王謙，齊悅歌，付婧璇

(1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

香蒲基質(zhì)下雞腿菇的生殖生長(zhǎng)條件

王謙1，齊悅歌2，付婧璇2

(1.河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002；2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

為了擴(kuò)大對(duì)香蒲廢棄物的資源利用，解決濕地植物廢棄物生態(tài)環(huán)境污染問(wèn)題，利用雞腿菇進(jìn)行香蒲廢棄物的資源化開(kāi)發(fā).通過(guò)對(duì)香蒲屑進(jìn)行成分測(cè)定，以及對(duì)香蒲屑培養(yǎng)雞腿菇適宜品種進(jìn)行篩選，得出雞腿菇1號(hào)為最適品種，并對(duì)雞腿菇1號(hào)的最適栽培培養(yǎng)基進(jìn)行篩選.結(jié)果表明，雞腿菇1號(hào)的最佳栽培培養(yǎng)基配方(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為香蒲屑63%、玉米芯20%、麩皮15%、生石灰2%，生物學(xué)效率達(dá)93.02%.

香蒲屑；雞腿菇；培養(yǎng)基；生殖生長(zhǎng)

香蒲，隸屬于被子植物門(angiospermae)，雙子葉植物綱(dicotyledoneae)，薔薇目(rosales)，香蒲科(typhaceae)，香蒲屬(Typha)，是香蒲科植物的全草[1].香蒲在中國(guó)普遍生長(zhǎng)于華北、東北及西北、西南區(qū)域的淺水濕地，據(jù)測(cè)算，目前僅雄安新區(qū)內(nèi)，香蒲生長(zhǎng)規(guī)模就達(dá)到 5.33 ～6.67 km2.香蒲生長(zhǎng)繁殖快且生物量大，編織等雖然能夠消耗部分香蒲，但目前不僅用量有限，而且其利用程度呈下降趨勢(shì).香蒲在濕地的大量繁殖進(jìn)而產(chǎn)生的殘枝等廢棄物，造成了對(duì)水體的破壞，并形成對(duì)濕地的內(nèi)源污染.

雞腿菇(Coprinuscomatus)屬于草腐型藥食兼用菌，能夠分泌羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶等，以降解秸稈類香蒲中的纖維素、半纖維素，供其生長(zhǎng).目前以濕地香蒲進(jìn)行食藥用真菌栽培的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究利用雞腿菇對(duì)香蒲的分解利用，不僅探索了香蒲的資源化開(kāi)發(fā)，而且可以成為雄安新區(qū)生態(tài)建設(shè)中解決濕地植物廢棄物生態(tài)環(huán)境污染問(wèn)題的生物技術(shù)途徑之一.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和材料

供試菌株：雞腿菇1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)，河北大學(xué)食藥用真菌研究所保藏.

實(shí)驗(yàn)材料：香蒲屑(采自白洋淀濕地狹葉香蒲)、麩皮、生石灰等.

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、pH自然；

香蒲屑培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：香蒲屑 83%、麩皮 15%、生石灰 2%.

栽培培養(yǎng)基配方見(jiàn)表1.

表1 香蒲屑栽培培養(yǎng)基配方

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

羧甲基纖維素鈉，3,5-二硝基水楊酸，苯酚，葡萄糖，氫氧化鈉，無(wú)水乙醇，愈創(chuàng)木酚，酒石酸鉀鈉.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蒲屑中營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

通過(guò)香蒲屑與雞腿菇常用栽培基質(zhì)玉米芯和麥秸營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比，確定香蒲可以作為雞腿菇的主要栽培基質(zhì).成分測(cè)定包括纖維素含量測(cè)定(碘量法)[2]、半纖維素含量測(cè)定( DNS 法)[2]、木質(zhì)素含量測(cè)定(碘量法)[2]、粗蛋白含量測(cè)定(凱氏定氮法)[3]、粗脂肪含量測(cè)定(索氏提取法)[3]和粗灰分含量測(cè)定(直接灰化法)[4].

