劉 莎，張小娟，王 煒，陳 林，廖 彥，魯耀邦，唐映紅，崔培梧#（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥性與藥效實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥物創(chuàng)新與發(fā)展實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208）

液態(tài)發(fā)酵法合成雪峰蟲草活性成分的初步研究Δ

劉 莎1，2＊，張小娟1，2，王 煒1，3，陳 林1，2，廖 彥1，2，魯耀邦1，2，唐映紅1，2，崔培梧1，2#（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥性與藥效實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥民族藥物創(chuàng)新與發(fā)展實(shí)驗(yàn)室，長沙 410208）

目的：探索液態(tài)發(fā)酵法合成雪峰蟲草活性物質(zhì)的基礎(chǔ)工藝，為雪峰蟲草資源的綜合開發(fā)提供必要技術(shù)支持。方法：利用液態(tài)發(fā)酵技術(shù)對雪峰蟲草菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，并通過培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件控制來實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的高效合成。以雪峰蟲草菌為出發(fā)菌株，分別考察不同碳源（蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉）、不同氮源（蛋白胨、酵母浸粉、酵母浸膏、硝酸鈉、硝酸鉀和尿素）、不同維生素B（維生素B1和復(fù)合維生素B）和不同初始pH（pH為4、5、6、7、8、9）對雪峰蟲草菌絲生長和胞外多糖、胞內(nèi)多糖、蟲草酸、胞內(nèi)三萜合成的影響，進(jìn)而篩選最佳培養(yǎng)基成分。結(jié)果：最佳碳源為蔗糖，最佳氮源為酵母浸粉，最佳維生素B為維生素B1，最佳初始pH為8。在碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、添加0.1 g/L維生素B1和初始pH為8時可得到較高的生物量和代謝產(chǎn)物積累水平。結(jié)論：雪峰蟲草可在液態(tài)發(fā)酵體系高效積累代謝產(chǎn)物；可通過發(fā)酵過程優(yōu)化控制，實(shí)現(xiàn)該菌株細(xì)胞生長和活性代謝產(chǎn)物合成的優(yōu)化。

雪峰蟲草；活性成分；液態(tài)發(fā)酵；生物合成

冬蟲夏草[Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.]為我國傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥，已有500余年的應(yīng)用歷史，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等活性[1-3]。但由于連年掠奪式采挖和生態(tài)環(huán)境的退化，我國蟲草資源日趨匱乏。因此，發(fā)掘冬蟲夏草替代品成為解決現(xiàn)有蟲草資源危機(jī)的主要手段。雪峰蟲草（Ophiocordyceps xuefengensis sp. nov）是線蟲草菌科線蟲草菌屬的一個新種，也是目前全球報道個體最大的蟲草，因產(chǎn)于雪峰山脈，故名“雪峰蟲草”[4]。雪峰蟲草作為瑤藥在唐朝就有記載，具有補(bǔ)肺益腎、止咳化痰之功效，配伍后對高血壓、病毒性肝炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等癥亦有良好療效[5-6]。真菌分類學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，雪峰蟲草與冬蟲夏草親緣關(guān)系最近，且含有與冬蟲夏草相同的腺苷、蟲草素、蟲草酸、多糖、甾醇等活性成分[6-8]，這意味著雪峰蟲草具有開發(fā)成冬蟲夏草替代品的獨(dú)特潛質(zhì)。

藥用菌物的傳統(tǒng)人工栽培手段存在生長周期長、易受自然環(huán)境影響、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差等不足，而藥用菌物的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)卻可明顯改善上述不足，并已被廣泛應(yīng)用于冬蟲夏草[9]、蛹蟲草[10]、靈芝[11]、茯苓[12]等名貴菌物活性成分的高效合成。因此，探索液態(tài)發(fā)酵體系雪峰蟲草活性物質(zhì)的合成規(guī)律，對于其目標(biāo)代謝產(chǎn)物的定向合成、促進(jìn)雪峰蟲草的高效綜合開發(fā)具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

LB-85A雙層恒溫振蕩培養(yǎng)箱（金壇市博朗儀器制造有限公司）；MJX-250BX霉菌培養(yǎng)箱、DGF-4AB立式電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；UV-5100B紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；PH1MV pH計（上海理達(dá)儀器廠）；GL-21M立式高速冷凍離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 菌株

Ophiocordyceps xuefengensis CCTCC M 2015777，由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌研究室陳作紅教授分離、鑒定為雪峰蟲草菌株，并保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.3 藥品與試劑

