王鎣燕, 盧圣鄂, 李躍飛, 涂仕華, 張小平, 辜運富

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石灰性紫色水稻土不同土壤深度中厭氧氨氧化細菌對施肥的響應

王鎣燕1, 盧圣鄂1, 李躍飛1, 涂仕華2, 張小平1, 辜運富1

（1四川農(nóng)業(yè)大學資源學院微生物系，成都611130；2四川省農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，成都610066）

【目的】研究長期不同施肥處理對水稻土厭氧氨氧化細菌（anaerobic ammonium oxidation bacteria, AAOB）群落結(jié)構(gòu)和垂直分布特征的影響，深入認識不同施肥處理下石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化作用的微生物調(diào)控機制，為該地區(qū)科學施肥、培肥地力提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷没瘜W分析、末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）和熒光定量PCR技術分別對不同施肥處理下石灰性紫色水稻土理化性質(zhì)、厭氧氨氧化細菌豐度及群落結(jié)構(gòu)進行分析?！窘Y(jié)果】理化性質(zhì)結(jié)果顯示，相對于無肥處理（CK），氮（N）、氮磷鉀肥（NPK）及氮磷鉀配施農(nóng)家肥（NPKM）均會降低土壤pH和硝態(tài)氮含量，而增加土壤有機質(zhì)、全氮和銨態(tài)氮含量。隨土壤深度增加，土壤pH增加，全氮和硝態(tài)氮含量降低，銨態(tài)氮含量變化趨勢不明顯。qPCR結(jié)果顯示，就土壤層次而言，厭氧氨氧化細菌在0—20 cm層的豐度最高，20—40 cm層最低；就施肥處理而言，氮肥（N）對厭氧氨氧化細菌的豐度促進最為明顯。T-RFLP結(jié)果表明，厭氧氨氧化細菌在0—20 cm土層群落組成最為豐富，Shannon-wiener多樣性指數(shù)最高；寡氮肥下其群落組成最為簡單，無肥處理下群落結(jié)構(gòu)最為復雜。厭氧氨氧化細菌優(yōu)勢種群屬于。冗余梯度分析（RDA）顯示，pH影響是石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要環(huán)境因子?！窘Y(jié)論】本研究顯示寡氮處理會降低石灰性紫色水稻土中厭氧氨氧化細菌的多樣性但促進其豐度。表層土（0—20 cm）是厭氧氨氧化細菌分布的主要層次。

長期定位施肥；石灰性紫色水稻土；T-RFLP；厭氧氨氧化細菌

0 引言

【研究意義】長久以來，反硝化作用被認為是土壤環(huán)境中氮素損失的唯一途徑，但厭氧氨氧化作用的發(fā)現(xiàn)打破了這一定律[1]。厭氧氨氧化（anaerobic ammonium oxidation, anammox）是在厭氧條件下，以NH4+為電子供體，NO2?為電子受體，產(chǎn)物為氮氣的生物反應，即NH4++ NO2?=N2+2H2O[2]。已有研究證實，海洋生態(tài)系統(tǒng)中氮素以厭氧氨氧化途徑的流失量占總量67%[3]。而這一過程的執(zhí)行者厭氧氨氧化菌（anaerobic ammonium oxidation bacteria, AAOB）是化能自養(yǎng)型細菌，以CO2或HCO3-為碳源，并從NH4+和NO2?的生物反應中獲得能量。研究發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌屬于浮霉狀菌目（）[4]，而已知的厭氧氨氧化細菌僅有5個屬：[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，10個種[10]，其中大部分從污水處理廠[11]、實驗室反應器[12]還有海洋和淡水環(huán)境[10,13]中分離得到。水稻土是一類重要的人工濕地生態(tài)系統(tǒng)，受人類水肥管理措施影響明顯。近年來隨著水稻產(chǎn)量的提高，氮肥的施用量也逐漸提高，氮肥通過各種途徑特別是厭氧脫氮途徑的損失量也在增加[14]。【前人研究進展】關于厭氧氨氧化細菌分布的研究，前期主要集中于海洋和人工水體系統(tǒng)，而陸地生態(tài)系統(tǒng)中厭氧氨氧化細菌的分布特征研究較少，尤其是農(nóng)田土壤。近期研究表明：厭氧氨氧化細菌廣泛存在于含氮低氧的農(nóng)業(yè)土壤中。SHEN等[15]發(fā)現(xiàn)在干燥農(nóng)田土壤中主要厭氧氨氧化細菌為，其多樣性、群落結(jié)構(gòu)和豐度均受土壤有機質(zhì)顯著影響。而蔬菜地里主要的厭氧氨氧化細菌種屬為：，，以及，它們的活性和豐度受土壤銨態(tài)氮濃度制約[16]。同時，不少研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)施肥處理后的水稻土中厭氧氨氧化細菌的群落結(jié)構(gòu)與其活性有明顯相關性[14,17-19]，而其活性的變化使得所占釋放氮氣的比例發(fā)生相應變化（4%—37%）[14]。上述研究主要集中于表層（0—20 cm）土壤，而關于厭氧氨氧化細菌在水稻土中的垂直分布特征卻鮮有報道?！颈狙芯壳腥朦c】石灰性紫色水稻土是四川乃至全國廣泛分布的一種重要農(nóng)業(yè)土壤，面積約為4.00×106hm2。該類土壤不僅土質(zhì)疏松，有機質(zhì)、氮、磷含量都相對較低，且其土層薄，保水抗旱能力差。為保護石灰性紫色水稻土，規(guī)范施肥管理措施，四川省于20世紀80年代在四川遂寧市船山區(qū)建立了稻麥輪作下的“NPK長期定位施肥試驗”。前期研究主要表明長期定位施肥會對該類土壤的理化性質(zhì)、作物產(chǎn)量、微生物學活性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯影響[20-23]。但長期不同施肥處理下石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)的垂直分布特征尚無研究報道?！緮M解決的關鍵問題】本文分析了石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)對長期不同施肥處理的響應特征和垂直分布特點。以期認識不同施肥處理下石灰性紫色水稻土厭氧氨氧化細菌的微生物驅(qū)動機制，為保護石灰性紫色水稻土質(zhì)量提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