1.2.2 不同雞腿菇菌株品比

1.2.2.1 3株雞腿菇菌株在香蒲屑培養(yǎng)基中的菌絲長(zhǎng)速對(duì)比

按上述配方配制香蒲屑培養(yǎng)基，每株5個(gè)平行，每管培養(yǎng)基干重約8 g，培養(yǎng)基高度8 cm，121 ℃滅菌2.5 h，冷卻至室溫.然后取大小相近的3株雞腿菇 PDA母種分別轉(zhuǎn)接至滅好菌的香蒲屑培養(yǎng)基中，在恒溫25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng).當(dāng)菌絲萌發(fā)，并且長(zhǎng)齊后開(kāi)始作標(biāo)記[5]，每隔5天劃線1次.記錄雞腿菇菌株長(zhǎng)速及生長(zhǎng)情況，并對(duì)菌絲長(zhǎng)速進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理.

菌絲長(zhǎng)速=菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度/菌絲生長(zhǎng)時(shí)間[6].

1.2.2.2 3株雞腿菇菌株胞外酶活性對(duì)比

1) 粗酶液的制備

稱取香蒲屑基質(zhì)下生長(zhǎng)的雞腿菇菌絲與培養(yǎng)基混合物(簡(jiǎn)稱菌絲培養(yǎng)物)約4 g，每1 g菌絲培養(yǎng)物中添加 10 mL的超純水，放在4 ℃ 冰箱中浸提12 h，6 000 r/min離心15 min后得上清液即為香蒲屑基質(zhì)下的雞腿菇的粗酶液[7].

2) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線繪制

首先配制好1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照表2 依次添加試劑，配制葡萄糖不同梯度含量的反應(yīng)液.混合均勻后，在沸水浴中進(jìn)行顯色反應(yīng)，顯色5 min，用冷水終止顯色反應(yīng)，并向上述反應(yīng)液添加蒸餾水定容至 25 mL，將其混勻.以1號(hào)管為對(duì)照，在540 nm 波長(zhǎng)下分別測(cè)量不同濃度葡萄糖反應(yīng)液的OD值.每次設(shè)置 3 個(gè)平行，共3次重復(fù).以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

表2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液配制

3) 3種胞外酶酶活測(cè)定

羧甲基纖維素(CMC)酶酶活的測(cè)定采用DNS法[7]、半纖維素酶酶活的測(cè)定采用DNS法[7]、漆酶酶活采用愈創(chuàng)木酚法[7].

1.2.2.3 3株雞腿菇菌株在香蒲屑培養(yǎng)基上的生物學(xué)效率的對(duì)比

3株雞腿菇菌株在香蒲屑栽培培養(yǎng)基上完成其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段的培養(yǎng)后，對(duì)其進(jìn)行覆土，在18～22 ℃、空氣濕度 85%～95% 條件下進(jìn)行出菇管理，每天早晚通風(fēng)30 min.在開(kāi)傘前進(jìn)行子實(shí)體采收.將收集的雞腿菇子實(shí)體進(jìn)行稱重，計(jì)算其生物學(xué)效率.

生物學(xué)效率 =(子實(shí)體鮮重/培養(yǎng)料干重)×100 %[8].

1.2.3 不同香蒲配方的長(zhǎng)速對(duì)比

按表1配制培養(yǎng)基，將配制好的培養(yǎng)基裝入 180 mm×18 mm 試管中，每組 5 支，每管培養(yǎng)基干重約 8 g，培養(yǎng)基高度 8 cm，121 ℃滅菌 2.5 h.待冷卻后接種，接種量一致.在 25 ℃下避光培養(yǎng)，待菌絲萌發(fā)長(zhǎng)齊后開(kāi)始進(jìn)行標(biāo)記(沿菌絲生長(zhǎng)邊緣標(biāo)記)，每隔 5 天標(biāo)記1次.計(jì)算比較雞腿菇菌株在不同栽培配方中的長(zhǎng)速，同時(shí)觀察菌絲生長(zhǎng)情況.

1.2.4 不同香蒲配方中生物學(xué)效率的對(duì)比

按照表1配方稱重各種原料，堆悶，待培養(yǎng)料充分吸收水分后分別等量裝入 17 cm×32 cm×0.005 cm 聚丙烯塑料袋中，平均每袋培養(yǎng)基干重約200 g，121 ℃ 高壓滅菌 2.5 h.每組配方 100 袋，待冷卻至室溫后將制備的麥粒香蒲屑原種無(wú)菌條件下等量接入 5 種配方的聚丙烯塑料袋中.將菌袋放置于空氣相對(duì)濕度為 85%～95% 的培養(yǎng)室內(nèi)避光培養(yǎng)，每天早晚通風(fēng)30 min.觀察菌絲的長(zhǎng)速情況，記錄并計(jì)算生物學(xué)效率.

