張敏，朱明,，李文宗，馬潔，劉悅萍，江海洋，王磊，徐妙云

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Ath-miR169d介導(dǎo)的擬南芥葉片發(fā)育的分子調(diào)控機制

張敏1，朱明1,2，李文宗1，馬潔3，劉悅萍3，江海洋2，王磊1，徐妙云1

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081；2安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥230036；3北京農(nóng)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，北京102206）

【目的】探究ath-miR169d在擬南芥葉片發(fā)育過程中的作用，明確其調(diào)控的分子機制，為增強葉菜類植物的光合效率以及增加生物量和提高作物產(chǎn)量提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取ath-miR169d過表達和降低表達的擬南芥轉(zhuǎn)基因株系以及野生型擬南芥，在22℃、相對濕度60%、16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)，觀察不同生長階段葉片發(fā)育表型的差異；同時構(gòu)建pmiR169d::GUS表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并利用蘸花法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥（Columbia，Col-0），獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥，利用GUS染色對ath-miR169d在擬南芥不同組織器官中的表達模式進行研究；選取8周齡的過表達材料和野生型對照株系，對其葉片表皮細胞形態(tài)進行掃描電鏡分析；對4周齡過表達材料和野生型對照株系的幼苗頂端分生組織和葉片中總IAA進行定量分析，并進行基因芯片表達譜分析，篩選差異表達基因；通過實時熒光定量PCR對生長素信號途徑部分差異表達關(guān)鍵基因的表達情況進行分析?！窘Y(jié)果】Ath-miR169d過表達擬南芥株系蓮座葉數(shù)目較野生型少，葉片小，而ath-miR169d降低表達的擬南芥株系的蓮座葉較野生型多，葉片大，且在抽薹和種子成熟之后還持續(xù)長出新葉，而野生型蓮座葉則在種子成熟之后逐漸衰老干枯；掃描電鏡觀察到ath-miR169d過表達擬南芥株系葉片中表皮細胞小于野生型；表達模式分析表明，ath-miR169d主要在頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM）和葉片維管系統(tǒng)中表達，且新葉中表達強。SAM是產(chǎn)生生長素的部位，IAA測定結(jié)果表明ath-miR169d過表達擬南芥株系中IAA含量顯著降低，為野生型植株的38.6%，同時基因芯片表達譜分析也驗證了ath-miR169d參與調(diào)控植物體內(nèi)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ath-miR169d過表達株系中生長素合成關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)運體蛋白基因均顯著下調(diào)表達，而具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的生長素響應(yīng)因子1和2基因（和）表達上調(diào)；STTM miR169d低表達株系中這4個基因的表達則為相反趨勢，該結(jié)果與觀察到的表型相一致。【結(jié)論】Ath-miR169d通過介導(dǎo)生長素信號途徑參與了擬南芥葉片發(fā)育的調(diào)控，ath-miR169d表達量發(fā)生變化會影響葉片的數(shù)量和大小，最終影響整個植株的生物量。