長期定位試驗點位于四川遂寧市船山區(qū)聯(lián)盟鄉(xiāng)二村五組（30°10'50''N，105°03'26''E），亞熱帶濕潤季風氣候，年均降水992mm，年均溫18.2℃。土壤為原生鈣質(zhì)紫色土屬，遂寧組母質(zhì)，二泥田土種。試驗始于1982年，完全隨機區(qū)組設計，采用4個施肥處理：（1）不施肥（CK）；（2）氮肥（N）；（3）氮磷鉀肥（NPK）；（4）氮磷鉀肥+農(nóng)家肥（NPKM）。農(nóng)家肥：主成分為豬廄肥，有機質(zhì)含量1.5 mg·kg-1，氮素含量0.55%。各處理每種肥料施用量為：氮肥（尿素：CO(NH2)2）：55.2 kg·hm-2，2/3用做基肥，1/3在水稻分蘗后期追肥；鉀肥（KCl）：31.5 kg·hm-2；磷肥（P2O5）：13.2 kg·hm-2；農(nóng)家肥：3×104kg·hm-2。等氮量設計，3次重復，隨機區(qū)組排列，共12個小區(qū)，每小區(qū)面積13.2 m2。小區(qū)間用水泥板隔開，重復間留排水溝。采用小麥/水稻輪作，按當?shù)爻Ｒ?guī)方法進行水稻栽培的田間管理。初始土壤的養(yǎng)分情況為：pH 8.6、有機質(zhì)15.9 g·kg-1、全氮1.09 g·kg-1、堿解氮66.3 mg·kg-1、全鉀26.9 g·kg-1、有效鉀130.6 mg·kg-1、緩效鉀699.4 mg·kg-1、全磷1.35 g·kg-1、有效磷3.9 mg·kg-1。

1.2 土樣采集與預處理

對水稻田進行長期灌水處理（土面覆蓋約2—5 cm水層），于2013年7月1日水稻分蘗期追肥后采集樣品。在樣方里按“梅花型”布點取樣，基于土壤發(fā)生層次，用土鉆（內(nèi)徑為5 cm）分別鉆取4個層次土樣（0—20 cm（L1）、20—40 cm（L2）、40—60 cm（L3）和60—90 cm（L4）），分層混勻，用無菌PET樹脂袋封裝放于冰盒中帶回實驗室。取混合均勻的新鮮土樣立即提取土壤總DNA，另取部分土樣于室溫下風干后進行土壤理化性質(zhì)測定，剩余土樣于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 土壤基本理化性質(zhì)測定

測定方法參照魯如坤土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法[24]。

1.4 土壤AAOB群落結(jié)構(gòu)的T-RFLP分析

1.4.1 土壤微生物總DNA提取 采用Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene, Carlsbad, CA，USA）的試劑盒方法。稱取0.5 g新鮮土壤樣品，重復3次，按試劑盒上的步驟進行土壤微生物總DNA的提取。

1.4.2 16S基因的PCR擴增 PCR過程采用Nested-PCR方法，首輪采用PCR 引物為：pla46f[25]和AMX1480r。反應體系：PCR Master Mix（TIANGEN BIOTECH. BEIJING）15mL，DNA模板5mL，引物各0.5 μL（10 pmol·μL-1），5mL土壤總DNA，加ddH2O至終體積30mL。反應程序：預變性94℃4 min，變性94℃30 s，退火55℃30s，延伸溫度72℃1 min，共進行30個循環(huán)，72℃10 min，最后于4℃恒溫保存。第二輪選取Amx368f*和Amx820r[12]。反應體系：PCR Master Mix 25mL，DNA模板1mL（以第一輪的PCR產(chǎn)物稀釋10倍），引物各0.5 μL（10 pmol·μL-1），加ddH2O至終體積50mL。反應程序與首輪程序相同。取PCR產(chǎn)物各2.0 μL，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，自動凝膠成像系統(tǒng)（Gel Doc Documentation System, Bio-Rad, USA）拍照檢測。