2 結(jié)果與分析

2.1 香蒲屑中營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定結(jié)果

香蒲屑中營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 香蒲屑和其他栽培原料的營(yíng)養(yǎng)成分含量對(duì)比

表中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差.小寫(xiě)字母表示顯著性差異，大寫(xiě)字母表示極顯著性差異.

由表3可知，香蒲屑中纖維素和木質(zhì)素含量均高于麥秸和玉米芯，半纖維素含量低于玉米芯，但與麥秸半纖維素含量不存在顯著性差異和極顯著性差異.

香蒲屑中粗蛋白含量低于麥秸和玉米芯，但與麥秸不存在顯著性差異和極顯著性差異，粗脂肪含量低于麥秸和玉米芯，且都存在顯著性差異和極顯著性差異，粗灰分含量高于玉米芯，低于麥秸.通過(guò)與玉米芯和麥秸的營(yíng)養(yǎng)成分的對(duì)比，綜合分析香蒲屑所含碳源、氮源等均適合雞腿菇栽培利用，香蒲屑中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠滿足于雞腿菇的菌絲的生長(zhǎng).因此，可作為雞腿菇的主要栽培基質(zhì).

2.2 3株雞腿菇菌株在純香蒲屑培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果

3株雞腿菇菌株在純香蒲屑培養(yǎng)基上菌絲長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 3株雞腿菇菌株長(zhǎng)勢(shì)長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果

菌絲長(zhǎng)速數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差.+表示長(zhǎng)勢(shì)一般，密度較稀疏，菌絲白；++表示長(zhǎng)勢(shì)較好，密度較致密，菌絲較白；+++表示長(zhǎng)勢(shì)好，密度致密，菌絲潔白.P=0.05表示顯著性差異，P=0.01表示極顯著性差異.下同.

通過(guò)表4數(shù)據(jù)可見(jiàn)，雞腿菇1號(hào)在香蒲屑培養(yǎng)基上的長(zhǎng)速均高于雞腿菇 2 號(hào)和雞腿菇3號(hào)，差異達(dá)到極顯著水平.并且菌絲長(zhǎng)勢(shì)好，潔白致密，初步判斷雞腿菇1號(hào)優(yōu)于雞腿菇2號(hào)和雞腿菇3號(hào).說(shuō)明在香蒲屑為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基上，雞腿菇1號(hào)更早完成其菌絲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段.

2.3 3株雞腿菇菌株的3種胞外酶活的對(duì)比結(jié)果

2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長(zhǎng) 540 nm 條件下，用 1 號(hào)管作對(duì)照，測(cè)出 2～6 號(hào)管的吸光度.根據(jù)數(shù)據(jù)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 1.

ρ(葡萄糖)/(mg·mL-1)圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose-OD540 value standard curve

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.886 1X-0.008 2，回歸系數(shù)R2=0.999 1.

2.3.2 3種胞外酶酶活對(duì)比結(jié)果

3種胞外酶酶活對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 在香蒲屑培養(yǎng)基上3株雞腿菇菌株羧甲基纖維素酶(CMC)、半纖維素酶、漆酶酶活對(duì)比

由表5的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，在香蒲屑培養(yǎng)基上，雞腿菇 1 號(hào)的3種酶活性均高于其他2種菌株的酶活，且均呈現(xiàn)極顯著性差異.說(shuō)明雞腿菇 1 號(hào)能更好地利用香蒲屑中的纖維素和半纖維素以供其菌絲生長(zhǎng)，這也在一定程度上說(shuō)明了菌絲長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果.

2.3.3 3株雞腿菇菌株的生物學(xué)效率對(duì)比結(jié)果

3株雞腿菇菌株的生物學(xué)效率對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表6.

