羅玥，成桂紅，鐘紅霞，王健，徐躍成

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川成都610100）

氣相色譜直接進(jìn)樣法與頂空進(jìn)樣法測(cè)定白酒中甲醇的比較

羅玥，成桂紅，鐘紅霞，王健，徐躍成

（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川成都610100）

該實(shí)驗(yàn)對(duì)氣相色譜直接進(jìn)樣法與頂空進(jìn)樣法測(cè)定白酒中甲醇的方法進(jìn)行比較。直接進(jìn)樣法測(cè)定按GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的方法分析》進(jìn)行，并對(duì)色譜條件進(jìn)行了改進(jìn)及優(yōu)化；頂空進(jìn)樣法測(cè)定時(shí)，對(duì)取樣量、加熱溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳色譜條件。兩種方法的線性范圍為0.032～1.288 g/L，線性相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。直接進(jìn)樣法的檢出限為0.04 g/L，加標(biāo)回收率為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜1%，方法不確定度結(jié)果為（0.166±0.012）g/L；頂空進(jìn)樣法的檢出限為0.02 g/L，加標(biāo)回收率范圍為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜3%，方法不確定度結(jié)果為（0.160±0.012）g/L。以兩種方法測(cè)定市售20種白酒樣品，測(cè)定結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，無顯著性差異（P＞0.05）。直接進(jìn)樣法無前處理過程，簡(jiǎn)單快速精密度高；頂空進(jìn)樣法檢出限更低，靈敏度更高。

氣相色譜直接進(jìn)樣；頂空進(jìn)樣；甲醇；白酒

甲醇是一種無色透明、易揮發(fā)性液體，在人體內(nèi)代謝產(chǎn)物為甲醛、甲酸，有很強(qiáng)的毒性，尤其對(duì)視神經(jīng)損害嚴(yán)重，誤飲過量的甲醇會(huì)引起失明或中毒死亡[1-5]。白酒是以糧谷、薯類、水果、乳類等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒，白酒中少量的甲醇可構(gòu)成白酒不同的風(fēng)格，過量則有害健康。目前，甲醇的檢測(cè)方法有比色法、滴定法、生物傳感器法、液相色譜法、氣相色譜法，氣相色譜法是世界上公認(rèn)的測(cè)定酒中甲醇的方法[6]。GB/T 5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的方法分析》中甲醇的測(cè)定方法有比色法和氣相色譜直接進(jìn)樣法[7]，比色法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)[8]，氣相色譜法采用填充柱恒溫進(jìn)樣，對(duì)成分復(fù)雜的白酒分離效果差[9]。本實(shí)驗(yàn)擬選用毛細(xì)色譜柱對(duì)氣相色譜直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法分別進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，用最佳色譜條件分別進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，目的是便于選擇白酒中甲醇含量測(cè)定的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇（色譜純）：天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；甲醇色譜標(biāo)樣（純度為99.5%）：天津市化學(xué)試劑研究所；超純水（電導(dǎo)率為18.2MΩ）：M illi-Q超純水機(jī)制備；20種白酒（編號(hào)為1#～20#）：市售。

取色譜純乙醇用超純水配制成體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，用作溶劑及試劑空白；標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：取1m L甲醇色譜標(biāo)樣稱質(zhì)量為0.805 0 g，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至50m L，得16.1 g/L甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，備用。標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制：分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.02m L、0.05m L、0.10m L、0.20m L、0.40m L、0.80m L于10m L容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至10m L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜儀（gas chromatography，GC）配氫火焰檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）及OpenLAB工作站、7697A頂空（Headspace，HS）自動(dòng)進(jìn)樣器、HP-INNOWAX毛細(xì)色譜柱（30m×0.32mm×0.50μm）、HP-INNOWAX毛細(xì)色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）、CP-WAX57CB色譜柱（50m×0.25mm×0.20μm）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；2010plus氣相色譜儀配氫火焰檢測(cè)器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）及GCsolution工作站：日本島津公司；M illi-Q超純水機(jī)：密理博中國(guó)有限公司；XS105電子天平：瑞士METTLERTOLEDO集團(tuán)；吉爾森移液器（100～5000μL）：法國(guó)GILSON公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

