杜守治，董斌，齊中華

（大連醫(yī)科大學1.附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷急癥中心，遼寧 大連 116027；2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116011）

急性心肌梗死和急性腦梗死m(xù)iRNA疾病標志物的初步篩查

杜守治1，董斌2，齊中華2

（大連醫(yī)科大學1.附屬第二醫(yī)院創(chuàng)傷急癥中心，遼寧 大連 116027；2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 大連 116011）

目的確定一種可以作為急性心肌梗死（AMI）或急性腦梗死（ACI）疾病診斷標志物的新的miRNA組合。方法根據(jù)文獻與公開的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫，選擇高頻出現(xiàn)的miRNA做為候選基因，收集AMI患者外周血樣本13例、ACI患者外周血樣本11例和健康志愿者樣本20例。利用試劑盒提取這些樣本中的游離RNA，進行反轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR測定，檢測所有樣本中候選miRNA的表達情況。對2個疾病組和健康對照組中候選miRNA的表達差異進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果經(jīng)過篩查，AMI組中出現(xiàn)頻率最高的miRNA有miRNA1、miRNA499a和miRNA133a，ACI組中出現(xiàn)頻率最高的miRNA有l(wèi)et7i、miRNA16和miRNA223。2個疾病組中6種miRNA的表達量均顯著高于健康對照組（P＜0.01）。AMI組miRNA1和miRNA499a的表達量分別為ACI組的4.82倍和3.50倍（P＜0.01），而miRNA133a的表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。ACI組與AMI組比較，miRNA16和miRNA233的表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），ACI組let7i的表達量為AMI組的2.61倍（P＜0.05）。結(jié)論人外周血游離RNA中6種miRNA均異常升高可以作為AMI或ACI的初步診斷標志物，在此基礎(chǔ)上，miRNA1和miRNA499a的表達量達到11～20倍以上時，對AMI的發(fā)病具有輔助診斷及預(yù)警作用；let7i的表達量達到6倍以上時，對ACI的發(fā)病具有輔助診斷及預(yù)警作用。

急性心肌梗死；急性腦梗塞；miRNA；疾病標志物

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是一種全球范圍內(nèi)高發(fā)的死亡率極高的心血管疾病［1］。動脈粥樣硬化導致的冠狀動脈管腔閉塞和斑塊破裂是AMI發(fā)病的常見原因。另外，發(fā)病過程中心肌細胞壞死、凋亡以及隨后的過度炎癥反應(yīng)也是AMI病理過程中心肌細胞損傷減少的主要原因［2］。急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）曾是全世界排名第二位的致死原因，在二十世紀九十年代的10年間曾導致400萬人死亡［3］。首發(fā)ACI即使治愈仍經(jīng)常伴有高復發(fā)率、神經(jīng)功能障礙后遺癥等，給患者造成長期的生理和心理上的創(chuàng)傷。AMI和ACI雖然臨床表現(xiàn)形式不相同，但是發(fā)病過程存在很多相似之處，且血小板功能異常是這些疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之［4-5］。

微小RNA（miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，成熟的miRNA長度約為17～25個核苷酸，作為其他RNAs的反義調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)細胞生命過程的表觀遺傳學如增殖、凋亡、分化和遷移等方面發(fā)揮重要作用［6］。已有研究［7-8］證實miRNA是潛在的腫瘤標志物，而且miRNA在血漿或血清長期儲存或反復凍融后非常穩(wěn)定，可以在新鮮或儲存的外周血標本中測得可靠的表達量［9］。因此，一些研究者分別對AMI和ACI患者進行外周血中miRNA標志物的篩查，并得到了相關(guān)的結(jié)論［10-11］。不過由于2種疾病的發(fā)病機制既有相似之處，也有不同之處，所以這2種疾病的諸多miRNA標志物不相同或不具有特異性。因此，本研究將已有的文獻報道與公開的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫相結(jié)合，選出幾種候選miRNA，通過檢測候選miRNA在健康志愿者和臨床病例樣本中的表達差異，進一步明確AMI和ACI的外周血miRNA標志物，為2種疾病的早期篩查、輔助診斷提供新的更可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

外周血游離總RNA提取試劑盒miRNeasy Serum/Plasma Kit Print（德國QIAGEN公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit、實時PCR試劑盒SYBR?Fast qPCR Mix（大連寶生物），反轉(zhuǎn)錄和實時PCR的引物設(shè)計及合成由中國廣州銳博生物有限公司完成；TP600型梯度PCR儀（日本TaKaRa公司），ABI7500實時熒光定量PCR儀（賽默飛世爾科技中國有限公司），HITACHI CF16RX-Ⅱ高速離心機（日本日立公司）。

