劉瑞敏 張愛紅 晁瑋霞 孫丹妮 王明麗 馬遠方 白慧玲

(抗體藥物開發(fā)技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，河南大學基礎醫(yī)學院，開封475000)

高表達Foxp3的肺癌細胞抑制人CD4+T細胞免疫活性①

劉瑞敏 張愛紅 晁瑋霞 孫丹妮 王明麗 馬遠方 白慧玲

(抗體藥物開發(fā)技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，河南大學基礎醫(yī)學院，開封475000)

目的：研究高表達轉錄因子Foxp3的肺癌細胞對CD4+T淋巴細胞的作用。方法：利用脂質體轉染法建立穩(wěn)定高表達Foxp3的NCIH- hFoxp3肺癌細胞株，熒光定量PCR和Western blot檢測細胞Foxp3的表達；ELISA法檢測NCIH- hFoxp3培養(yǎng)上清中IL- 8、IL- 10表達量的變化；分離并活化CD4+T淋巴細胞，用含20%NCIH- hFoxp3腫瘤上清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測CD4+T淋巴細胞IL- 2表達量的變化；將NCIH- hFoxp3與活化的CD4+T淋巴細胞共培養(yǎng)，MTT評價免疫效應細胞增殖情況；免疫細胞化學法觀察NCIH- hFoxp3細胞對活化CD4+T淋巴細胞黏附作用的抑制。結果：建立高表達Foxp3的NCIH- hFoxp3肺癌細胞株，與陰性對照相比，NCIH- hFoxp3細胞培養(yǎng)上清IL- 8表達量降低，IL- 10表達量升高，NCIH- hFoxp3腫瘤細胞能抑制活化的CD4+T淋巴細胞IL- 2的表達、增殖及浸潤。結論：肺癌細胞Foxp3的表達對活化的CD4+T淋巴細胞有免疫抑制作用，這可能與NCIH- hFoxp3分泌細胞因子IL- 8表達量降低，IL- 10表達量升高有關。

Foxp3；肺癌；IL- 8；IL- 10；CD4+T淋巴細胞；免疫活性

機體免疫系統(tǒng)可以通過免疫監(jiān)視作用識別、控制最終消滅腫瘤細胞，而腫瘤細胞可通過多種機制逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視而生存。腫瘤細胞能否逃逸免疫監(jiān)視是影響腫瘤形成和發(fā)展的主要原因。調節(jié)性T淋巴細胞(Treg)在機體免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要的作用，轉錄因子Foxp3是Treg 的標志性分子之一，對Treg細胞的發(fā)育及功能發(fā)揮起著關鍵的作用[1]。

Treg細胞與腫瘤的發(fā)生及轉移有密切關系。在人結腸癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤組織內都發(fā)現(xiàn)了高比率的Treg細胞，在子宮頸癌，其轉移的淋巴結內發(fā)現(xiàn)有較高比率的Treg細胞[2]。在小鼠腫瘤模型中，腫瘤部位也具有很高比率的Treg細胞，用抗CD25的抗體預先處理小鼠，腫瘤細胞則被排斥，腫瘤不會形成[3]。這些研究結果說明，可能正是腫瘤組織存在和聚集的Treg細胞抑制了免疫功能，使腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸形成腫瘤。最近研究發(fā)現(xiàn)，一些高表達Foxp3的腫瘤具有類似于Treg細胞的免疫抑制作用。我們建立高表達Foxp3的肺癌細胞株，探討高表達Fox3的肺癌細胞以何種方式和途徑影響活化的CD4+T細胞的免疫功能，為腫瘤的治療和預防提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 肺癌細胞NCIH- 1299來自本實驗室，pcDNA3- hFoxp3質粒和pcDNA3對照質粒由田文志教授饋贈。SYBR Green熒光定量PCRmix購自北京康為公司，鼠抗人Foxp3 單克隆抗體購自Abcam公司，人IL- 8、IL- 10的ELISA試劑盒、鼠抗人CD3單克隆抗體、鼠抗人CD28單克隆抗體購自武漢博士德生物公司。

