何斐 祁琪 李旭 肖仁棟 徐秋萍 熊為旻 劉志強 蔡琳

中國是世界肺癌大國，2012年全國數(shù)據(jù)[1]顯示每年新發(fā)肺癌病例70.5萬，發(fā)病率36.28/10萬人；死亡病例56.9萬，死亡率28.81/10萬人。肺癌已經(jīng)連續(xù)多年占據(jù)中國城市及農(nóng)村的惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位。肺部腫瘤生長過程中，血供無法滿足腫瘤新生血管供應氧時，腫瘤細胞內(nèi)即出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，活化低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α）識別并結(jié)合低氧反應元件（hypoxia response element, HRE）的特殊DNA序列，誘導下游系列靶基因，促進血管生成、細胞增殖及葡萄糖代謝、抑制細胞凋亡、促使肺部腫瘤惡性生長[2]。近年來，HIF-1α在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被人們認識，研究[3,4]表明HIF-1α在肺癌組織的表達高于對照組織，并且與肺癌的惡化與轉(zhuǎn)移有關(guān)。但HIF-1α基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）與肺癌易感性的研究仍較少。因此，本研究選擇在福建漢族人群中探討HIF-1α基因多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，為進一步研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預防和治療提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 對象 研究對象來自一項持續(xù)進行的病例-對照研究[5]，選擇2006年1月-2012年12月在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、協(xié)和醫(yī)院和南京軍區(qū)福州總醫(yī)院的胸外科及呼吸內(nèi)科病理確診的漢族新發(fā)原發(fā)性肺癌患者1,096例，對照組來自同期前往醫(yī)院探訪患者的健康人群和社區(qū)健康人群1,110例，與病例組按性別、年齡（±2歲）進行匹配。所有調(diào)查對象均在福建省居住10年以上并且可以清晰回答問題者。研究經(jīng)過福建醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有面訪的調(diào)查對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)查方法 采用統(tǒng)一編制的調(diào)查表，由經(jīng)過統(tǒng)一培訓的調(diào)查員通過面訪形式對所有調(diào)查對象進行調(diào)查。調(diào)查內(nèi)容包括：一般情況、病例情況、吸煙史、飲酒史、飲茶史、疾病史、職業(yè)史、家族史等。應用EpiData 3.1雙錄入數(shù)據(jù)，經(jīng)邏輯糾錯，一致性檢驗，并隨機抽樣10%復查。吸煙定義為累計吸煙大于100支。環(huán)境煙草煙霧暴露按是否在工作場所和/或家庭環(huán)境中每日暴露于吸煙者呼出的煙霧時間超過15 min。飲酒定義為每周至少1次，持續(xù)半年以上。飲茶定義為每周至少1杯，持續(xù)半年以上。裝修后有氣味定義為裝修后入住時調(diào)查對象還可以感受到刺激性氣味。

1.2.2 實驗方法 每例患者與對照抽取外周靜脈血5 mL，高速離心分離出白細胞用于提取DNA。應用MALDITOF-MS（美國，Sequenom）技術(shù)對所有研究對象HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性進行基因分型[5]。檢測結(jié)果應用TYPER 4.0軟件（Sequenom）完成分型，并輸出結(jié)果。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 采用χ2檢驗，比較病例組和對照組在年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、職業(yè)、體重指數(shù)（body mass index, BMI）等方面的分布差異，比較病例組和對照組間基因型頻率的分布差異；采用非條件Logistic回歸模型，分析HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌的關(guān)聯(lián)，調(diào)整可能的混雜因素后計算調(diào)整比值比（odds ratio, OR）值及95%CI；采用分層分析方法評價HIF-1α基因多態(tài)性與肺癌的關(guān)聯(lián)及其與環(huán)境因素對肺癌形成的影響；采用Logistic回歸模型進行相乘模型交互作用的分析；采用相對超危險度比（relative excess risk due to interaction, RERI）、歸因比（attributable proportion due to interaction, AP）、交互作用指數(shù)（synergy index, S）及其95%CI三個指標估計相加交互作用。統(tǒng)計學檢驗由SPSS v.23.0軟件包完成。所有P值基于雙側(cè)檢驗，統(tǒng)計學顯著性水平設定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 截止至2012年12月共收集肺癌病例1,096例，正常對照1,110例，病例組的平均年齡為（58.70±10.77）歲，對照組的平均年齡為（59.01±10.83）歲（t=0.685,P=0.493）；病例組BMI［體重（kg）/身高2（m2）］為（22.15±3.13）kg/m2，對照組為（23.43±3.16）kg/m2（t=0.468, P＜0.001）；其中病例組男性為776例（70.8%）、女性為320例（29.2%），對照組男性為790例（71.2%）、女性為320例（28.8%）。經(jīng)均衡性檢驗，發(fā)現(xiàn)兩組在年齡、性別、婚姻狀況方面的分布無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但在BMI、文化程度及職業(yè)的分布有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），見表1。