1.4.3 16S PCR產(chǎn)物酶切處理 采用限制性內(nèi)切酶（C^CGG）和（GT^AC）對純化后的PCR產(chǎn)物進行酶切[26]。反應體系：限制性內(nèi)切酶（10 U）1 μL，相應緩沖液1 μL，PCR產(chǎn)物7 μL，超純水補足至10 μL。反應條件：限制性內(nèi)切酶在37℃條件下酶切12 h，65℃失活20 min。送生工生物工程有限公司（上海）進行T-RFLP分析。

1.4.4 T-RFLP分析 選擇TRF 的原則一般是：峰高＞80[27]，相對誤差不超過10% 。T-RFLP圖譜中限制性片段（T-RF）范圍細菌在35—550 bp，熒光值超過100 RFU，在平行試驗的圖譜中重復再現(xiàn)的峰納入統(tǒng)計分析，并去除OTU豐度＜1% 的TRFs。T-RFLP 圖譜中每1個限制性片段（T-RF）為1個OTU，T-RFs 片段大小± 1 bp 被認為是同一個OTU。

1.5 Real-Time PCR測定AAOB的拷貝數(shù)

Real-Time PCR標準樣品的制作。選取l份質(zhì)量高的PCR產(chǎn)物，見1.4.2。采用DNA凝膠純化試劑盒純化擴增后的基因片段，將片斷連接在pGEM-T Easy載體中，然后轉(zhuǎn)化到.coli中，涂布到含有氨芐青霉素（Ampicillin）/IPTG/X-Gal的LB（Lufia-Beaani）培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)16—24 h。隨機挑選2—3個白斑克隆子測序。利用質(zhì)粒提取試劑盒提取克隆子的質(zhì)粒，測定其DNA濃度，并將其以10倍為間隔系列稀釋成實時熒光定量PCR測定標準品。

將樣品與標準品一起進行Real-Time PCR檢測，包括陰性對照在內(nèi)每個樣品設3個重復。引物為：Amx808f和Amx1040r[28]。反應體系：ABI Prower SybrGreen qPCR Master Mix （ABI, USA）10mL，DNA模板1mL，引物各0.5 μL（10 pmol·μL-1），加ddH2O至終體積20mL。反應程序：預變性95℃10 s，變性95℃30 s，退火60℃30 s，延伸溫度72℃30 s，共進行40個循環(huán)。每個循環(huán)中熒光收集在83℃下進行，以防止由于引物二聚體的存在所引起的誤差。溶解曲線程序為65—98℃，每0.2℃讀數(shù)，其間停留6 s。Real-TimePCR測定控制軟件ABI7500 Fast Real-Time PCR system。

1.6 數(shù)據(jù)分析

T-RFLP圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度用PCORD程序進行多樣性指數(shù)計算， 包括多樣性指數(shù)（Shannon diversity,）、均勻度指數(shù)（Shannon evenness,）還有豐富度指數(shù)（）。土壤理化性質(zhì)、T-RFLP測定結(jié)果均為3 次生物重復的平均值，誤差線均為標準誤。使用SPSS 20. 0軟件統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計描述、方差分析（one-way ANOVA）、Duncan檢驗和Pearson相關分析。采用CANOCO 4.5中的冗余法（Redundancy Analysis）分析AAOB群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同施肥處理對石灰性紫色水稻土理化性質(zhì)產(chǎn)生不同影響（表1）。就pH而言，與無肥（CK）（pH=7.57）比較，化肥處理（N和NPK）下的pH最低；土壤層次上，0—20 cm土層的pH最低。就土壤有機質(zhì)（SOM）而言，無機肥處理下的SOM含量為9.6—38.5 g·kg-1，而NPKM處理為14.4—32.8 g·kg-1；土壤層次上，0—20 cm土層含量最高，而20—40 cm層最低。就全氮（TN）而言，各施肥處理間差異??；土壤層次上的變化與SOM相同。就硝態(tài)氮而言，NPKM處理降低土壤硝態(tài)氮含量。就銨態(tài)氮而言，NPK處理下各土層含量均最低，而N處理下最高。

2.2 qPCR數(shù)據(jù)分析

不同土壤深度AAOB的16S rRNA基因拷貝數(shù)方差分析結(jié)果如圖1所示。L1層土壤是AAOB的主要分布區(qū)域，拷貝數(shù)最高。而L2層，拷貝數(shù)最低。在各個土壤層次中，NPKM和無機肥處理（N, NPK）的AAOB拷貝數(shù)基本大于CK。長期不同施肥處理間土壤的厭氧氨氧化菌的豐度存在顯著差異。在所有土壤層次中，N施肥處理的AAOB的16S rRNA拷貝數(shù)均最高。而無肥處理下，AAOB的16S rRNA拷貝數(shù)均最低。運用SPSS進行AAOB的16S rRNA拷貝數(shù)與環(huán)境參數(shù)間相關性分析表明，AAOB的16S rRNA基因拷貝數(shù)與銨態(tài)氮顯著正相關（= 0.78，＜0.05）。