1.2 方法

1.2.1 脂質體轉染法轉染并篩選穩(wěn)定高表達Foxp3的肺癌細胞株 轉染步驟按照Invitrogen公司Lipofectamine 2000試劑盒的說明書。用G418篩選轉染后的細胞，濃度為1 000 mg/L，用有限稀釋法挑選擴增穩(wěn)定高表達Foxp3的細胞株，命名為NCIH- hFoxp3。

1.2.2 熒光定量PCR、Western blot方法驗證轉染效果 取NCIH- hFoxp3及對照細胞，Trizol法提取RNA，按照逆轉錄試劑盒操作說明將獲得的RNA轉錄成cDNA。熒光定量擴增Foxp3目的片段，上游引物5′- TTCTTCCTTGAACCCCATGC- 3′ ；下游引物5′- CTGGAGGAGTGCCTGTAAGT- 3′，產物為118 bp。β- actin為內參:上游引物5′- CCTAGAAGCATTTGCG- GTGG- 3′；下游引物5′- GAGCTACGAGCTGCCTGA- CG- 3′，產物為220 bp。用熒光定量PCR儀所配軟件Rotor- Gene 6000 Series Software對實驗結果進行分析。取NCIH- hFoxp3及對照組細胞提取蛋白做SDS- PAGE凝膠電泳，電泳后轉移至PVDF膜上，加鼠抗人Foxp3抗體4℃過夜，加山羊抗鼠二抗，暗室顯影，用β- actin為內參比較。

1.2.3 ELISA檢測NCIH- hFoxp3和對照組細胞培養(yǎng)上清中IL- 8、IL- 10的表達差異 把對數(shù)增長期的細胞接種到6孔板中，設3個復孔。在培養(yǎng)24、36、48 h后收集細胞的培養(yǎng)上清，低溫離心5 min后凍存。按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測細胞IL- 8、IL- 10的表達量，實驗重復3次。

1.2.4 分離并活化CD4+T細胞 無菌抽取健康人外周血30 ml，密度梯度離心法分離單個核細胞，利用MACS磁性分離柱分離出CD4+T淋巴細胞。使用抗CD3和抗CD28抗體刺激分離的CD4+T淋巴細胞，方法為用抗CD3抗體2 μg/ml包被6孔板12 h，再加CD4+T淋巴細胞和抗CD28抗體2 μg/ml，刺激3 d。

1.2.5 ELISA方法檢測活化的CD4+T淋巴細胞用NCIH- hFoxp3和對照細胞上清培養(yǎng)后IL- 2表達量的變化 將NCIH- hFoxp3和對照組肺癌細胞按照相同數(shù)目接種，待細胞長至80%融合時，用PBS洗滌6次，改為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，取培養(yǎng)上清備用?；罨腃D4+T細胞用加入含20%腫瘤細胞上清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)4、8、12、24 h時收集細胞培養(yǎng)上清，離心5 min。按照人ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測IL- 2表達量。

1.2.6 免疫細胞化學方法觀察NCIH- hFoxp3和對照組細胞對活化的CD4+T淋巴細胞黏附的抑制作用 把兩種肺癌細胞以相同的數(shù)目接種到6孔板中的蓋玻片上，加入活化的CD4+T細胞，CD4+T細胞NCIH- hFoxp3和對照組細胞的比例為5∶1，設3個復孔。培養(yǎng)6 h后，取出細胞爬片，進行免疫細胞化學染色。用PBS沖洗爬片3次，95%酒精固定 10 min，滴加鼠抗人Foxp3抗體孵育4℃ 過夜。山羊抗鼠二抗孵育37℃ 30 min，滴加DAB顯色液顯色約3～10 min，中性樹膠封片。

1.2.7 共培養(yǎng)系統(tǒng)對 CD4+T 細胞增殖的影響 將磁珠分離的 CD4+T 細胞活化增殖 3 d 后調整濃度為1×105ml-1。與肺癌細胞NCIH- hFoxp3按1∶1的比例共同培養(yǎng)，共培養(yǎng)系統(tǒng)采用24孔Transwell 細胞共培養(yǎng)板，NCIH- hFoxp3在上室，T細胞在下室，用 10%血清的1640培養(yǎng)基，72 h 后收集下室T細胞，細胞吹打均勻后接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μl，設3個復孔，每孔加人MTT 10 μl，孵育4 h，然后加入DMSO 100 μl，繼續(xù)孵育2 h，用全自動酶標儀測492 nm處吸光度(A值)。

