徐西林，張曉峰，吳興杰 ，呂航，夏聯(lián)恒，李小東，宿慧，劉沛然，王順

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參注射液對體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

徐西林1，張曉峰2，吳興杰1，呂航1，夏聯(lián)恒1，李小東1，宿慧1，劉沛然1，王順1

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：觀察丹參注射液對體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-9、TIMP-1表達(dá)情況的影響。方法：取12只6月齡新西蘭大白兔關(guān)節(jié)軟骨作體外細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為正常組、模型組、玻璃酸鈉組、丹參組4組。采用Western blot法測定軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果：Western Blot檢測結(jié)果：相對正常組，OA模型組的軟骨細(xì)胞組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；玻璃酸鈉組MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)低于空白模型組(P<0.05)，丹參組MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)低于空白模型組(P<0.01)；丹參組MMP-9蛋白表達(dá)低于玻璃酸鈉組，TIMP-1蛋白表達(dá)高于玻璃酸鈉組。熒光定量PCR檢測結(jié)果：與空白組相比，OA模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-9 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，MMP-9/TIMP-1失衡；治療后，與OA模型組相比，玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與玻璃酸鈉組相比丹參組MMP-9mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：丹參注射液能夠有效糾正MMP-9和TIMP-1在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織中異常表達(dá)，減輕軟骨損傷，有效治療骨性關(guān)節(jié)炎。

丹參注射液；軟骨細(xì)胞；MMP-9；TIMP-1

骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoathritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨損害為特征的退行性病變，臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨破壞、滑膜細(xì)胞增生、滑膜炎等，多累及膝關(guān)節(jié)。隨著我國人口老齡化，OA發(fā)病率呈上升趨勢，55～64歲人群的發(fā)病率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響人們的健康[1]，目前針對缺乏有效治療方法預(yù)防及延緩本病的發(fā)病和致殘。研究表明[2]基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)之間的異常表達(dá)是影響OA重要因素，如能有效抑制MMP活性，可能會(huì)減輕軟骨損傷，延緩骨性關(guān)節(jié)炎病變進(jìn)展。

我們采用丹參注射液關(guān)節(jié)腔注射治療OA，可以顯著緩解疼痛、腫脹等癥狀，延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變，其療效機(jī)制尚不清楚，是否與MMP/TIMP表達(dá)相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)通過觀察丹參注射液治療軟骨細(xì)胞中的MMP-9和TIMP-1表達(dá)的變化，分析丹參注射液對MMP-9/TIMP-1的影響，探究丹參注射液治療OA的療效機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12只6月齡健康新西蘭大白兔，體質(zhì)量(2.1±0.1)kg，雌雄各半，天津裕達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限公司提供，許可證號：SCXK(津)2016-0001，一籠一兔喂養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)方案符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求。

1.2 主要藥物儀器

丹參注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z33020177)，玻璃酸鈉(阿拉丁,批號：K1513011)，一抗二抗去除液(wanleibio)，全蛋白提取試劑盒(wanleibio)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(wanleibio)，SDS-PAGE凝膠快速制備試劑盒(wanleibio)，MMP-9(wnlaeibio)，TIMP-1 antibody(wnlaeibio)，羊抗兔IgG-HRP(wanleibio)，內(nèi)參抗體β-actin(wanleibio)，Super M-MLV(BioTeke)，高純總RNA快速提取試劑盒(BioTeke)，50×TAE(Amresco)，2×PowerTaqPCRMasterMix(BioTeke)，SYBR Green(Solarbio)。

1.3 主要儀器

凝膠成像系統(tǒng)(WD-9413B型)，超速冷凍離心機(jī)(H-2050R)，雙垂直蛋白電泳儀(DYCZ-24DN)，酶標(biāo)儀(ELX-800)，超純水系統(tǒng)(NW10LVF)，微量移液器(Proline)，真空干燥箱(DZF-6050)，紫外分光光度計(jì)(NANO 2000),熒光定量PCR儀(Exicycler 96)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型的制備