表1 不同施肥處理下各土壤層次的土壤理化性質(zhì)

SOM：土壤有機質(zhì)；TN：全氮；CK為對照；N為氮肥處理；NPK為氮磷鉀肥配合處理；NPKM為氮磷鉀肥+農(nóng)家肥處理。每列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在＜0.05水平下差異顯著；L1：0—20 cm，L2：20—40 cm，L3：40—60 cm，L4：60—90 cm土層。下同

SOM：soil organic matter; TN: Total nitrogen; CK: Control treatment；N: nitrogen treatment；NPK: nitrogen; phosphorus and potassium treatment; NPKM: nitrogen; phosphorus and potassium+ manure treatment. Different letters within a column indicate significant difference between values at＜0.05；L1：0—20 cm，L2：20—40 cm，L3：40—60 cm，L4：60—90 cm. The same as below

圖中的小寫字母表示相同土壤層次內(nèi)各施肥處理間拷貝數(shù)在P＜0.05下顯著差異；大寫字母表示不同層次間拷貝數(shù)在P＜0.05下顯著差異；每個值代表平均值±標準誤（n=3）

2.3 AAOB細菌群落結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)分析

2.3.1 多樣性指數(shù)分析 以T-RFLP圖譜為基礎，各施肥處理下不同土壤層次中厭氧氨氧化細菌的多樣性指數(shù)、豐富度及均勻度，見表2。

不同施肥處理下AAOB的16S rRNA基因Shannon-wiener多樣性指數(shù)在L1和L2層存在顯著差異（＜0.05），L3和L4差異不明顯（表2）。無肥和無機肥處理的AAOB群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)大于NPKM處理。豐富度和均勻度在L1、L2和L3間存在顯著差異（＜0.05）。在L1層，不同施肥處理下AAOB群落結(jié)構(gòu)多樣性變化明顯，CK多樣性指數(shù)最高，N處理最低。L2層多樣性指數(shù)是4個層次中最低的，N處理下多樣性指數(shù)最高，NPKM處理最低；在L3層，NPK處理AAOB多樣性指數(shù)最高，NPKM處理下最低；在L4層，CK處理下AAOB多樣性指數(shù)最高，NPKM處理下最低。

2.3.2 T-RFLP數(shù)據(jù)分析 采用T-RFLP技術對厭氧氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)分析如圖2所示。采用和酶切得到13種T-RF片段，取其中9個優(yōu)勢片段進行分析。就土壤層次而言，L3層片段種類數(shù)最少，其他層次片段數(shù)相當。就施肥處理而言，N處理下AAOB群落結(jié)構(gòu)最為簡單。133 bp和72 bp片段在L1層的CK、NPK和NPKM處理下的AAOB群落結(jié)構(gòu)中占主導地位，但在其他層次中這兩個片段的優(yōu)勢地位被125 bp片段代替。厭氧氨氧化菌浮霉菌目被劃分為5個屬：、、、、。其對應理論末端片段長度分別為125、291、351、476、91 bp。本試驗中Brocadia屬在土壤厭氧氨氧化菌中占主要地位，125 bp占總片段的63.3%—97.2%。屬在幾乎只在L2、L3、L4土層中存在。

圖2 不同施肥處理下不同土壤層次的AAOB群落組成

表2 不同施肥處理下AAOB的Shannon多樣性指數(shù)（H），均勻度（EH）和豐富度（S）

2.4 RDA數(shù)據(jù)分析

運用RDA分析進行AAOB群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境參數(shù)的相關性分析（圖3）。冗余分析圖中箭頭表示環(huán)境因子，箭頭所處的象限表示環(huán)境因子與排序軸間的正負相關性，箭頭連線長度表示該環(huán)境因子與樣本分布相關程度的大小，箭頭連線間的夾角代表環(huán)境因子間的相關程度。分析結(jié)果顯示：第一排序軸的特征值為0.742，第二排序軸特征值為0.012。由圖可知，第一排序軸與pH關系最為密切，均達到極顯著水平（＜0.01）。與全氮、硝態(tài)氮較為密切，均達到顯著水平（＜0.05）?？傮w而言，本試驗中pH對AAOB群落結(jié)構(gòu)的影響最顯著（＜0.05，蒙特卡羅算法）。此外，L1層的AAOB群落結(jié)構(gòu)與其他層次存在明顯的差異，而L2、L3和L4層的AAOB群落結(jié)構(gòu)較相似。