熊果酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110742-201220，純度：≥99%）；維生素B1片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號：20150814，規(guī)格：10 mg/片）；復(fù)合維生素B片（威海南波灣生物技術(shù)有限公司，批號：20120419，規(guī)格：500 mg/片）；甘露醇對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：J14D6R7494，純度：≥99%）；葡萄糖、蔗糖、乙酸銨及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 菌種活化

取保藏的雪峰蟲草菌種，轉(zhuǎn)接至馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板上，在28℃下培養(yǎng)10 d，然后轉(zhuǎn)接至不含瓊脂的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，裝液量為100 mL/250 mL，于28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，作為二級菌種。

2.2 培養(yǎng)基的單因素篩選

2.2.1 碳源篩選 以10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入30 g/L的葡萄糖、蔗糖、淀粉，裝液量為100 mL/250 mL，滅菌后接種5%種子培養(yǎng)液，于28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，分析菌絲生長和代謝產(chǎn)物的合成情況。

2.2.2 氮源篩選 以30 g/L葡萄糖、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入10 g/L的酵母浸粉、酵母浸膏、蛋白胨、硝酸鈉、硝酸鉀、尿素，其他操作方法同“2.2.1”項(xiàng)下碳源篩選部分。

2.2.3 生長因子篩選 以30 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入0.1 g/L的維生素B1、復(fù)合維生素B，并以不加維生素為空白對照組，其他操作方法同“2.2.1”項(xiàng)下碳源篩選部分。

2.2.4 培養(yǎng)基初始pH的篩選 以30 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氫鉀、0.5 g/L七水硫酸鎂為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1 mol/L氯化氫或1 mol/L氫氧化鈉將其初始pH值調(diào)為4、5、6、7、8、9，其他操作方法同“2.2.1”項(xiàng)下碳源篩選部分。

2.3 相關(guān)分析方法

2.3.1 生物量的測定 培養(yǎng)結(jié)束后取發(fā)酵液50 mL，過濾后用蒸餾水洗滌3次，然后于60℃烘箱烘至恒質(zhì)量，分析天平稱質(zhì)量后并將單位換算為g/L。

2.3.2 胞外多糖的測定 收集除去菌體的發(fā)酵液，經(jīng)30%（V/V）乙醇沉淀以去除雜蛋白，向上清液繼續(xù)添加乙醇至70%（V/V），劇烈攪拌后在4℃冰箱靜置過夜，于4 500×g離心10 min。收集沉淀，并向沉淀中加4倍量95%乙醇洗滌3次，于60℃烘干，即得胞外粗多糖。采用Sevage法對粗多糖進(jìn)行純化，然后采用苯酚-硫酸法[12-13]測定其含量。

2.3.3 胞內(nèi)多糖的測定 收集50 mL發(fā)酵液的菌絲體，并在60℃烘箱烘至恒質(zhì)量，然后于研缽中充分研磨成精細(xì)粉末，加入100 mL蒸餾水后于沸水浴中回流提取3次，每次提取1 h。趁熱用布氏漏斗過濾并合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾濃縮至約10 mL，繼續(xù)添加乙醇至70%（V/V），劇烈攪拌后在4℃冰箱靜置過夜，于 4 500×g離心10 min。收集沉淀，并向沉淀中加4倍量95%乙醇洗滌3次，于60℃烘干，即得胞內(nèi)粗多糖。采用Sevage法對粗多糖進(jìn)行純化，然后采用苯酚-硫酸法[12-13]測定其含量。

2.3.4 蟲草酸的測定 采用高碘酸鈉比色法測定[14]。將干燥后雪峰蟲草菌絲體于研缽中充分研磨成精細(xì)粉末，加入一定體積蒸餾水后于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中粉碎20 min（冰浴，功率500 W，工作10 s，停留10 s），然后于4 500×g離心10 min。收集上清液，并作適量稀釋后取1 mL稀釋液，加入1 mL高碘酸鈉試液后，室溫放置10 min。加2 mL 0.1%鼠李糖，再加4 mL新配制的納什試劑，53℃水浴15 min，用分光光度計在420 nm波長處測吸光度，按回歸方程計算蟲草酸含量。

2.3.5 胞內(nèi)三萜的測定 采用香草醛-高氯酸顯色法[15]測定。精密稱取雪峰蟲草干菌體粉末0.03 g，加入5 mL甲醇，水浴80℃提取2 h，4 500×g離心10 min。精密吸取上清液1 mL，水浴加熱揮干，分別加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，于60℃水浴加熱15 min后移入冰水浴中，再加入冰乙酸5.0 mL，搖勻后用分光光度計在548 nm波長處測吸光度，按回歸方程計算胞內(nèi)三萜含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同碳源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響