擬南芥；miR169；葉片；發(fā)育；生長素信號途徑

0 引言

【研究意義】在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，尤其對于食葉類蔬菜等，提高植物生物量，可以提高生產(chǎn)效率，降低成本，具有重要意義。葉片作為光合作用的器官，對于植物的發(fā)育和生物量的積累至關(guān)重要。葉片的發(fā)育包括葉原基的起始、極性的建立和葉片的擴展。葉片的發(fā)育受小RNA、轉(zhuǎn)錄因子和激素的協(xié)調(diào)調(diào)控[1]。越來越多的研究表明，miRNA作為一個關(guān)鍵調(diào)控因子啟動和參與植物體內(nèi)多條發(fā)育途徑。植物中最大的miR169家族基因，參與植物的逆境響應(yīng)和生長發(fā)育調(diào)控。利用已有的過表達和低表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料，解析其介導(dǎo)葉片發(fā)育調(diào)控的分子機制，可為調(diào)節(jié)植物營養(yǎng)生長，增加總生物量提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】MiR156/SPL調(diào)控模塊與TCP4互作形成的復(fù)合體參與擬南芥的葉片發(fā)育[2]。miR160通過靶向調(diào)節(jié)3個ARF同源基因、和參與調(diào)控葉原基的形成和蓮座葉正確葉序的建立[3-5]。MiR164通過對（CUP-SHAPED COTYLEDON1）和的調(diào)控介導(dǎo)器官邊界的形成[5-7]。miR319通過對的靶向調(diào)節(jié)參與葉片發(fā)育過程中的細胞分裂和生長[8-9]。生長素產(chǎn)生于頂端分生組織（shoot apical meristem，SAM），參與調(diào)節(jié)植物發(fā)育的多個過程，包括根和葉片形態(tài)建成、器官形成和維管組織的發(fā)育等[10]。生長素的合成涉及多條發(fā)育進程[11]，其中主要的天然生長素形式，吲哚乙酸IAA的合成主要經(jīng)過兩步化學(xué)反應(yīng)，首先色氨酸（Trp）通過轉(zhuǎn)氨作用形成吲哚丙酮酸（IPA），然后IPA再被YUCCA（YUC）家族基因編碼的含黃素單加氧酶催化形成IAA[12]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PIN蛋白家族是主要的介導(dǎo)生長素由胞內(nèi)向胞外、以及細胞之間定向移動的轉(zhuǎn)運體[13]。擬南芥miR169家族包括14個基因，最終產(chǎn)生4個成熟的miRNA異構(gòu)體（a、b/c、d/e/f/g和h/i/j/k/l/m/n）。不同的miR169異構(gòu)體在植物發(fā)育過程中表達模式不同[14]，其靶基因是轉(zhuǎn)錄因子NF-Y的A亞基[15]。NF-YA與NF-YB、NF-YC形成三聚體，發(fā)揮調(diào)控功能。研究表明，NF-Y轉(zhuǎn)錄因子參與植物發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)[16-22]。并且擬南芥miR169d/NF-YA2調(diào)控模塊介導(dǎo)逆境誘導(dǎo)的早花[23]和根形態(tài)建成[24]。【本研究切入點】在前期研究中，發(fā)現(xiàn)過表達轉(zhuǎn)基因植株蓮座葉的生長受到影響，但其是否參與葉片發(fā)育的調(diào)控及其分子機制還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對不同轉(zhuǎn)基因材料的蓮座葉表型、葉片表皮細胞的形態(tài)等指標的觀察，結(jié)合表達模式的分析，以及內(nèi)源生長素的定量檢測和基因表達情況檢測等研究，明確對葉片發(fā)育的影響，進而解析其分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所完成。

1.1 植物材料

擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col）。植物生長條件為22℃，相對濕度60%，光周期16 h/8 h。株系為作物基因組與遺傳改良實驗室保存[23]。

1.2 pmiR169d::GUS載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因株系的獲得

通過PCR方法從基因組DNA中擴增ath-miR169d前體序列上游2 kb片段（引物序列分別為pmiR169d- FW：5′-ACCCTAACTCATGATGAAGG-3′和pmiR169d- RV：5′-CACCTGTCGACGTACTAGATC T-3′）。與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)測序驗證后重組至植物雙元載體pCAMBIA1303。并經(jīng)蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥Col野生型，篩選獲得至少10個獨立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因陽性材料。

1.3 STTM載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因株系的獲得

STTM是一類短的（~100 nt）人工合成非編碼RNA，參照文獻[25]模擬miR169d的前體序列，設(shè)計STTM序列（5′-caagtcatcTACcttg gctcaGTTGTTGTTGTTATGGTCTAATTTAAATA-3′，5′-TGGTCTAAAGAAGAAGAATcaagtcatcTACcttggctca-3′），斜體部分分別為HⅠ和Ⅰ酶切位點，中間48 nt為linker序列，可以形成一個弱的頸環(huán)結(jié)構(gòu)，小寫字體為能夠與互補配對的序列，其中10—12 nt設(shè)計為3個不配對堿基突出部分，從而可以與結(jié)合并不被其降解，導(dǎo)致沉默。經(jīng)測序驗證正確后酶切連接至植物雙元載體載體pPZP212上。該載體經(jīng)蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥Col野生型，并篩選獲得至少10個獨立轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因陽性材料。