3 討論

3.1 不同施肥處理對AAOB群落結(jié)構(gòu)及豐度的影響

與短期施肥相比，長期定位施肥在改善土壤理化性質(zhì)、肥力[29]和保證農(nóng)作產(chǎn)量[30]上有明顯的優(yōu)勢。除此之外，與灌溉管理和季節(jié)變化相比，施肥對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的改變更加深刻[31-32]。厭氧氨氧化是新近發(fā)現(xiàn)的一條與反硝化匹配的厭氧脫氮途徑，由厭氧氨氧化細菌所介導調(diào)控。施肥會對AAOB群落結(jié)構(gòu)形成明顯影響并進而改變土壤厭氧氨氧化作用強度及土壤氮素流失量[14]。本文qPCR結(jié)果顯示，施氮處理（N處理）下AAOB的16S rRNA基因的拷貝數(shù)高于其他施肥處理。雖不同施肥處理對AAOB的豐度均有促進作用，但施氮處理最為明顯。與本文不同，前人亦有研究發(fā)現(xiàn)，無機肥配施農(nóng)家肥對AAOB豐度的促進作用更明顯[33]。產(chǎn)生上述差異的原因可能是：影響AAOB豐度的主要環(huán)境因子不同，HUI等[33]發(fā)現(xiàn)影響AAOB豐度的主要環(huán)境因子是pH，本文是銨態(tài)氮。T-RFLP分析和Shannon-wiener多樣性分析均顯示，AAOB群落結(jié)構(gòu)施肥氮處理（N處理）下最為簡單，而無肥處理下其最為復雜。在為數(shù)不多的研究不同施肥制度對土壤中AAOB群落結(jié)構(gòu)的報道中發(fā)現(xiàn)，施肥處理能夠促進其多樣性[34-35]。然而，筆者研究顯示施肥處理一定程度上都降低了AAOB的群落結(jié)構(gòu)多樣性，施氮肥處理最明顯。因此推測產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因是不同施肥處理使得表層土中優(yōu)勢AAOB群落種群減少，而隨著土壤深度增加，施肥效力減弱。深層土壤中出現(xiàn)新的優(yōu)勢AAOB種群。但是表層土中減少的優(yōu)勢種群多，而深層增加的少。綜上所述，就可得到AAOB群落多樣性減少的原因。而本文2.3.2中優(yōu)勢T-RFs片段的變化也能支持以上推論。

SOM：有機質(zhì)；TN：全氮；AK：有效鉀；AP：有效磷；Nitrate：硝態(tài)氮；Ammonium：銨態(tài)氮。CK為對照；N為氮肥處理；NPK為氮磷鉀肥配合處理；NPKM為氮磷鉀肥+農(nóng)家肥處理

3.2 AAOB群落結(jié)構(gòu)及豐度在不同土壤層次上的分布

近幾年AAOB研究表明，隨著土壤層次的變化其群落結(jié)構(gòu)和豐度都會隨之發(fā)生改變。本文qPCR結(jié)果顯示：AAOB豐度最高的層次是L1層土壤，最低為L2層土壤。Shen等[18]在淹水稻田里研究AAOB的群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：0—10 cm表層土中，AAOB的豐度最高；而第二層土壤（30 cm）的豐度最低。此外，ZHU等[36]研究也發(fā)現(xiàn)白洋淀水稻土0—20 cm深度的AAOB豐度高于20—30 cm土壤層次。以上結(jié)果均與本文的結(jié)果相似。但也有相反的結(jié)果，如BAI等[37]研究表明，深層水稻土更適宜AAOB生存和發(fā)揮功能，在表層水稻土中罕見。造成以上迥異結(jié)果的原因可能是：雖然表層水稻土溶解O2可能抑制了AAOB，但表層豐富有機質(zhì)腐熟極有可能導致表層缺氧，而水稻根系處于L2層，其分泌的O2亦有可能抑制AAOB。根據(jù)T-RFLP結(jié)果顯示，133 bp和72 bp片段在L1層AAOB群落結(jié)構(gòu)中占主導地位，但隨著土壤層次增加這兩個片段的優(yōu)勢地位被125 bp片段代替，且125 bp所對應的是厭氧氨氧化細菌的。已有研究顯示，厭氧氨氧化細菌的屬廣泛存在于水稻土的深層土壤[18,36]。此外，隨著土壤層次增加，351 bp片段在AAOB群落中所占比例逐漸增加。其所對應的屬厭氧氨氧化細菌主要存在于淡水湖泊底泥和海水深層[38-39]，而在水稻土中鮮少發(fā)現(xiàn)。

3.3 土壤環(huán)境參數(shù)對AAOB群落結(jié)構(gòu)的影響

環(huán)境因子是影響微生物群落結(jié)構(gòu)變化的重要因子，對于深入認識土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)中扮演的角色和功能具有重要意義。RDA分析直接將環(huán)境變量作為約束條件考慮到排序分析中，從而解釋環(huán)境因子對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響[40]。已有研究顯示，農(nóng)業(yè)土壤中AAOB群落結(jié)構(gòu)受銨含量[16]和無機氮含量[18]的影響。而本文卻得出了相異的結(jié)果，即pH和SOM是影響石灰性紫色水稻土AAOB群落結(jié)構(gòu)的主要因子。造成以上差異的原因可能是：首先可能是生態(tài)系統(tǒng)差異造成的。因為SHEN等的研究是在種植蔬菜土壤中進行的[16]，而部分研究發(fā)現(xiàn)水稻土中AAOB的群落結(jié)構(gòu)與pH值明顯相關[17, 37]。此外，HUI等還發(fā)現(xiàn)AAOB群落結(jié)構(gòu)與土壤有機質(zhì)也明顯相關。其次，可能是因為不同水稻田中的各種理化性質(zhì)含量的不同。