（1）直接進(jìn)樣法

AgilentCP-wax57CB色譜柱；程序升溫：30℃保持8m in，以2℃/m in升至70℃，保持1min，再以50℃/min升至190℃，保持4m in；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測(cè)器溫度：280℃；分流比：50∶1；柱流速：0.80m L/min；定量方法：外標(biāo)法；進(jìn)樣體積：0.5μL。

（2）頂空進(jìn)樣法

AgilentHP-INNOWAX色譜柱；程序升溫：40℃保持8m in，以5℃/m in升至100℃，不保持，再以40℃/m in升至180℃，保持4min；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測(cè)器溫度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；定量方法：外標(biāo)法；進(jìn)樣體積：1m L；頂空自動(dòng)進(jìn)樣器條件：加熱箱90℃，定量環(huán)100℃，傳輸線110℃，樣品瓶平衡時(shí)間20m in，進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間：0.5min，進(jìn)樣循環(huán)36min。

1.3.2 測(cè)定步驟

直接進(jìn)樣法取混勻的標(biāo)準(zhǔn)使用液及酒樣約1m L于進(jìn)樣小瓶，待測(cè)；頂空進(jìn)樣法準(zhǔn)確取混勻的標(biāo)準(zhǔn)使用液及酒樣各2m L于20m L頂空瓶中，壓緊瓶蓋，待測(cè)。待儀器工作正常且穩(wěn)定后，依次對(duì)標(biāo)準(zhǔn)使用液各濃度梯度、空白、加標(biāo)回收、樣液進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接進(jìn)樣法色譜條件優(yōu)化

甲醇沸點(diǎn)為64.7℃[10]，選擇氣化溫度80℃、90℃、100℃、120℃、150℃、200℃、220℃，程序升溫條件：40℃保持5m in，以5℃/min速率升至200℃，保持1min，檢測(cè)器：280℃，分流比：40∶1，進(jìn)樣體積：0.5μL，在此條件下對(duì)甲醇標(biāo)品定性并比較峰面積，結(jié)果表明，氣化溫度不低于150℃時(shí)，甲醇峰峰面積趨于穩(wěn)定且峰形好，因此選擇150℃作為進(jìn)樣口溫度。但是對(duì)于成分比較復(fù)雜的白酒樣品時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)甲醇峰和其他峰包裹的現(xiàn)象，繼續(xù)做了如下優(yōu)化：選擇進(jìn)樣口溫度220℃，檢測(cè)器280℃條件不變情況下，分別對(duì)初始柱溫保持時(shí)間、初始柱溫、初始柱溫保持時(shí)間、柱流速、程序升溫速率、分流比、進(jìn)樣量進(jìn)行一系列優(yōu)化試驗(yàn)[11-13]，確定直接進(jìn)樣法測(cè)白酒中甲醇的色譜條件為：進(jìn)樣體積0.5μL，進(jìn)樣口溫度220℃，柱流速0.8m L/m in，分流比50∶1，程序升溫30℃保持8m in，以2℃/min升至70℃，保持1m in，再以50℃/m in升至190℃，保持4m in。此條件下甲醇峰峰形好，白酒樣品中甲醇峰的分離度為1.268，直接進(jìn)樣法甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖及白酒樣品色譜圖見圖1。

圖1 直接進(jìn)樣法甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及白酒樣品（B）色譜圖Fig.1 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by direct injection