1.2 候選基因篩選方法

查閱文獻及公開的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫，選擇高頻出現(xiàn)的miRNA做為候選基因。文獻來源為中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫（http：//www.cnki.net/）及 PubMed數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/），公開的互聯(lián)網(wǎng)數(shù)據(jù)庫為miRWalk數(shù)據(jù)庫（http：//zmf.umm.uniheidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/documentation.html）。待測樣本來源為2016年1月至12月期間于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院和附屬第二醫(yī)院確診為AMI和ACI的住院患者及體檢中心健康志愿者的外周血，包括AMI患者13例，ACI患者11例，健康志愿者20例，外周血采血時間均為住院1 h內(nèi)。

1.3 提取外周血游離RNA操作步驟

外周血游離總RNA的提取分為兩部分。首先制備血清樣本，用含有促凝劑的采血試管收集全血10 mL，室溫下（15～25℃）靜置10 min，4℃下1 900 g離心10 min，吸取上部液體血清到尖底EP管中，4℃下16 000g離心10 min，吸取上清液到一個新管中，該上清液即為含有游離miRNA的總RNA血清樣本。然后從該血清樣本中提取含有游離miRNA的總RNA，具體操作參見QIAGEN公司的miRNeasy Serum/Plasma Kit Print試劑盒說明書。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及實時PCR程序設(shè)定

檢測miRNA表達的方法為先反轉(zhuǎn)錄后實時PCR法。反轉(zhuǎn)錄溫度設(shè)置條件為42℃ 60 min→85℃ 5 s→4℃。實時PCR法溫度設(shè)置條件為95℃ 5 min，95℃ 5 s→57℃ 30 s→70℃ 30 s（45個循環(huán)），95℃ 5 s→55℃ 30 s→95℃ 5 s。加樣量根據(jù)說明書，并用U6基因做內(nèi)參照進行平行操作，采用2-ΔΔCt法表示各組基因差異表達的倍數(shù)關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

經(jīng)過篩選，AMI組中出現(xiàn)頻率最高的miRNA有miRNA1、miRNA499a和miRNA133a，ACI組中出現(xiàn)頻率最高的 miRNA有 let7i、miRNA16和 miRNA223。分別檢測上述幾種miRNA在3組樣本中的表達差異，結(jié)果顯示，AMI組和ACI組中6種miRNA的表達量均顯著高于健康對照組（P＜0.01）。為了進一步確認哪種miRNA在AMI和ACI 2種疾病中有差異表達，進行了AMI組和ACI組的組間比較。由于miRNA1、miRNA499a和miRNA133a在AMI組的表達量高于ACI組，因此選擇AMI組/ACI組的比值以便于比較。AMI組miRNA1和miRNA499a的表達量分別為ACI組的4.82倍和3.50（P＜0.01），而miRNA133a表達量無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。由于miRNA16、miRNA223和let7i在ACI組的表達量高于AMI組，因此選擇ACI組/AMI組的比值以便于比較。ACI組miRNA16和miRNA233的表達量與AMI組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），let7i的表達量為AMI組的2.61倍（P＜0.05）。見表1。

與健康對照組比較，這6種miRNA在AMI組和ACI組的表達量均顯著增高，提示2種疾病可能存在某些相同的發(fā)病機制，6種miRNA可以作為2種疾病的候選疾病標志物。其中表達量增加最大的是AMI組的miRNA499a，而miRNA16在AMI組和ACI組的表達量均顯著增加。通過AMI組/ACI組的比值可以看出，雖然miRNA1和miRNA499a在2種疾病發(fā)生時均高表達，但是AMI組的miRNA1和miRNA499a的表達量仍顯著高于ACI組，提示外周血游離的這2種miRNA表達量分別達到健康水平的2～6倍時，是一種特異性不強的AMI或ACI標志物，但表達量達到11～20倍以上時，可能是特異的AMI候選疾病標志物。與此相似，let7i的表達量達到健康水平的2～3倍時是一種特異性不強的AMI或ACI標志物，但表達量達到6倍以上時，可能是特異的ACI候選疾病標志物。

表1 6種miRNA在AMI組、ACI組和健康對照組表達差異的比較Tab.1 Comparison of the six miRNAs in the AMI，ACI，and control groups

圖1清晰表示了每個疾病樣本中的6種miRNA在本組疾病和另外一種疾病中的差異表達。其中圖1A、1B和1F中，miRNA表達量在2種疾病的分布位置差異較大，而圖1C、1D和1E中miRNA表達量在2種疾病的分布位置比較接近。進一步表明miRNA1、miRNA499a在AMI組的表達強度遠高于ACI組，而let7i在ACI組的表達強度遠高于AMI組。