1.4 GUS染色

為了全面分析在擬南芥中的表達情況，將不同齡期的幼苗整株進行染色。具體步驟參考文獻[26]方法。

1.5 總RNA、miRNA提取和實時熒光定量PCR

利用Trizol（ambion）提取擬南芥總RNA，然后將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA（5×All-In-One RT MasterMix，abm，加拿大）。使用SYBR Premix Ex TaqTM（CodeQPK-201，TOYOBO）試劑進行實時熒光定量PCR分析，擬南芥作為內(nèi)參。利用miRcute miRNA提取分離試劑盒（DP501，TIANGEN，北京）提取擬南芥的miRNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA（TIANGEN miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒，KR201），再用TIANGEN miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒（FP401），進行熒光定量PCR。擬南芥作為內(nèi)參。每個基因型均做3個獨立生物學(xué)重復(fù)，包含至少3個以上單株樣品。所用儀器為ABI7500，利用2–ΔΔCT方法分析試驗結(jié)果[27]，所用引物序列見表1，miRNA熒光定量的反向引物為試劑盒自帶通用引物。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.6 IAA的定量分析

16 h/8 h光周期條件下培養(yǎng)4周的擬南芥幼苗地上部分全部收獲，轉(zhuǎn)基因材料和野生型分別隨機選5株混樣（200 mg），委托中國科學(xué)院遺傳發(fā)育研究所利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用進行IAA定量分析。

1.7 基因芯片分析

分別提取轉(zhuǎn)基因株系和野生型的總RNA，利用Agilent 2100分析儀器檢測總RNA的質(zhì)量和數(shù)量，并通過變性瓊脂糖凝膠檢測RNA的完整度，對質(zhì)檢合格的RNA樣品委托上海歐易公司進行基因芯片分析，所用芯片為擬南芥Agilent V4.0。

2 結(jié)果

2.1影響擬南芥蓮座葉生長

前期研究發(fā)現(xiàn)ath-不僅參與調(diào)控擬南芥的開花時間[23]，同時也影響葉片的發(fā)育，過表達擬南芥的蓮座葉與野生型相比少且小。為探究其對葉片發(fā)育的調(diào)控功能，通過構(gòu)建并獲得STTM[25]的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，抑制了內(nèi)源的表達。如圖1-a為STTM的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的的相對表達量。與野生型相比，STTM株系蓮座葉多且大（圖1-b、1-c）。過表達株系的蓮座葉直徑是4.29 cm，短于野生型（5.03 cm），STTM株系是6.5 cm，大于野生型（圖1-d）。而且，STTM株系會不斷生長新葉，一直持續(xù)到抽薹結(jié)實后仍有新葉的發(fā)生及生長，但野生型在抽薹結(jié)實之后就不再長新葉（圖1-c）。40 d苗齡的過表達株系蓮座葉數(shù)為13.8，野生型和STTM分別為16.6和20.4（圖1-d）。

表皮細胞的數(shù)目和大小決定了葉片的大小，為探究過表達株系葉片變小的原因，利用掃描電鏡觀察了各個擬南芥株系的表皮細胞形態(tài)。過表達株系葉片表皮細胞（圖2-a）小于野生型株系的表皮細胞（圖2-b），說明通過介導(dǎo)葉片表皮細胞的大小進而影響了葉片的大小。

2.3主要在擬南芥頂端分生組織和葉片維管系統(tǒng)中表達

為解析在擬南芥葉片發(fā)生和葉片發(fā)育中的功能，克隆的2 kb啟動子片段，構(gòu)建pmiR169d::GUS表達載體并獲得了其轉(zhuǎn)基因擬南芥株系。對pmiR169d::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥株系染色分析結(jié)果表明，主要在頂端分生組織和葉維管系統(tǒng)中表達。隨著pmiR169d::GUS幼苗的生長，報告基因的表達逐漸增強，且在新生葉片中的表達高于老葉片（圖3）。頂端分生組織是葉原基形成的部位，維管系統(tǒng)則負責(zé)水分、礦質(zhì)元素和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，因而在該部位的表達可能與葉片發(fā)育相關(guān)。