在無菌條件下，取12只兔膝關(guān)節(jié)軟骨，加少許10%FCS DMEM培養(yǎng)液，剪碎，離心取沉渣加0.1%Ⅱ型膠原酶，0.2%胰酶組成的消化液，在37℃消化3 h后，將細(xì)胞懸液過濾，離心后，接種培養(yǎng)瓶37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)研究用三代軟骨細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前用甲苯胺藍(lán)染色鑒定軟骨細(xì)胞。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

取三代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，用含10%小牛血清培養(yǎng)液配成2×105/mL的細(xì)胞懸液，放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h，采用SNP(2 mmol/L的硝普鈉(SNP))誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型建立后進(jìn)行分組，接種于96孔培養(yǎng)板，每組3孔，分別加入同體積藥液。

分組為①正常組：未經(jīng)任何處理的正常培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞；②模型組：SNP單獨(dú)處理軟骨細(xì)胞；③玻璃酸鈉組：細(xì)胞中加入玻璃酸鈉100 μg/mL，24 h后加入SNP；④丹參組：向細(xì)胞中加入含5%丹參注射液的培養(yǎng)液，24 h后加入SNP。上述各組在加藥后，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

2.3 觀察指標(biāo)及測定

Western blot檢測：采用Western blot法檢測軟骨細(xì)胞MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)。按照試劑盒說明，提取每組標(biāo)本軟骨細(xì)胞的總蛋白。取每組300 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h。用相應(yīng)一抗(1∶500)與PVDF膜4℃孵育過夜，洗去3次后，相應(yīng)二抗(1∶5 000)37℃孵育45 min。最后ECL發(fā)光劑顯影，暗室中觀察。以β-actin作為內(nèi)參照，凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的灰度分析。

RT-PCR檢測：RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞MMP-9 mRNA、TIMP-1mRNA相對表達(dá)。采用高純總RNA快速提取試劑盒提取每組軟骨細(xì)胞的總RNA，所得RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對應(yīng)的cDNA。利用ExicyclerTM 96熒光定量儀(BIONEER)進(jìn)行熒光定量分析,引物信息見表1。反應(yīng)條件，95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，退火30 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；引物信息見表1；以β-actin作為內(nèi)參照；采用2-△△CT方法分析熒光定量分析儀得到的數(shù)據(jù)。

表1 引物信息表

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Western Blot檢測結(jié)果

相對正常組，OA模型組的軟骨細(xì)胞組織中MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；玻璃酸鈉組MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)低于空白模型組(P<0.05)，丹參組MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)低于空白模型組(P<0.01)；丹參組MMP-9蛋白表達(dá)低于玻璃酸鈉組，TIMP-1蛋白表達(dá)高于玻璃酸鈉組。檢測到MMP-9蛋白條帶位于78 kDa，內(nèi)參照β-actin反應(yīng)條帶位于43 kDa處；TIMP-1蛋白條帶位于21 kDa，內(nèi)參照β-actin反應(yīng)條帶位于43 kDa處(見圖1、2、表2)。

圖1 各組兔軟骨細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果

3.2 熒光定量PCR檢測結(jié)果

與空白組相比，OA模型組家兔關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-9 mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，MMP-9/TIMP-1失衡，證實(shí)OA發(fā)病與MMP-9/TIMP-1失衡相關(guān)。治療后，與OA模型組相比，玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與玻璃酸鈉組相比丹參組MMP-9mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，TIMP-1mRNA相對表達(dá)量顯著升高(P<0.01)(見表3)。

圖2 各組兔軟骨細(xì)胞TIMP-1蛋白表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果

組別MMP-9TIMP-1正常組1.00±0.001.00±0.00OA模型組3.03±0.08#3.65±0.09#玻璃酸鈉組2.69±0.09#▲2.88±0.10##▲丹參組2.09±0.08#▲▲*3.11±0.09#▲▲*

注：與正常組相比，#P<0.01；與模型組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與玻璃酸鈉組相比，*P<0.01

表3 膝骨關(guān)節(jié)炎模型兔軟骨組織MMP-9 mRNA、TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量