碳源是細(xì)胞生長和代謝產(chǎn)物合成所需碳元素骨架的主要來源，菌絲體在代謝過程中往往會依據(jù)碳源的類型作出相應(yīng)的調(diào)整，并有不同的代謝產(chǎn)物合成規(guī)律[16]。為尋找最優(yōu)碳源，本研究考察了蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉分別作為碳源時雪峰蟲草的代謝特征，結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響（±s，n＝3）Fig 1 Effects of different carbon sources on the mycelial growth and metabolites synthesis of O.xuefengensis（±s，n＝3）

由圖1可知，以蔗糖為碳源時，雪峰蟲草的生物量最高，含量為（3.51±0.12）g/L，且同時可獲得最高含量的蟲草酸和胞內(nèi)三萜，分別為（314.96±13.31）mg/g和（8.97±0.24）mg/g，這些指標(biāo)與葡萄糖組和可溶性淀粉組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；當(dāng)以可溶性淀粉為碳源時，唯有胞外多糖和胞內(nèi)多糖含量比蔗糖組高，而生物量、蟲草酸和胞內(nèi)三萜含量顯著下降，推測為未完全消耗的淀粉對多糖分析結(jié)果產(chǎn)生了影響。因此，蔗糖為最佳碳源。

3.2 不同氮源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響

氮源為細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成的另一重要因素，按照其化學(xué)組成可分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。本實(shí)驗(yàn)選擇了蛋白胨、酵母浸粉和酵母浸膏為有機(jī)氮源，硝酸鈉、硝酸鉀和尿素為無機(jī)氮源，分別考察了其對雪峰蟲草代謝的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，與蛋白胨組比較，無機(jī)氮源組除胞外多糖含量比蛋白胨組高外，其他指標(biāo)均顯著降低，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中舍棄無機(jī)氮源。在有機(jī)氮源中，酵母浸粉組可收獲最高含量的胞外多糖、胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)三萜，分別為（2.20±0.03）g/L、（76.29±2.81）mg/g、（8.76± 0.40）mg/g；而酵母浸膏組可收獲最高含量的生物量和蟲草酸，分別為（10.83±0.47）g/L、（149.59±6.30）mg/g，均略高于酵母浸粉組的（10.25±0.32）g/L、（132.83± 5.88）mg/g，但胞外多糖、胞內(nèi)多糖和胞內(nèi)三萜卻顯著低于酵母浸粉組。因此，最佳氮源為酵母浸粉。

圖2 不同氮源對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響（±s，n＝3）Fig 2 Effects of different nitrogen sources on the mycelial growth and metabolites synthesis of O. xuefengensis（±s，n＝3）

3.3 不同維生素B對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響

維生素B參與了眾多次級代謝的調(diào)節(jié)，在藥用菌物的發(fā)酵培養(yǎng)基中常用作重要的生長因子[17]。本實(shí)驗(yàn)考察了維生素B1和復(fù)合維生素B對雪峰蟲草液態(tài)發(fā)酵過程中代謝的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與空白對照組比較，維生素B1組表現(xiàn)出顯著的菌絲生長促進(jìn)和代謝產(chǎn)物合成促進(jìn)效應(yīng)；而與維生素B1組比較，復(fù)合維生素B組僅在胞內(nèi)三萜方面有優(yōu)勢。因此，培養(yǎng)基中加入維生素B1可顯著促進(jìn)雪峰蟲草代謝產(chǎn)物的積累。

3.4 初始pH對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響

培養(yǎng)基初始pH對細(xì)胞的酶反應(yīng)速率和代謝途徑調(diào)控起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)分別考察了培養(yǎng)基初始pH為4、5、6、7、8、9時的雷峰蟲草代謝特征，結(jié)果見圖4。

圖4 不同初始pH對雪峰蟲草菌絲生長和代謝產(chǎn)物合成的影響（±s，n＝3）Fig 4 Effects of different initial pH on the mycelial growth and metabolites synthesis of O.xuefengensis（±s，n＝3）

由圖4可知，在pH為8時可收獲最高含量的生物量、胞內(nèi)多糖、蟲草酸，分別為（3.49±0.02）g/L、（32.10± 0.96）mg/g、（283.85±4.12）mg/g；而pH為7時可收獲最高含量的胞內(nèi)三萜（20.32±0.25）mg/g，略高于pH為8時的（19.16±0.12）mg/g；pH為5時胞外多糖含量最高為（1.06±0.02）g/L，但其他指標(biāo)嚴(yán)重降低。因此，選擇pH為8時可獲得最高的發(fā)酵效率。