2 結果

2.1 建立穩(wěn)定高表達Foxp3的細胞株NCIH- hFoxp3 熒光定量PCR的結果如圖1:熒光定量法對NCIH- hFoxp3及對照細胞進行Foxp3基因擴增，重復3次，2-ΔΔCT值均在4以上，差異具有統(tǒng)計學意義。Western blot結果如圖2: NCIH- hFoxp3細胞在48 kD大小的位置出現(xiàn)明顯的條帶，而NCIH- 1299細胞和空白質粒對照細胞在48 kD大小的位置沒有出現(xiàn)明顯的條帶，表明pcDNA3- hFoxp3質粒轉染到NCIH- 1299細胞中，在蛋白水平上高表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2 NCIH- hFoxp3和對照細胞培養(yǎng)上清IL- 8、IL- 10表達差異 用ELISA方法檢測在不同的時間點細胞培養(yǎng)上清中IL- 8、IL- 10表達量的差異，結果如圖3:兩組細胞上清中IL- 8的含量都隨著培養(yǎng)時間的增加而增加； NCIH- hFoxp3細胞組中IL- 8的含量明顯低于對照組，兩組的差異有統(tǒng)計學意義(t24 h=76.72、t36 h=34.01、t48 h=43.76，P<0.01)。圖4所示，NCIH- hFoxp3細胞組上清中IL- 10的含量隨時間的增加有明顯升高，在36 h后含量高于對照組，36 h后兩組的差異有統(tǒng)計學意義(t36 h=9.40，P<0.05；t48 h=23.93，P<0.01)。

2.3 活化的T淋巴細胞用NCIH- hFoxp3和對照細胞上清培養(yǎng)后IL- 2表達量變化 活化的T細胞用含20%腫瘤細胞上清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)4、8、12、24 h時收集培養(yǎng)上清檢測IL- 2的濃度。結果如圖5所示: hFoxp3上清培養(yǎng)組T細胞IL- 2的表達量隨培養(yǎng)時間的增長而下降，NCIH- control上清培養(yǎng)組T細胞IL- 2的表達量先上升，培養(yǎng)8 h后逐漸下降。在各個時間點NCIH- hFoxp3上清培養(yǎng)組T細胞IL- 2的表達量都明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(t4 h=16.50、t8 h=61.33、t12 h=6.87、t24 h=12.39,P<0.05)。

圖1 高表達Foxp3的細胞株NCIH- hFoxp3的PCR鑒定Fig.1 Identification of NCIH- hFoxp3 by quantitative PCRNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

圖2 高表達Foxp3的細胞株NCIH- hFoxp3的Western blot圖及統(tǒng)計學分析圖Fig.2 Identification of NCIH- hFoxp3 by Western blotNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

圖3 兩組細胞培養(yǎng)上清不同時間IL- 8含量對比Fig.3 Concentration of IL- 8 in tumor cells supernatants at different timeNote: Vs NCIH- control，**.P<0.01.

圖4 兩組細胞培養(yǎng)上清不同時間IL- 10含量對比Fig.4 Concentration of IL- 10 in the tumor cells superna- tants at different time Note: Vs control，*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 T細胞與兩組細胞培養(yǎng)上清共培養(yǎng)后T細胞IL- 2表達量的變化Fig.5 Concentration of IL- 2 of CD4+T cells in superna- tants after culturing with tumor supernatants at different timeNote: Vs.NCIH- control，*.P<0.05.

圖6 NCIH- hFoxp3和對照組細胞對活化CD4+T淋巴細胞黏附作用的抑制Fig.6 Inhibiting of CD4+T cells to adhesion to NCIH- hFoxp3 and control cells

表1 活化的CD4+T細胞周圍黏附的NCIH- hFoxp3和對照細胞比較

Tab.1 To contrast the numbers of NCIH- hFoxp3 and control cells around active CD4+T cells

GroupsTumorcellsCD4+TcellsCD4+Tcells/tumorcellsNCIH-hFoxp356.4±6.487.4±1.920.129±0.0251)NCIH-control32.9±4.8447.2±8.891.439±0.209

Note：1)P<0.01 vs NCIH- control.