表6 3株雞腿菇菌株的生物學(xué)效率對(duì)比結(jié)果

由表6對(duì)比可以看出，在香蒲屑栽培培養(yǎng)基上，雞腿菇1號(hào)生物學(xué)效率最高，達(dá)80.00%.說(shuō)明雞腿菇1號(hào)更能較好地利用香蒲屑的營(yíng)養(yǎng)成分完成其生殖生長(zhǎng).故選擇雞腿菇1號(hào)為香蒲屑基質(zhì)下培養(yǎng)最優(yōu)品種.

2.4 不同香蒲配方下菌絲長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果

不同香蒲配方下菌絲長(zhǎng)速對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表7.

表7 雞腿菇在不同香蒲屑配方下的長(zhǎng)速

由表7數(shù)據(jù)可知，雞腿菇在香蒲屑各栽培配方中菌絲長(zhǎng)速不同.配方3菌絲生長(zhǎng)速度最快，平均為3.88 mm/d；多重比較表明，配方3菌絲長(zhǎng)速與其他配方相比，差異均達(dá)顯著水平.此外，由表7還可以看出，不同香蒲屑栽培配方菌絲生長(zhǎng)勢(shì)也存在差異，配方 3、配方 2 和對(duì)照組菌絲長(zhǎng)速最好，純香蒲屑配方長(zhǎng)速最慢，這是因?yàn)榧兿闫雅浞綁毫暇o密，透氣性差，氧氣含量低，影響了其呼吸作用.

2.5 不同香蒲配方下生物學(xué)效率的對(duì)比結(jié)果

不同香蒲配方下生物學(xué)效率的對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表8.

由表8的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，雞腿菇在各栽培配方中的生物學(xué)效率是不同的.配方3的生物學(xué)效率最高，與其他配方達(dá)到了差異極顯著水平，配方2與對(duì)照組無(wú)顯著性差異.綜合考慮菌絲長(zhǎng)速、生物學(xué)效率結(jié)果和生產(chǎn)成本等問(wèn)題，選擇培養(yǎng)基配方3作為雞腿菇最佳栽培培養(yǎng)基配方.

表8 不同栽培配方對(duì)雞腿菇生物學(xué)效率的影響

3 結(jié)論

通過(guò)與秸稈和玉米芯的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比，確定了香蒲屑所含的碳源、氮源等均適合雞腿菇的栽培.因此，可作為雞腿菇的主要栽培基質(zhì).

通過(guò)對(duì)3株雞腿菇菌株菌絲長(zhǎng)速、3種胞外酶酶活(羧甲基纖維素酶、半纖維素酶和漆酶)和生物學(xué)效率的對(duì)比，選擇雞腿菇 1 號(hào)為最適香蒲屑栽培品種.其最適栽培配方為香蒲屑 63%、玉米芯 20%、麩皮15%、生石灰2%，生物學(xué)效率達(dá)93.02%.因此，利用雞腿菇進(jìn)行香蒲廢棄物的資源化開(kāi)發(fā)，可以成為解決濕地植物廢棄物生態(tài)環(huán)境污染問(wèn)題的生物途徑之一.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Procreative growth forCoprinuscomatusbased onTyphacrumbs

WANG Qian1, QI Yuege2, FU Jingxuan2

(1.Research Center of Biotechnology, Hebei University, Baoding 071002, China; 2.College of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071002, China)

In order to expand ofTypharesource utilization and solve the problem of ecological environment pollution.ThroughCoprinuscomatuscultivation withTypha,Typharesources get the development and exploitation.Through the study of the composition ofTyphasawdust, and the screening of the suitable varieties ofCoprinuscomatusin theTyphasawdust cultivation medium, it is concluded thatCoprinuscomatusNo.1 is the optimum variety.The cultivation medium was optimized .The results show that the optimum cultivation formula ofCoprinuscomatusNo.1:Typhasawdust 63%, corn cob 20%, bran 15%, lime 2%.The biological efficiency is 93.02%.

Typhasawdust;Coprinuscomatus; medium; procreative growth

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.04.016

2017-05-02

河北大學(xué)生物工程重點(diǎn)學(xué)科統(tǒng)籌項(xiàng)目(1050-5030005)；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系食用菌創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(HBCT2013060202)

王謙(1962—)，男，北京人，河北大學(xué)研究員，主要從事食藥用真菌研究與開(kāi)發(fā)工作. E-mail: wq6203_cn@126.com

Q93-335

A

1000-1565(2017)04-0434-06