4 結(jié)論

土壤表層為厭氧氨氧化細菌（AAOB）最廣泛分布的層次。石灰性紫色水稻土表層土（0—20 cm）中的優(yōu)勢AAOB屬于Brocadia，而深層土壤中的優(yōu)勢AAOB屬于Scalindula。長期施氮會降低石灰性紫色水稻土中厭氧氨氧化細菌的群落多樣性。pH是影響石灰性紫色水稻土AAOB群落結(jié)構(gòu)的主要環(huán)境因子。

References

[1] MULDER A, VAN DE GRAAF A A, Robertson L A, Kuenen J G. Anaerobic ammonium oxidation discovered in a denitrifying fluidized bed reactor., 1995, 16(3): 177-184.

[2] Strous M, Heijnen J J, Kuenen J,Jetten M S M. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium-oxidizing microorganisms., 1998, 50(5): 589-596.

[3] Engstrom P, Dalsgaard T, Hulth S, Aller R C. Anaerobic ammonium oxidation by nitrite (anammox): implications for N2production in coastal marine sediments., 2005, 69(8):2057-2065.

[4] Jetten M S M, Op den Camp H J M, Kuenen J G, Strous M. Description of the order Brocadiales //Krieg N R, Staley J T, Hedlund B P, Paster B J, Ward N, Ludwig W, Whitman W B.(. Heidelberg: Springer, 2010: 506-603.

[5] Strous M, Fuerst J A, Kramer E H M, Logemann S, Muyzer G, van de Pas-Schoonen K T, Webb R, Kuenen J G, Jetten M S M. Missing lithotroph identified as new planctomycete., 1999, 400(6743): 446-449.

[6] Schmid M C, Twachtmann U, Klein M, Strous M, Juretschko S, Jetten M S M, Metzger J W, Schleifer K H, Wagner M. Molecular evidence for genus level diversity of bacteria capable of catalyzing anaerobic ammonium oxidation., 2000, 23(1):93-106.

[7] Schmid M C, Walsh K, Webb R I, Rijpstra W I, van de Pas-Schoonen K, Verbruggen M J, Hill T, Moffett B, Fuerst J, Schouten S, Damsté J J S, Harris J, Shaw P, Jetten M S M, Strous M.‘Scalindua brodae’, sp. nov.,‘Scalindua wagneri’, sp. nov., two new species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria., 2003, 26(4):529 -538.

[8] Quan Z X, Rhee S K, Zuo J E, Yang Y, Bae J W, Park J R, Lee S T, Park Y H. Diversity of ammonium-oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) reactor., 2008, 10(11):3130 -3139.

[9] Kartal B, Rattray J, van Niftrik L A, van de Vossenberg J, Schmid M C, Webb R I, Schouten S, Fuerst J A, Damsté J J S, Jetten M M S, Strous M.‘Anammoxoglobus propionicus’ a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria., 2007, 30(1):39-49.

[10] Liu S, Yang F, Gong Z,Meng F, Chen H, Xue Y, Furukawa K. Application of anaerobic ammonium-oxidizing consortium to achieve completely autotrophic ammonium and sulfate removal., 2008, 99(15): 6817-6825.

[11] Hu B L, Zheng P, Tanga C J,Chen J W, van der Biezen E, Zhang L, Ni B J, Jetten M S M, Yan J, Yu H Q, Kartal B. Identification and quantification of anammox bacteria in eight nitrogen removal reactors., 2010, 44(17): 5014-5020.

[12] Tsushimaa I, Ogasawaraa Y, Kindaichib T, Satoh H, Okabe S. Development of high-rate anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) biofilm reactors., 2007, 41(8): 1623-1634.

[13] Kuypers M M M, SliekersA O, Lavik G, Schmid M., J?rgensen B B, Kuenen J G, Damsté J S S, Strous M, Jetten M S M. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea., 2003, 422(6932): 608-611.

[14] Zhu G B, Wang S, Wang Y, Wang C, Risgaard-Petersen N, Jetten M S M, Yin C. Anaerobic ammonia oxidation in a fertilized paddy soil., 2011, 5 (12):1905-1912.

[15] Shen L D, Liu S, Lou L P, Liu W P, Xu X Y, Zheng P, Hu B L. Broad distribution of diverse anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in Chinese agricultural soils., 2013, 79(19): 6167-6172.

[16] Shen L D, Wu H S, Gao Z Q, Xu X H, Chen T X, Liu S, Cheng H X. Occurrence and importance of anaerobic ammonium- oxidising bacteria in vegetable soils., 2015, 99(13): 5709-5718.