圖7 NCIH- hFoxp3和對照組細胞對 CD4+T 細胞增殖的影響Fig.7 Effects of NCIH- hFoxp3 and NCIH- control on CD4+T cells proliferating

2.4 NCIH- hFoxp3和對照組細胞對活化CD4+T淋巴細胞黏附作用的抑制 結果如圖6、表1所示:與 NCIH- control組腫瘤細胞周圍聚集的T細胞相比，NCIH- hFoxp3組腫瘤細胞周圍聚集的T細胞明顯減少。隨機取5個視野，分別計算視野中的腫瘤細胞和T細胞的個數(shù)。NCIH- hFoxp3組平均1個腫瘤細胞周圍有0.129個T淋巴細胞，NCIH- control組平均1個腫瘤細胞周圍有1.439個T細胞，兩組的差異具有統(tǒng)計學意義。

2.5 共培養(yǎng)系統(tǒng)對 CD4+T 細胞增殖的影響 NCIH- hFoxp3和對照組分別與CD4+T細胞共培養(yǎng)的MTT結果如圖7所示，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，與對照組相比，NCIH- hFoxp3肺癌細胞能抑制效應性 CD4+T 細胞增殖，這種抑制增殖能力不依賴細胞接觸，差異具有統(tǒng)計學意義(t=7.69，P<0.01)。

3 討論

腫瘤形成及轉移是多階段連續(xù)的復雜過程，受多種因素的影響，腫瘤細胞能否逃逸免疫監(jiān)視是影響腫瘤形成的主要原因之一。Treg細胞在機體的免疫監(jiān)視過程中發(fā)揮重要的作用，F(xiàn)oxp3主要在Treg表達，是Treg的標志性分子，主要通過維持Treg發(fā)育發(fā)揮作用[4]。Treg 細胞可通過分泌免疫抑制因子IL- 10及IL- 35發(fā)揮其調節(jié)功能[5]，如IL- 10抑制效應T細胞的活性，而IL- 35則具有抑制T細胞的增殖等。Treg細胞的確與腫瘤的發(fā)生及轉移有密切關系。在多種腫瘤組織內都發(fā)現(xiàn)了高比率的Treg細胞，而且在非小細胞肺癌、胃癌均發(fā)現(xiàn)Treg細胞與腫瘤的侵襲與轉移呈正相關[6- 9]。這些研究結果說明，可能腫瘤組織存在和聚集的Treg細胞，使腫瘤細胞免疫逃逸。

Treg在腫瘤免疫逃逸中具有重要作用，而Treg發(fā)育和免疫抑制作用主要受Foxp3的調控。最近研究發(fā)現(xiàn)，一些高表達Foxp3的腫瘤具有類似于Treg細胞的免疫抑制作用，如人神經膠質瘤細胞抑制T細胞增殖等[10]。高表達Foxp3的腫瘤細胞對活化的CD4+T淋巴細胞免疫活性的影響的報道較少。本實驗的目的是觀察高表達Foxp3的肺癌細胞株對活化CD4+T淋巴細胞的作用，更符合腫瘤免疫的過程。實驗中，我們測定了活化的CD4+T淋巴細胞用NCIH- hFoxp3和對照細胞上清培養(yǎng)后IL- 2表達量的變化，發(fā)現(xiàn)NCIH- hFoxp3上清培養(yǎng)組的CD4+T淋巴細胞IL- 2的表達量明顯低于NCIH- control上清培養(yǎng)組，NCIH- hFoxp3和對照組分別與CD4+T細胞共培養(yǎng)的MTT顯示，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中NCIH- hFoxp3肺癌細胞能抑制效應性 CD4+T 細胞增殖，這種抑制增殖能力不依賴細胞接觸，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。以上實驗結果提示高表達Foxp3的肺癌細胞可以抑制活化的CD4+T細胞的增殖及活性，IL- 2在CD4+T細胞的增殖中發(fā)揮重要作用[11]。

