Treg細胞及炎癥因子與宮頸病變程度、HPV危險分型的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸病變患者120例。根據(jù)宮頸病變程度分為宮頸癌(CC組)47例，年齡35～61(46.82±1.33)歲；上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅱ～Ⅲ 45例(CIN組)，年齡36～63(46.77±1.53)歲；慢性宮頸炎(CCS)28例(CCS組)，年齡37～60(46.59±1.41)歲。經(jīng)HPV檢測分型顯示高危型82例(高危型組)、低危型38例(低危型組)。納入標準：患者均經(jīng)病理診斷結(jié)果證實有宮頸病變；均為初診患者。排除標準：有糖尿病亦或是高血壓者；有心血管類疾病者；處于妊娠期的患者；有急慢性感染性疾病者；有轉(zhuǎn)移性腫瘤者。

1.2 宮頸HPV檢測 采用專用的宮頸刷在宮頸放置后，旋轉(zhuǎn)5～10圈后，將收集到的脫落細胞存于專用保存液內(nèi)，利用PCR技術實施HPV分型的檢測。

1.3 血清CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比的檢測 所有受試者采集其空腹靜脈血約3 mL，經(jīng)EDTA抗凝，在測定管內(nèi)分別添加抗凝血100 mL，而后加進對應抗體10 μL/管，經(jīng)避光、室溫下孵育約20 min。添進Foxp3 熒光抗體約20 μL，在避光和4 ℃下靜置約30 min，添進破膜劑約2 mL洗滌，予以1 200 r/min離心5 min。再棄去上清液，添加細胞染色液約2 mL，共洗滌2次，將重懸細胞染色液0.5 mL進行混勻，利用流式細胞儀對樣本實施檢測。

1.4 血清CD4+IL17+Th17細胞百分比的檢測 將BPMI1650型培養(yǎng)基調(diào)至細胞濃度為2×106/mL，而后接種在24孔培養(yǎng)板，之后添加佛波醇乙酯約25 ng/mL及離子霉素約1 μg/mL，以及莫能霉素約1.7 μg/mL。于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約5 h，調(diào)節(jié)細胞到1×107/mL。提取測定的試管和對照試管各一支，而后分別加進細胞懸液100 μL及FitcCD4 10 μL，經(jīng)避光室溫下孵育約15 min，再行PBS洗滌1次，在兩管內(nèi)依次加進細胞破膜劑200 μL，經(jīng)室溫避光孵育約15 min后，給予PBS洗滌1次，再重懸細胞，在檢測試管內(nèi)添加破膜劑200 μL及PE-IL17A 10 μL，在對照試管內(nèi)加進破膜劑200 μL及對照抗體PE 10 μL，經(jīng)室溫避光下孵育約15 min，再行PBS洗滌1次，通過流式細胞儀對樣本實施檢測。

1.5 血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平的測定 取患者血清約3 mL，嚴格依據(jù)ELISA試劑盒說明書實施操作，依次測定血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平，通過酶標儀在450 nm位置讀取光密度(OD)值，依照標準曲線算出濃度。

2 結(jié)果

2.1 不同類型宮頸病變患者外周血Th17、Treg細胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較 見表1。

表1 各組外周血內(nèi)Th17、Treg細胞百分比及血清炎癥因子水平比較±s)

注：與CCS組相比，*P<0.05；與CIN組相比，△P<0.05。

2.2 不同HPV危險分型患者外周血Th17、Treg細胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較 見表2。

2.3 相關性分析 Pearson相關分析結(jié)果顯示，外周血Th17/Treg細胞與血清IL-17、TGF-β、IL-23水平、宮頸病變程度以及HPV危險分型均呈正相關(r分別為0.658、0.592、0.714、0.649、0.707，P均<0.05)。