2.2 頂空進(jìn)樣法色譜條件優(yōu)化

2.2.1 HP-INNOWAX毛細(xì)色譜柱優(yōu)化

HP-INNOWAX色譜柱的最低使用溫度為40℃，初始溫度40℃不變的情況下，對(duì)初始溫度保持時(shí)間、柱流速、程序升溫速率、分流比、進(jìn)樣量參照直接進(jìn)樣法進(jìn)行優(yōu)化，甲醇峰不能得到理想的優(yōu)化條件，于是考慮換用HP-INNOWAX色譜柱，在上述優(yōu)化條件下繼續(xù)優(yōu)化，得到頂空進(jìn)樣的最佳色譜條件：程序升溫為40℃保持8min，以5℃/min升至100℃，不保持，再以40℃/min升至180℃，保持4min；進(jìn)樣口溫度：220℃；檢測(cè)器溫度：250℃；分流比：60∶1；柱流速：1m L/m in；頂空自動(dòng)進(jìn)樣器條件：加熱箱90℃，定量環(huán)100℃，傳輸線110℃，樣品瓶平衡時(shí)間20m in，進(jìn)樣持續(xù)時(shí)間0.5m in，進(jìn)樣循環(huán)36m in。

2.2.2 樣品瓶加熱溫度及取樣量?jī)?yōu)化

因?yàn)榧状挤悬c(diǎn)為64.7℃，樣品瓶加熱溫度分別設(shè)為60℃、70℃、80℃、90℃、100℃進(jìn)行試驗(yàn)，60℃、70℃響應(yīng)值較小，100℃有拖尾峰，因此確定90℃為最佳樣品瓶加熱溫度。樣品瓶中分別取1m L、2m L、3m L、4m L、5m L進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，進(jìn)樣量不低于2m L時(shí)甲醇峰峰面積幾乎無變化，確定標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品取樣量為2m L。在此優(yōu)化條件下，測(cè)得白酒樣品中甲醇峰分離度為2.82，頂空進(jìn)樣法甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖及白酒樣品色譜圖見圖2。

圖2 頂空進(jìn)樣法甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液（A）及白酒樣品（B）色譜圖Fig.2 Chromatogram ofm ethanolstandard so lution(A)and Baijiu sample(B)by headspace injection method

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限的比較

分別用兩種方法測(cè)定配制的甲醇標(biāo)準(zhǔn)使用液系列濃度，兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限結(jié)果見表1。

表1 直接進(jìn)樣法與頂空進(jìn)樣法的線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear range,correlation coefficient and detection lim it of direct injection m ethod and headspace injection method

由表1可知，兩種方法得到線性范圍0.0322～1.288g/L，以甲醇含量（X，g/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)的甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)R均0.999。表明兩種方法均有良好的線性關(guān)系，優(yōu)化后的直接進(jìn)樣法檢出限（0.04g/L）高于頂空進(jìn)樣法檢出限（0.02 g/L）。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取16.1 g/L甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.25m L用陰性樣品定容至25m L，混勻后分別用兩種方法進(jìn)行精密度考察（平行實(shí)驗(yàn)6次），結(jié)果見表2。

表2 直接進(jìn)樣法與頂空進(jìn)樣法的精密度比較Tab le 2 Com parison of precision of direct in jection m ethod and headspace injection method

由表2可知，直接進(jìn)樣法相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relativestandard deviation，RSD）＜1%，頂空進(jìn)樣法RSD＜3%，頂空進(jìn)樣法更接近真值，精密度符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》的技術(shù)要求[14]。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

選擇加標(biāo)質(zhì)量濃度0.048 g/L、0.161 g/L、0.483 g/L三個(gè)不同質(zhì)量濃度水平對(duì)3個(gè)不同酒樣進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，考察兩種方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3。

表3 兩種方法加標(biāo)回收率結(jié)果Tab le 3 Adding standard recovery results of two methods

由表3可知，兩種方法的加標(biāo)回收率為90%～110%，表明兩種方法準(zhǔn)確度較好。

2.6 樣品測(cè)定

取20種市售白酒分別用兩種方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 兩種方法測(cè)定20種白酒中甲醇結(jié)果比較Table 4 Comparison of the results of the methanol content determ ination by two m ethods

由表4可知，兩種方法測(cè)定結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，t=1.068，兩種方法測(cè)定白酒中甲醇無顯著性差異[15]（P＞0.05）。

2.7 不確定度比較

按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法計(jì)算白酒試樣中甲醇含量，計(jì)算公式如下：