本實驗用ELISA方法檢測了肺癌細胞株NCIH- hFoxp3和對照細胞上清中IL- 8、IL- 10和TGF- β的表達，發(fā)現(xiàn)NCIH- hFoxp3組細胞上清中IL- 8明顯降低，IL- 10明顯升高，而TGF- β的分泌量差異無統(tǒng)計學意義(實驗結果中未列出)。IL- 10是一種重要的參與免疫負調控的細胞因子，能抑制CD4+T細胞向Th1細胞分化，從而抑制Th1細胞對CD8+T細胞免疫的輔助作用[12]。而機體的抗腫瘤免疫，以效應CD8+T細胞免疫應答為主，高表達Foxp3的腫瘤細胞可能通過這種方式逃逸機體的免疫監(jiān)視作用，這和CD4+CD25+Foxp3調節(jié)性T細胞的調節(jié)作用相似。

我們用免疫細胞化學染色對活化的CD4+T細胞和兩組肺癌細胞共同培養(yǎng)時細胞的浸潤進行統(tǒng)計，在NCIH- hFoxp3細胞周圍浸潤的T淋巴細胞明顯少于對照組，NCIH- hFoxp3可以通過直接接觸抑制CD4+T細胞的作用。

本實驗還發(fā)現(xiàn)NCIH- hFoxp3細胞表達IL- 8低于對照組細胞。IL- 8對特異性和非特異性的免疫細胞具有強烈的趨化作用，包括對嗜中性粒細胞的趨化和激活作用及對淋巴細胞和嗜堿性粒細胞的趨化作用。有研究者發(fā)現(xiàn)表達Foxp3的腫瘤細胞表現(xiàn)出和CD4+CD25+Foxp3調節(jié)性T細胞相似的特性，即可抑制CD4+CD25-T 細胞的增殖，用Foxp3 siRNA抑制腫瘤細胞Foxp3表達后，腫瘤細胞分泌的IL- 8增高[13]，同我們的研究結果一致。而大量研究表明，在腫瘤組織中Foxp3高表達的患者預后不良[14]，所以我們推測，腫瘤局部IL- 8低表達，對免疫細胞趨化作用減弱，抑制了免疫細胞的浸潤，這也是腫瘤細胞逃逸免疫殺傷的機制之一。

綜上所述，我們得出結論，高表達Foxp3的肺癌細胞抑制了T細胞的浸潤能力及活化的T細胞的免疫作用，這可能是通過調節(jié)細胞因子IL- 8和IL- 10的分泌而實現(xiàn)的。

[1] Shankaran V,Ikeda H,Schreiber RD,etal.IFN gamma and lymphocytes prevent primary tumor development and shape tumour immunogenicity[J].Nature,2001,410(6832):1107- 1111.

[2] Recouvreux MS,Grasso EN,Echeverria PC,etal.RUNX1 and FOXP3 interplay regulates expression of breast cancer related genes[J].Oncotarget,2015,7(6):6552- 6565.

[3] Bui JD,Uppaluri R,Schreiber RD,etal.Comparative analysis of regulatory and effector T cells in progressively growing versus rejecting tumors of similar origins[J].Cancer Res,2006,66(14):7301- 7309.

[4] Quesada AE,Assylbekova B,Jabcuga CE,etal.Expression of Sirt1 and FoxP3 in classical Hodgkin lymphoma and tumor infiltrating lymphocytes:Implications for immune dysregulation,prognosis and potential therapeutic targeting[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(10):13241- 13248.

[5] Chu KH,Chiang BL.Characterization and functional studies of fork head box protein 3(- )lymphocyte activation gene 3(+)CD4(+)regulatory T cells induced by mucosal B cells[J].Clin Exp Immunol,2015,180(2):316- 328.

[6] 張 飚.轉錄因子Foxp3在腫瘤細胞中的表達及其功能的研究進展[J].國際免疫學雜志，2014,37(1):49- 50.

[7] 潘貝晶,平國強,張煒明，等.三陰性乳腺癌間質腫瘤浸潤淋巴細胞表達CD8和FOXP3的臨床病理分析[J].中華病理學雜志，2016,45(8):540- 545.