表2 不同HPV感染危險分型患者外周血Th17、Treg細胞百分比及血清IL-17、IL-10、TGF-β、IL-23水平比較

注：與低危型組比較，*P<0.05。

3 討論

宮頸癌為女性高發(fā)癌癥，對全世界女性生命健康以及安全造成重大威脅，伴隨人們生活方式改變以及飲食習慣變化，我國宮頸癌發(fā)病率近年也不斷攀升，其治療及預防工作受到高度重視。根據(jù)流行病學相關研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)婦女均有HPV感染史，并且高危型HPV持續(xù)感染為宮頸癌發(fā)病的重要誘因[6，7]。但是，當HPV感染機體后，通常會遭到宿主免疫清除，剩余者保持長期感染狀態(tài)[8～10]。同時，僅少數(shù)高危類型HPV持續(xù)性感染者最終發(fā)展為宮頸癌。專家認為，導致宮頸癌發(fā)病的最重要原因在于宮頸HPV免疫逃逸。已知多種T淋巴細胞在惡性腫瘤微環(huán)境內(nèi)擔任重要角色，Th17細胞與Treg細胞同屬T細胞亞群。其中Th17細胞能夠釋放出IL-17類型細胞因子，進而起到促炎癥作用。Treg細胞則能夠發(fā)揮免疫抑制效果。宮頸癌患者Th17與Treg細胞水平失衡，提示Th17與Treg細胞有可能參與了宮頸HPV免疫逃避，但二者關系仍需深入探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，CC組與CIN組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的百分比及Th17/Treg細胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較CCS組高，且CC組亦高于CIN組，與張劍英等[11～13]研究結(jié)果一致。提示患者的宮頸病變程度與機體的免疫細胞及細胞炎癥因子緊密相關。Th17細胞為T淋巴細胞亞群中一員，其為關鍵性介導炎癥類細胞，與多種自身免疫類疾病以及感染類疾病密切相關，可誘導炎癥反應，并產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如IL-17。已知IL-17為重要的誘導炎癥介質(zhì)以及趨化因子，其具有造成組織細胞發(fā)生炎性損傷的作用。Treg細胞屬于CD4類型細胞亞群，能夠分泌產(chǎn)生多種抑制性類型細胞因子，包括IL-10以及TGF-β等，且IL-10以及TGF-β均為免疫逃逸發(fā)生機制的重要因子。當Treg細胞分泌出IL-10以及TGF-β后，以上細胞因子會共同發(fā)揮抑制作用，包括抑制效應細胞自身功能，產(chǎn)生顆粒酶以及穿孔素等對效應細胞進行殺傷，并干擾效應細胞自身正常代謝能力，以調(diào)節(jié)樹突細胞方式對Treg細胞分化以及增殖等活動進行干擾，進而對機體免疫細胞發(fā)揮抑制其功能的作用。同時，本研究發(fā)現(xiàn)，高危型組外周血CD4+IL17+Th17、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及Th17/Treg細胞以及血清IL-17、TGF-β和IL-23水平均較低危型組高，提示HPV感染的危險程度也與機體的免疫細胞及細胞炎癥因子存在關聯(lián)，考慮與Th17與Treg細胞等的數(shù)目失調(diào)有關。

HPV感染引發(fā)宮頸病變主要分兩個階段，分別為宮頸HPV于患者機體內(nèi)免疫逃避，并造成持續(xù)性感染，然后造成宮頸發(fā)生器質(zhì)性病變[14，15]。目前已經(jīng)證實，高危型HPV發(fā)生持續(xù)性感染是引起宮頸病變重要原因，并且通常情況下，浸潤性宮頸癌與16以及18型HPV持續(xù)性感染密切相關[16]。同時，高危型HPV的E6及E7基因編碼類型蛋白質(zhì)為造成宮頸病變重要致病因素。通常Th17與Treg細胞二者之間存在一定平衡，如機體內(nèi)此平衡遭到打破，則容易發(fā)生癌變。高、低危型HPV感染患者外周血Th17/Treg細胞、IL-17以及TGF-β水平差異均有統(tǒng)計學意義，且本研究還發(fā)現(xiàn)，外周血Th17/Treg細胞與IL-17、TGF-β、IL-23、宮頸病變程度以及HPV感染的危險分型均呈正相關。證實免疫細胞及炎癥因子與宮頸病變及HPV感染密切相關。

綜上所述，外周血內(nèi)Th17/Treg細胞及炎癥因子與宮頸癌變、HPV危險分型均有緊密聯(lián)系，臨床可考慮對此類指標進行監(jiān)測，從而更好地輔助診治。

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山東省科學技術廳科技計劃項目(01-BS59)。

孫選(E-mail:sunxuan_1966@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.013

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B

1002-266X(2017)29-0041-03

2017-04-05)