表 1 病例組和對照組的一般情況Tab 1 Demographic characteristics of case and control groups

2.2 環(huán)境相關(guān)因素Logistic回歸分析 經(jīng)過性別、年齡、文化程度、職業(yè)、婚姻狀況及BMI因素調(diào)整的Logistic回歸分析結(jié)果提示，室內(nèi)通風情況不佳（近一年與十年前）、暴露于烹調(diào)油煙（近一年與十年前）、吸煙、被動吸煙暴露、飲酒、既往存在肺部疾病史及腫瘤家族史均可不同程度增加罹患肺癌風險，見表2。

2.3 rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系 SNP分型結(jié)果提示，HIF-1α基因rs2057482檢出率為94.6%。如表3所示，該位點在1,110名正常對照中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P值為0.05）。說明研究對象具有較好的人群代表性。按照病理類型分類分析的多元Logistic回歸分析結(jié)果顯示，攜帶有HIF-1α基因rs2057482位點T基因型的人群更容易罹患小細胞癌（TT vs CC的OR值為1.725，95%CI：1.047-2.842），尚未發(fā)現(xiàn)rs2057482位點多態(tài)性與肺癌其他病理類型的關(guān)聯(lián)（表3）。

2.4 環(huán)境相關(guān)因素分層分析rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)系 環(huán)境相關(guān)因素分層Logistic回歸分析結(jié)果顯示：調(diào)整一般情況和肺癌有關(guān)影響因素后，在共顯性遺傳模型中，暴露于被動吸煙的rs2057482 TT攜帶者的肺癌患病風險是CC攜帶者的2.195倍（95%CI: 1.038-4.643）。在顯性遺傳模型中，有腫瘤家族史的rs2057482 T基因攜帶者的肺癌患病風險是C基因攜帶者的1.911倍（95%CI:1.121-3.258）。在隱性遺傳模型中，有肺部疾病史的rs2057482 TT攜帶者的肺癌患病風險是TC+CC攜帶者的0.159倍（95%CI: 0.028-0.920）。在加性遺傳模型中，有腫瘤家族史的rs2057482 TC+TT攜帶者的肺癌患病風險是CC攜帶者的1.542倍（95%CI: 1.107-2.340）。而在各個遺傳模型中，均未見其余因素分層分析時HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌的關(guān)聯(lián)（表4）。

2.5 rs2057482位點多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析 根據(jù)分層分析結(jié)果顯示，rs2057482位點顯性遺傳模型在腫瘤家族史分層分析中存在層間不一致（P=0.025），隱性遺傳模型在被動吸煙、肺部疾病史分層分析中存在層間不一致（P=0.023; P=0.020），提示其中可能存在混雜或修飾效應。相乘交互作用分析顯示：顯性模型下，rs2057482位點多態(tài)性與腫瘤家族史之間不存在相乘交互作用（P=0.095）。隱性模型下，rs2057482位點與被動吸煙之間存在正相乘交互作用（P=0.013），與肺部疾病史存在負相乘作用（P=0.016）。進一步分析相加交互作用，結(jié)果顯示無論是在顯性模型還是隱性模型下，rs2057482位點多態(tài)性與腫瘤家族史、被動吸煙、肺部疾病史等環(huán)境因素之間不存在相加交互作用。

表 2 肺癌危險因素Logistic回歸分析Tab 2 Logistic regression analysis of lung cancer risk factors

表3 rs2057482與不同病理類型肺癌的易感性關(guān)聯(lián)結(jié)果Tab3 Association of rs2057482 locus polymorphism with susceptibility to lung cancer of different pathological types

3 討論

空氣污染室內(nèi)空氣污染來源多樣，煙草煙霧是其重要來源，而裝修材料的揮發(fā)氣體、烹調(diào)油煙及居室通風狀況等都可能影響室內(nèi)空氣質(zhì)量，增加肺癌發(fā)病風險[6]。而室內(nèi)空氣污染則可能降低氧氣含量，造成乏氧環(huán)境。人類HIF-1α基因定位于14號染色體（14q21-24），cDNA全長3,720 bp，編碼826個氨基酸[7]。當細胞處于乏氧狀態(tài)時，由于第402位、564位的脯氨酸殘基無法被脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylase, PHD）所羥化，HIF-1α在細胞內(nèi)大量積累，并與HIF-1β相結(jié)合形成具有轉(zhuǎn)錄作用的HIF-1[8]。隨后，HIF-1可以識別并結(jié)合下游靶基因的特定DNA序列，如血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、促紅細胞生成素（erythropoietin, EPO）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1, HO-1）、糖酵解酶等[9]。這些基因的激活可與肺癌的形成、惡化和轉(zhuǎn)移有重要關(guān)聯(lián)[2]。盡管HIF-1α基因的高表達被證實與肺癌的形成與惡化有關(guān)[10]，但其中的分子機制卻仍不清楚，考慮可能與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt）信號通路、細胞因子信號傳導抑制蛋白-1、脯氨酸羥化酶PHD家族、基質(zhì)金屬蛋白酶等的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)，HIF-1α在肺癌的血管生成、細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、浸潤和代謝等中發(fā)揮的作用使其有望成為治療肺癌的一個重要靶點[11-13]。到目前為止，關(guān)于人類HIF-1α基因的SNPs有一部分已經(jīng)被確認，主要有rs11549465、rs11549467和rs2057482。