[17] Yang X R, Li H, Nie S A,Su J Q, Weng B S, Zhu G B, Yao H Y, Gilbert J A, Zhu Y G. Potential contribution of anammox to nitrogen loss from paddy soils in Southern China., 2015, 81(3): 938-947.

[18] Shen L D, Liu S, Huang Q, Lian X, He Z F, Geng S, Jin R C, He Y F, Lou L P, Xu X Y, Zheng P, Hu B L. Evidence for the co-occurrence of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane oxidation processes in a flooded paddy field., 2014, 80(24): 7611-7619.

[19] 范改娜, 祝貴兵, 王雨, 王衫允, 王朝旭, 尹澄清. 河流濕地氮循環(huán)修復過程中的新型功能微生物. 環(huán)境科學學報2010, 30(8): 1558-1563.

Fan G N, Zhu G B, Wang Y,Wang S Y, Wang C X, Yin C Q. New functional microorganisms in nitrogen cycle restoration of river riparian ecosystems., 2010, 30(8): 1558-1563.(in Chinese)

[20] 辜運富, 張小平, 涂仕華, Kristina Lindstr?m. 長期定位施肥對石灰性紫色水稻土古菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 生物多樣性, 2011, 19(3): 369-376.

Gu Y F, Zhang X P, Tu S H, Lindstr?m K. Effect of long-term fertilization on archaeal community structure in calcareous purplish paddy soil., 2011, 19(3): 369-376. (in Chinese)

[21] 盧圣鄂, 王鎣燕, 陳勇, 涂仕華, 張小平, 辜運富. 不同施肥制度對石灰性紫色水稻土中氨氧化古菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 生態(tài)學報, 2016, 36(21): 6919-6927.

LU S E, WANG Y Y, CHEN Y, TU S H, ZHANG X P, GU Y F. Impact of different long-term fertilization system on ammonia oxidation Archaea community structure in Calcareous Purple Paddy soil., 2016, 36(21): 6919-6927. (in Chinese)

[22] 辜運富, 云翔, 張小平, 涂仕華, 孫錫發(fā), Kristina Lindstr?m. 不同施肥處理對石灰性紫色土微生物數(shù)量及氨氧化細菌群落結(jié)構(gòu)的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學2008, 41(12): 4119-4126.

GU Y F, YUN X, ZHANG X P, TU S H, SUN X F, Lindstr?m K. Effect of different fertilizer treatments on soil microbes and ammonium oxidizing bacterial community in a Calcareous Purple Paddy Soil., 2008, 41(12): 4119-4126. (in Chinese)

[23] Gu Y F, Zhang X P, Tu S H, Lindstr?m K. Soil microbial biomass, crop yields, and bacterial community structure as affected by long-term fertilizer treatments under wheat-rice cropping.2009, 45(3): 239-246.

[24] 魯如坤. 土壤農(nóng)業(yè)化學分析方法. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

LU R K.. Beijing: China Agricultural Science and Technology Press, 2000. (in Chinese)

[25] Hamersley M R, Lavik G, Woebken D,Rattray J E, Lam P, Hopmans E C, Damsté J S S, Krüger S, Graco M, Gutiérrez D, Kuypers M. M. Anaerobic ammonium oxidation in the Peruvian oxygen minimum zone., 2007, 52(3): 923-933.

[26] 儲昭瑞, 李相昆, 孟令威, 張杰. T-RFLP技術在厭氧氨氧化菌群結(jié)構(gòu)分析中的應用. 哈爾濱工業(yè)大學學報, 2013, 45(2): 26-30.

CHU Z R, LI X K, MENG L W, ZHANG J. Identification of anaerobic in environmental ammonium-oxidizing bacteria samples by T-RFLP., 2013, 45(2): 26-30. (in Chinese)

[27] Blackwood C B, Marsh T L, Kim S H, Paul E A. Terminal restriction fragment length polymorphism data analysis for quantitative comparison of microbial communities., 2003, 69(2): 926-932.

[28] Dang H, Zhou H, Zhang Z,Yu Z, Hua E, Liu X, Jiao N. Molecular detection of candidatus scalindua pacifica and environmental responses of sediment Anammox bacterial community in the Bohai Sea, China., 2013, 8(4): 61330.

[29] 孫瑞蓮, 趙秉強, 朱魯生, 徐晶, 張夫道. 長期定位施肥對土壤酶活性的影響及其調(diào)控土壤肥力的作用. 植物營養(yǎng)與肥料學報, 2003, 9(4): 406-410.

SUN R L, ZHAO B Q, ZHU L S, XU J, ZHANG F D. Effect of long-term fertilization on soil enzyme activities and its role in adjusting-controlling soil fertility., 2003, 9(4): 406-410. (in Chinese)

[30] 林治安, 趙秉強, 袁亮, Hwat Bing-So.長期定位施肥對土壤養(yǎng)分與作物產(chǎn)量的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學2009, 42(8): 2809-2819.

LIN Z A, ZHAO B Q, YUAN L, HWAT B S. Effects of manure and fertilizers long-term located application on soil fertility and crop yield., 2009, 42(8): 2809-2819. (in Chinese)

[31] Murase J, Hida A, Ogawa K, Nonoyama T, Yoshikawa N, Imai, K. Impact of long-term fertilizer treatment on the microeukaryotic community structure of a rice field soil.2015, 80: 237-243.