注：與正常組相比，#P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01；與玻璃酸鈉組相比，*P<0.01

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為OA主要由于軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、軟骨下骨的失衡[3-4]，其中MMPs和TIMPS異常表達(dá)起著重要作用。OA在關(guān)節(jié)軟骨受損時(shí)，軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞會(huì)分泌大量MMPs，打破MMP/TIMP平衡，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解，關(guān)節(jié)軟骨抗應(yīng)力能力也隨之下降，最終遭到關(guān)節(jié)軟骨的破壞[5]。因此MMPs與TIMPs之間失衡，是骨性關(guān)節(jié)炎重要發(fā)病機(jī)制。

MMPs是具有降解幾乎所有細(xì)胞外基質(zhì)功能的一族酶，MMP-9主要降解明膠和基底膜膠原，在細(xì)胞與基質(zhì)間粘附起著重要的作用[6-7]。姜海軍[2]應(yīng)用ELISA法檢測OA患者和健康人血清MMP-9的含量，發(fā)現(xiàn)二者存在顯著差異。管劍龍等[8]的研究結(jié)果也證實(shí)這一點(diǎn)，MMP-9通過影響關(guān)節(jié)軟骨的正常合成與代謝平衡導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變。Mohtai等[9]發(fā)現(xiàn)OA患者M(jìn)MP-9 mRNA表達(dá)明顯增高，認(rèn)為MMP-9表達(dá)增高可能造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞。吳振彪等[10]在臨床中也發(fā)現(xiàn)OA患者血清中MMP-9濃度顯著高于正常人。Janusz等[11]觀察到MMP抑制劑可以減輕OA動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)軟骨損傷，推測抑制MMP活性可能是防治OA的重要方法。

TIMPs由關(guān)節(jié)滑膜和軟骨細(xì)胞合成，正常狀態(tài)下與MMPs結(jié)合成1∶1的復(fù)合物，從而抑制大部分MMPs的活性，是維持軟骨基質(zhì)正常代謝、轉(zhuǎn)化的重要調(diào)節(jié)因子[12]。MMPs與TIMPs能夠相互結(jié)合和制約，使MMPs/TIMPs維持在平衡狀態(tài)，阻止MMPs降解關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)蛋白多糖[13]。Hegemann N等[14]發(fā)現(xiàn)，雖然OA軟骨MMP-9和TIMP-1分泌均顯著增加，但TIMP -1增加低于MMP-9，影響MMP-9和TIMP-1的平衡性，因此造成膝關(guān)節(jié)軟骨退變。

研究結(jié)果顯示，正常組、玻璃酸鈉組、丹參組MMP-9/TIMP-1表達(dá)保持基本平衡，意味著MMP-9與TIMP-1動(dòng)態(tài)平衡是保護(hù)軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵。雖然模型組MMP-9、TIMP-1表達(dá)均增加，但TIMP-1的增加低于MMP-9，破壞了MMP-9/TIMP-1平衡，因而造成關(guān)節(jié)軟骨損傷和破壞。玻璃酸鈉組、丹參組軟骨細(xì)胞的MMP-9顯著降低，TIMP-1顯著升高，是維持了MMP/TIMP-1動(dòng)態(tài)平衡。而丹參組在維持MMP/TIMP-1平衡方面明顯優(yōu)于玻璃酸鈉組，因此丹參注射液臨床療效也優(yōu)于玻璃酸鈉。

本研究通過觀察丹參注射液對SNP誘導(dǎo)膝骨關(guān)節(jié)炎體外模型軟骨細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)丹參注射液能有效糾正MMP-9和TIMP-1異常表達(dá)，為丹參注射液治療OA提供了有效理論依據(jù)。

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2016-12-11

2016-12-28

黑龍江省自然科學(xué)基金(H2015024)；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(青年后備人才)(2015RAQYJ098)

徐西林(1975-)，男，碩士，副主任醫(yī)師,從事骨壞死與骨關(guān)節(jié)疾病的臨床與基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)04-0021-04