3 討論

本研究顯示，作為候選標志物，miRNA1、miRNA499a、miRNA133a、miRNA16、miRNA223和let7i在篩選過程中不只出現(xiàn)在AMI或ACI這2種疾病中的一種。有報道顯示，miRNA499a等在心絞痛及心肌梗死中表達異常降低［12］，let7i還在胃癌組織中顯著低表達［13］。本研究中，檢測2種疾病患者的血液樣本時，與健康對照組樣本相比6種miRNA均出現(xiàn)表達異常升高的現(xiàn)象。所以利用一組miRNA對疾病進行預(yù)測，比用單一miRNA可靠性更強，同時還要結(jié)合其他信息如心電圖或排除腫瘤疾病等，才能獲得更準確的診斷結(jié)果。這6種miRNA可以以一種組合的形式，初步作為AMI或ACI的診斷標志物，為臨床診斷提供新的依據(jù)。這與已有的研究［14-16］結(jié)果相符。外周血游離的miRNA中，在6種miRNA均出現(xiàn)表達異常升高的基礎(chǔ)上，miRNA1和miRNA499a的表達達到正常值的11～20倍以上時，提示患者可能是AMI發(fā)病，而不是ACI；同樣在6種miRNA均出現(xiàn)了表達異常升高的情況下，let7i的表達達到正常值的6倍以上時，提示患者可能是ACI發(fā)病，而不是AMI。

需要指出的是，miRNA發(fā)揮生理作用的方式為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，其作用機制復雜，比較常見的機制是miRNA與Argonaute蛋白結(jié)合，組合成為RNA誘導的基因沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。形成的基因沉默復合體RISC會通過堿基互補配對與mRNA的3’非翻譯區(qū)結(jié)合，然后抑制其翻譯或者直接將其降解。這取決于miRNA與mRNA的互補程度。如果miRNA與靶mRNA堿基完全互補，就會引發(fā)mRNA的降解，這種現(xiàn)象在植物中常見；如果miRNA與靶基因不完全互補，就會抑制mRNA的翻譯，這種現(xiàn)象在動物中較常見。并且一種miRNA可以參與調(diào)控多種信號通路的轉(zhuǎn)導，同時一條信號通路也可受到多種miRNA的調(diào)控［17］。

以miRNA作為早期疾病標志物的研究還顯示，由于外周血中的游離miRNA是病灶部位的細胞凋亡、壞死后釋放進入外周血液循環(huán)或以外泌體形式、游離單細胞形式進入外周血液循環(huán)，在發(fā)病的不同時間段，病灶部位細胞自身表達可能不同，則血液中同一種miRNA的表達量在發(fā)病的不同時間段也不同［18］。因此，將外周血游離RNA中一種miRNA的異常表達作為單一特定疾病的確診指標尚需結(jié)合臨床實際深入考察，但是一組調(diào)控機制相關(guān)的miRNA集體異常表達，在腫瘤、AMI、ACI等多種重大疾病的患病風險評估及預(yù)后方面正在發(fā)揮越來越重要的作用［19-20］。

圖1 各樣本所含的6種miRNA在AMI組和ACI組表達的差異Fig.1 Differences in the expression of the six miRNAs between the AMI and ACI groups

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（編輯 陳 姜）

Preliminary Screening of miRNA Disease Markers for Acute Myocardial and Cerebral Infarctions

DU Shouzhi1，DONG Bin2，QI Zhonghua2

（1.Emergency and Critical Care Medicine Center，The Second Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China；2.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo identify a new miRNA combination that could be used as a diagnostic marker for acute myocardial infarction（AMI）or acute cerebral infarction（ACI）.MethodsWe surveyed the literatures and databases and selected miRNAs with a high frequency in AMI or ACI as candidate genes.We collected peripheral blood samples from 13 patients with AMI，11 patients with ACI，and 20 healthy volunteers.RNA was extracted from these samples，and gene expression levels were determined by reverse transcription and real-time quantitative PCR.The differences in the expression of the candidate miRNAs were then analyzed.ResultsThe frequencies of miRNA1，miRNA499a，and miRNA133a were higher in the AMI group，whereas the frequencies of let7i，miRNA16，and miRNA223 were higher in the ACI group.These six miRNAs were significantly higher in the two disease groups than in the control group（P＜0.01）.The levels of miRNA1 and miRNA499a were 4.82-and 3.50-times higher in the AMI group，respectively（bothP＜0.01），when compared with the ACI group.The levels of let7i in the ACI group were 2.61-times higher than that in the AMI group（P＜0.05）.There were no significant differences in the expression levels of miRNA133a，miRNA16，and miRNA233 between the AMI and ACI groups（P＞0.05）.ConclusionThe abnormal increase in six miRNAs in human peripheral blood could be used as a marker for the diagnosis of AMI or ACI.The expression levels of miRNA1 and miRNA499a were 11-to 20-times higher than control levels，and the expression levels of let7i were 6-times higher than control levels，which could be used to predict the risk of AMI and ACI，respectively.

acute myocardial infarction；acute cerebral infarction；miRNA；disease marker

R542.2；R743.33

A

0258-4646（2017）08-0681-05

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.08.003

國家自然科學基金（81672968）

杜守治（1980-），男，主治醫(yī)師，碩士研究生.

齊中華，E-mail：qzhdl770716@126.com

2017-04-14

網(wǎng)絡(luò)出版時間：