式中：X為白酒中甲醇含量，按100%酒精度折算，g/L；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出進(jìn)樣液中甲醇含量，g/L；B為實(shí)測(cè)酒精度，%vol；100為按100%酒精度換算[16]。

通過計(jì)算公式建立數(shù)學(xué)模型，不確定度評(píng)定步驟如下：①根據(jù)6次平行測(cè)定結(jié)果計(jì)算A類相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度②B類不確定度由甲醇色譜標(biāo)樣、實(shí)測(cè)酒精度、儀器引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度[17-19]。通過合成計(jì)算得到不確定度結(jié)果見表5。

表5 兩種方法的不確定度結(jié)果Table 5 Uncertainty rep resentation results o f two m ethods

由表5可知，直接進(jìn)樣法的方法不確定度結(jié)果為（0.166±0.012）g/L；頂空進(jìn)樣法的方法不確定度結(jié)果為（0.160±0.012）g/L。

2.8 再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同時(shí)間不同人員進(jìn)行再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)，選擇0.03 g/L、0.09 g/L兩個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行6次加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表6。

表6 再現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of reproducibility experiments

由表6可知，精密度和回收率范圍均能滿足GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中的技術(shù)要求，說明兩種方法再現(xiàn)性好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過氣相色譜直接進(jìn)樣法和頂空進(jìn)樣法分別從條件優(yōu)化到方法學(xué)驗(yàn)證比較，結(jié)果表明，兩種方法各項(xiàng)指標(biāo)都能滿足實(shí)驗(yàn)室要求。兩種方法的線性范圍為0.032 2～1.288 0 g/L，線性相關(guān)系數(shù)R均＞0.999。直接進(jìn)樣法的檢出限為0.04 g/L，加標(biāo)回收率為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜1%，方法不確定度結(jié)果為（0.166±0.012）g/L；頂空進(jìn)樣法的檢出限為0.02 g/L，加標(biāo)回收率范圍為90%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜3%，方法不確定度結(jié)果為（0.160±0.012）g/L。以兩種方法測(cè)定市售20種白酒樣品，測(cè)定結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，無顯著性差異（P＞0.05）。直接進(jìn)樣法無前處理過程，簡(jiǎn)單快速精密度高；頂空進(jìn)樣法檢出限更低，靈敏度更高。兩種方法各有優(yōu)點(diǎn)，可靈活運(yùn)用于白酒中甲醇含量的測(cè)定。

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Comparison of direct injection and headspace injectionmethod in determ ination ofmethanol in Baijiu

LUO Yue,CHENGGuihong,ZHONG Hongxia,WANG Jian,XU Yuecheng
(Sichuan Institute ofProductQuality Supervision&Inspection,Chengdu 610100,China)

Themethanol determinationmethod in Baijiu was compared between the direct injectionmethod and headspace injectionmethod.The direct injectionmethod was conducted according to GB/T 5009.48—2003 by directsampling,and the chromatographic conditionswere improved and optimized.When thesamplesweremeasured bymethanolheadspacemethod,the sample volume,heating temperaturewasoptim ized and theoptimal chromatographic condition wasestablished.The linearity of twomethods ranged from 0.032 g/L to 1.288 g/L.The detection lim itof direct injection method was0.04 g/L,the adding standard recovery rate rangewas90%-110%,relative standard deviation(RSD)＜1%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.166±0.012)g/L.The detection limitof headspacemethod was0.02 g/L,theadding standard recovery rate rangewas90%-110%, RSD＜3%,and the resultsuncertainty of themethod was(0.160±0.012)g/L.Twomethodswere used to determine the 20 kindsof Baijiu samples,the resultswere analyzed by paired t test,and therewasno significantdifference(P＞0.05).The direct injectionmethod had no pretreatmentprocess,it wassimple and rapid w ith high precision,low sensitivity.The detection lim itofheadspacemethod was lower,and the sensitivitywashigher.

gas chromatography directinjection;headspace injection;methanol;Baijiu

O657.7

0254-5071（2017）08-0161-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.08.035

2017-02-27

羅玥（1986-），女，工程師，本科，主要從事食品檢驗(yàn)方面的工作