[8] Wei T,Zhang J,Qin Y,etal.Increased expression of immunosuppressive molecules on intratumoral and circulating regulatory T cells in non- small- cell lung cancer patients[J].Am J Cancer Res,2015,5(7):2190- 2201.

[9] Hao Q,Li W,Zhang C,etal.TNF- α induced FOXP3- NFκB interaction dampens the tumor suppressor role of FOXP3 in gastric cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun，2013,430(1):436- 441.

[10] Wang L,Zhang B,Xu X,etal.Clinical significance of FOXP3 expression in human gliomas[J].Clin Transl Oncol，2014,16(1):36- 43.

[11] Ozgur HH,Ercetin AP,Eliyatkin N,etal.Regulatory T cells and their prognostic value in hepatopancreatobiliary tumors[J].Hepatogastroenterology,2014,61(135):1847- 1851.

[12] 吳小麗,張 婷,王昕婧，等.腫瘤相關巨噬細胞通過分泌 IL10 影響上皮性卵巢癌腫瘤微環(huán)境中 T 細胞亞群 Treg/Th17 失衡[J].中國免疫學雜志,2014,30(12):1585- 1590.

[13] Zeng C,Yao Y,Jie W,etal.Up- regulation of Foxp3 participates in progression of cervical cancer[J].Cancer Immunol Immunother，2013,62(3):481- 487.

[14] 李 莎,李 巖,梁 婧，等.非小細胞肺癌患者外周血Foxp3+T細胞和Th17的檢測與臨床意義[J].中華微生物學和免疫學雜志,2012,32(7):642- 646.

[收稿2016- 11- 21 修回2017- 03- 07]

(編輯 倪 鵬)

Foxp3 overexpression in lung cancer cells suppresses immune activities of activa- ted CD4+T cells

LIU Rui- Min，ZHANG Ai- Hong，CHAO Wei- Xia,SUN Dan- Ni,WANG Ming- Li,MA Yuan- Fang，BAI Hui- Ling.

Joint National Laboratory for Antibody Drug Engineering,Medical College of Henan University,Kaifeng 475000,China

Objective:To determine the effects of Foxp3- overexpressing lung cancer cells on activated CD4+T lymphocyte.Methods: Stable Foxp3- overexpressing lung cancer cells NCIH- 1299,NCIH- hFoxp3,was generated by transfection of NCIH- 1299 cells with plasmid pcDNA3- hFoxp3 mediated by Lipofectamine 2000 and by selection with G418,and validated by quantitative PCR and Western blot.The expression levels of IL- 8 and IL- 10 secreted by NCIH- hFoxp3 and NCIH- control were measured by ELISA.IL- 2 secrection by activated human CD4+T lymphocyte which was tested after stimulation with 20% conditioned medium of NCIH- hFoxp3 and NCIH- control cells.The proliferation of activated human CD4+T lymphocytes was assessed by MTT after coculture with NCIH- hFoxp3 cells.The adhesive ability of activated human CD4+T lymphocytes was probed with NCIH- hFoxp3 cells by immunocytochemistry.Results: Compared with NCIH- control cells,NCIH- hFoxp3 secreted high level of IL- 10 and low level of IL- 8.NCIH- hFoxp3 with Foxp3 overexpression significantly suppressed the proliferation,adhesive potential and IL- 2 expression by activated CD4+T cells.Conclusion: Suppression of immune activities of activated CD4+T cells by Foxp3 overexpression in lung cancer cells may correlate with cytokine IL- 8 and IL- 10,which can contribute lung cancer progression.

Foxp3;Lung cancer;IL- 8;IL- 10;CD4+T lymphocyte;Immune activities

10.3969/j.issn.1000- 484X.2017.08.004

劉瑞敏(1974年-)，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤免疫方面的研究。

及指導教師：白慧玲(1964年-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主要從事自身免疫性疾病及腫瘤免疫方面的研究，E- mail:445950688@qq.com。

R730.3

A

1000- 484X(2017)08- 1141- 05

①本文為河南省衛(wèi)生廳2010醫(yī)學科技攻關計劃(2010003083)。