[32] Zhang Q, Liang G, Myrold D D, Zhou W. Variable responses of ammonia oxidizers across soil particle-size fractions affect nitrification in a long-term fertilizer experiment.2017,105: 25-36.

[33] Hui C, Guo X, Sun P, Lin H, Zhang Q, Liang Y, Zhao Y H. Depth-specific distribution and diversity of nitrite-dependent anaerobic ammonium and methane-oxidizing bacteria in upland- cropping soil under different fertilizer treatments., 2017, 113: 117-126.

[34] Islam M R, Chauhan P S, Kim Y, Kim M, Sa T. Community level functional diversity and enzyme activities in paddy soils under different long-term fertilizer management practices.2011, 47(5): 599-604.

[35] Zhao J, Ni T, Li Y, Xiong W, Ran W, Shen B. Responses of bacterial communities in arable soils in a rice-wheat cropping system to different fertilizer regimes and sampling times.2014, 9(1): 85301.

[36] Zhu G, Wang S, Wang W,Wang Y, Zhou L, Jiang B, Op den Camp H J M, Risgaard-Petersen N, Schwark L, Peng Y Z, Hefting M M, Jetten M S M, Yin C Q. Hotspots of anaerobic ammonium oxidation at land-freshwater interfaces., 2013, 6(2): 103-107.

[37] Bai R, Chen X, He J Z,Shen J P, Zhang L M.andpredominated in anammox bacterial community in selected Chinese paddy soils., 2015, 15(9): 1977-1986.

[38] Zhao Y, Xia Y, Kana T M, Wu Y, Li X, Yan X. Seasonal variation and controlling factors of anaerobic ammonium oxidation in freshwater river sediments in the Taihu Lake region of China., 2013, 93(9): 2124-2131.

[39] Schmid M C, Risgaard‐Petersen N, Van De Vossenberg J, Kuypers M M, Lavik G, Petersen J, Hulth S, Thamdrup B, Canfield D, Dalsgaard T, Rysgaard S, Sejr M K, Strous M, Op den Camp H J M, Jetten M S M. Anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in marine environments: widespread occurrence but low diversity., 2007, 9(6): 1476-1484.

[40] K?nneke M, Bemhard A E, José R, Walker C B, Waterbury J B, Stahl D A. Isolation of an autotrophic ammonia- oxidizing marine archaeon., 2005, 437(7058): 543-546.

（責任編輯 李云霞）

Response of Anammox Bacteria Community Structure and Vertical Distribution to Different Long-term Fertilizations in Calcareous Purple Paddy Soil

WANG YingYan1, LU ShengE1, LI YueFei1, TU ShiHua2, ZHANG XiaoPing1, GU YunFu1

(1Department of Microbiology, College of Resources, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130;2Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066)

【Objective】The impacts of long-term fertilizations on the anaerobic ammonium oxidation bacteria (AAOB) community structure and vertical distribution were studied in order to deeply understand the microbial mediated mechanism of anammox reaction, develop a sound fertilization regime and provide theoretical foundations for maintaining the soil quality in this region.【Method】Chemical analysis, real-time PCR and terminal restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) were used to analyze the soil physico-chemical properties, the 16S rRNA gene abundance and composition of AAOB community, respectively.【Result】The results showed that compared to no fertilizer application control (CK), all fertilizers decreased the soil pH and nitrate content, while increased soil organic matter (SOM), total nitrogen (TN) and ammonia content. With increasing of soil depth, soil parameters including soil pH, TN, and nitrate content were decreased, while the ammonia content was not obviously changed. The qPCR results showed: the abundance of AAOB 16S rRNA gene peaked in the 0-20 cm layer, while being the lowest in the 20-40 cm depth. Mere nitrogen treatment (N) had an evident positive effect on the abundance of AAOB. The T-RFLP results indicated that in the 0-20 cm layer, the community compositions of AAOB were the most complex, which were also supported by the highest Shannon-wiener diversity index. Compositions of AAOB community in the soil fertilized with N only were the simplest, while those in the soil amended with CK were the richest. Besides, the predominant AAOB were phylogenetically affiliated toBrocadia. Redundant gradient analysis (RDA) showed that pH was the key factor in shaping the AAOB community in calcareous purple paddy soil amended with different fertilizer treatments.【Conclusion】This study suggested that mere N fertilizer would decrease the compositions of AAOB community in calcareous purple paddy soil but increase their abundances. The topsoil (0-20 cm) was the main distribution soil depth in calcareous purple paddy soil for AAOB.

long-term fertilization; Calcareous Purple Paddy soil; T-RFLP; anammox bacteria

2017-01-03；接受日期：2017-03-29

國家自然科學基金（41201256）

王鎣燕，E-mail：398766403@qq.com。通信作者辜運富，Tel：028-86290982；E-mail：guyf@sicau.edu.cn