4 討論

藥用菌物發(fā)酵技術(shù)的快速發(fā)展為實(shí)現(xiàn)其活性成分的生物合成提供了較好的思路，也是中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展過程中對菌物藥充分發(fā)掘的有效手段[9-11]。雪峰蟲草為湖湘特色民族藥物，已有500余年的應(yīng)用歷史，但隨著地方特色民族藥物資源的快速開發(fā)，雪峰蟲草的野生資源被快速消耗。因此，嘗試以液態(tài)發(fā)酵技術(shù)對其菌絲體進(jìn)行培養(yǎng)，并通過培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件控制來實(shí)現(xiàn)活性物質(zhì)的高效合成，將為雪峰蟲草資源的綜合開發(fā)提供必要的技術(shù)支持。

本研究以雪峰蟲草菌為出發(fā)菌株，從碳源、氮源、維生素B、培養(yǎng)基初始pH方面對其菌絲生長和胞外多糖、胞內(nèi)多糖、蟲草酸、胞內(nèi)三萜的積累水平進(jìn)行了綜合分析，結(jié)果顯示在碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、添加0.1 g/L維生素B1和初始pH為8時可得到較高的生物量和代謝產(chǎn)物積累水平，說明可通過發(fā)酵過程優(yōu)化控制，實(shí)現(xiàn)該菌株細(xì)胞生長和活性代謝產(chǎn)物合成的優(yōu)化。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)還可看出，不同代謝產(chǎn)物對不同的營養(yǎng)因子或發(fā)酵條件有不同的響應(yīng)，且菌株細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成往往對營養(yǎng)因子和培養(yǎng)條件也有不同的需求。因此，若以開發(fā)雪峰蟲草野生資源的替代品為目標(biāo)，須重視多種活性成分合成的協(xié)同調(diào)控。今后本課題組將圍繞培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件多因子的綜合調(diào)控及其過程放大進(jìn)行深入研究。

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Primary Study on the Synthesis of Active Ingredients of Ophiocordyceps xuefengensis by Submerged Fermentation Method

LIU Sha1，2，ZHANG Xiaojuan1，2，WANG Wei1，3，CHEN Lin1，2，LIAO Yan1，2，LU Yaobang1，2，TANG Yinghong1，2，CUI Peiwu1，2（1.College of Pharmacy，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.TCM Potency&Efficacy Laboratory，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China；3.TCM and Ethnomedicine Innovation&Development Laboratory，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China）

OBJECTIVE：To explore basic technology for synthesis of active ingredients of Ophiocordyceps xuefengensis，and provide necessary technical support for comprehensive development of O.xuefengensis sourse.METHODS：Submerged fermentation method was used to cultivate the mycelium，achieving efficient synthesis of active ingredients by controlling medium composition and cultivation conditions.Using the bacteria as starting strain，the effects of different carbon sources（sucrose，glucose and soluble starch），different nitrogen sources（peptone，yeast extract powder，yeast extract，sodium nitrate，potassium nitrate and urea），different vitamin B（vitamin B1and vitamin B complex）and different initial pH（pH was set at 4，5，6，7，8 and 9，respectively）on mycelial growth，extracellular and intracellular polysaccharide synthesis，cordycepin synthesis and intracellular triterpenoid synthesis were investigated to screen the optimal medium composition.RESULTS：The optimal carbon source，nitrogen source，vitamin B and initial pH were sucrose，yeast extract powder，vitamin B1and 8，respectively.High biomass and metabolite accumulation levels can be obtained when carbon source was sucrose，nitrogen source was yeast extract powder，adding 0.1 g/L vitamin B1with initial pH of 8.CONCLUSIONS：O.xuefengensis can efficiently accumulate metabolites，and achieve the optimization of strain cell growth and synthesis of active metabolite by optimizing and controlling the fermentation process.

Ophiocordyceps xuefengensis；Active ingredient；Submerged fermentation；Biosynthesis

R965.2

A

1001-0408（2017）22-3079-05

2016-11-07

2017-02-08）

（編輯：余慶華）

湖南省科技重大專項(xiàng)子項(xiàng)目（No.2014FJ1007）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)“十二五”校級重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目（No.校行科字〔2012〕2號）

＊碩士研究生。研究方向：藥用菌物活性成分挖掘及其生物合成研究。電話：0731-88458225。E-mail：1099570752@qq.com

#通信作者：講師，博士研究生。研究方向：藥用菌物活性物質(zhì)基礎(chǔ)及其代謝工程研究。電話：0731-88458225。E-mail：cuipeiwu@126. com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.22.15