本研究主要探討室內(nèi)空氣污染、HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。rs2057482位于HIF-1α基因3’端非編碼區(qū)與miRNA-199a的結(jié)合區(qū)域附近，其多態(tài)性可能會影響miRNA-199a的穩(wěn)定性，從而影響HIF-1α的mRNA和蛋白表達[14]。一項與宮頸癌患病風險的研究[15]結(jié)果顯示，攜帶CC基因型的人群宮頸癌患病風險是攜帶CT/TT基因型的1.44倍（95%CI:1.11-1.88）。盡管并未發(fā)現(xiàn)HIF-1α基因rs2057482單個位點與前列腺癌患病風險之間的關(guān)聯(lián)，Li等[16]對中國漢族人群HIF-1α基因多態(tài)性和前列腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)研究，通過rs2057482與rs11549467位點結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，攜帶≥3個等位基因可使前列腺癌的患病風險增加2.10倍（95%CI: 1.23-3.57）。Qin等[17]對該位點與腎細胞癌預后研究，Zhang等[18]對該位點與結(jié)直腸癌預后研究以及與另一項肝細胞癌預后研究[19]結(jié)果提示，攜帶rs2057482 CT/TT基因型的患者較攜帶CC基因型的患者復發(fā)率降低，預后更好。同時發(fā)現(xiàn)rs2057482位點多態(tài)性可能影響mRNA

的穩(wěn)定性以及和microRNA的結(jié)合能力，降低HIF-1α基因的表達能力和細胞內(nèi)HIF-1α蛋白的含量，從而產(chǎn)生抗腫瘤效應[19]。

表 4 rs2057482與肺癌易感性關(guān)聯(lián)的分層分析結(jié)果Tab 4 Stratified analysis of association between four SNPs in rs2057482 and susceptibility to lung cancer aOR (95%CI)＃

本研究結(jié)果提示，在全人群中，rs2057482位點T基因型與小細胞肺癌易感性有關(guān)聯(lián)。分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，調(diào)整一般情況和肺癌有關(guān)影響因素后，rs2057482 T基因攜帶者在共顯性遺傳模型中，可增加暴露于被動吸煙人群的肺癌患病風險；在顯性遺傳模型和加性遺傳模型中，可增加有腫瘤家族史人群的肺癌患病風險；在隱性遺傳模型中，可降低肺部疾病史人群的肺癌患病風險。Zhang等[20]通過培養(yǎng)A549和H157細胞株研究尼古丁與HIF-1α基因表達的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)尼古丁可通過激活nAchR調(diào)節(jié)的信號通路來促進HIF-1α蛋白的積累和下游VEGF的表達，對肺癌的形成和惡化起到重要的作用。Guo等[21]的研究也得出了類似的結(jié)論，研究發(fā)現(xiàn)尼古丁可通過誘導線粒體活性氧的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)HIF-1α基因的表達。因此一定程度上支持本研究結(jié)果。而對于危險基因型別的判斷，本文結(jié)果與Fu、Qin等[15,17]的研究結(jié)論不一致，原因可能是研究的腫瘤類別不一致，上述研究種類是腎細胞癌和宮頸癌，不同腫瘤的發(fā)病機制不同，故可能會得出不一致的結(jié)論，也有可能是研究地區(qū)的不同和人群異質(zhì)性的影響，本研究主要針對福建地區(qū)漢族人群rs2057482位點多態(tài)性，目前該地區(qū)尚無類似的文章可供參考，其他諸如不同的樣本量等因素都可能使結(jié)論受到影響。

本研究采用病例對照研究設計，樣本量較大，將增大結(jié)果的可信性；研究針對福建地區(qū)的漢族人群，可以排除不同民族人群本身的基因差異對研究結(jié)果的影響；研究不僅分析了全人群中HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，并按照不同病理類型及各類環(huán)境因素進行了相應的分類及分層分析，研究了不同亞型人群中rs2057482位點多態(tài)性和肺癌易感性的關(guān)聯(lián)，為探討HIF-1α基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了參考。但研究仍然存在一定的局限：首先以醫(yī)院為基礎的病例對照研究，無法完全排除選擇偏倚；其次研究中rs2057482檢出率為94.6%，可能與樣本質(zhì)量有關(guān)，盡管可能未能成功分型的樣本可能會影響結(jié)果，但5%左右的未檢出率符合質(zhì)量控制要求，不易造成現(xiàn)有結(jié)果方向的改變；本研究僅探討單基因位點，未能分析基因-基因交互作用，另外未進行功能學研究。因此，未來相關(guān)研究可增加檢測HIF-1α基因SNPs的個數(shù)或者與肺癌發(fā)生有關(guān)基因的SNPs（例如DNA修復基因、癌基因和抑癌基因），并在此基礎上增加細胞株的培養(yǎng)或采用免疫組化的方法來檢測HIF-1α基因mRNA的水平和HIF-1α蛋白的表達，從而為闡明HIF-1α基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制提供科學的依據(jù)，有助于肺癌的預防和后期的臨床診斷及治療，從而提升人群的健康水平。