2.4過表達降低了轉(zhuǎn)基因株系中內(nèi)源IAA的含量

植物體內(nèi)生長素主要產(chǎn)生于SAM，是植物器官發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子?？紤]到在SAM中大量表達，為分析其是否影響擬南芥生長素的代謝，檢測了4周齡地上部幼苗中內(nèi)源生長素的含量，發(fā)現(xiàn)在過表達株系中，內(nèi)源IAA含量與WT相比降低了38.6%（圖4-a），說明參與了IAA代謝途徑的調(diào)控。為進一步探究參與調(diào)控葉片起始和發(fā)育的分子機制，對4周齡過表達株系幼苗進行基因芯片表達譜分析。與野生型相比，分別有2 268和2 562個基因顯著下調(diào)和上調(diào)表達（log2FC＞1 or＜-1 with-value of 0.05）。對表達發(fā)生顯著變化的基因進行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析，結(jié)果表明，在富集比例前10的代謝路徑中，富集基因數(shù)量最多的是“次級代謝產(chǎn)物合成途徑”和“植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”（圖4-b），其中，有多個生長素信號途徑基因表達發(fā)生了變化。

2.5過表達株系和STTM低表達株系中生長素信號途徑基因表達發(fā)生變化

鑒于過表達擬南芥株系中IAA含量明顯下降，推測IAA合成途徑中的基因可能受到影響，通過對基因芯片表達譜分析發(fā)生IAA合成途徑關(guān)鍵基因、外運載體蛋白基因的表達明顯降低，采用qPCR的方法對這些基因在過表達株系和STTM低表達株系中的表達量進行檢測。結(jié)果表明，與野生型相比，過表達株系中和表達顯著下調(diào)，而STTM株系中這兩個基因都顯著上調(diào)表達（圖5）。過表達株系中表達下調(diào)與IAA含量降低結(jié)果吻合，IAA的減少也導(dǎo)致IAA轉(zhuǎn)運體的下調(diào)表達。Ellis等[28]報道IAA應(yīng)答因子和的過表達促進葉片衰老，為了進一步分析和在過表達植株和低表達株系中的作用，對其表達進行了分析，結(jié)果表明，在過表達植株中和的表達明顯上升，在低表達株系中則顯著下調(diào)表達，因是轉(zhuǎn)錄抑制因子，推測其上調(diào)表達阻礙了葉片的發(fā)育，并促進植株衰老。

對于無數(shù)據(jù)區(qū)域，須將 NoData轉(zhuǎn)為數(shù)值0，否則獲得的陰影數(shù)據(jù)不完整，選擇 [Spatial Analyst 工具][分類][重分類]工具完成，如圖4。

3 討論

miR169家族是植物中最大且進化保守的一個miRNA家族，其家族成員在調(diào)節(jié)脅迫應(yīng)答和生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，的靶基因主要是NF-YA轉(zhuǎn)錄因子，miR169/NF-YA這個調(diào)控模塊可以感受內(nèi)源信號或外部環(huán)境的激活，使植物表現(xiàn)出增強適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化的特性。對蒺藜狀苜蓿的研究發(fā)現(xiàn)，在的5′端有一個內(nèi)含子可以進行選擇性剪切，在這個區(qū)域中有一個ORF可以編碼一個蛋白（uORF1p），這個蛋白的表達可以下調(diào)，其與呈現(xiàn)出功能上的互補，在根瘤發(fā)育的早期階段調(diào)控占主導(dǎo)地位，而在后期時uORF1p發(fā)揮顯著功能[29]。LI等[21]研究表明miR169/NF-YA5調(diào)控模塊可以響應(yīng)干旱并提高擬南芥的抗旱性，擬南芥在缺水環(huán)境中表達受到抑制，也就脫離了的控制而上調(diào)表達，進而使植物抗旱性增強，經(jīng)過進一步研究發(fā)現(xiàn)這條通路是ABA介導(dǎo)的。這些研究使得NF-YA的上游調(diào)控機制變得更加清晰，也為植物環(huán)境脅迫下的分子應(yīng)答機制研究提供了理論支撐。作物基因組與遺傳改良研究室王磊課題組前期在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了受逆境脅迫誘導(dǎo)的另一個模塊miR169/NFYA2，它可以通過響應(yīng)逆境使植物提前開花，并且miR169/NF-YA2調(diào)控模塊所引起的早花現(xiàn)象獨立于其他開花調(diào)控途徑[23]。而且異構(gòu)體及其靶基因參與調(diào)控了擬南芥根的形態(tài)建成[24]。根中轉(zhuǎn)錄因子和會響應(yīng)磷饑餓而顯著上調(diào)表達[30]。這些研究結(jié)果表明，及其靶基因家族成員，可以直接或間接地作為發(fā)育與響應(yīng)非生物逆境之間的一個感應(yīng)子或者連接體，發(fā)揮重要的功能。

生長素是植物體內(nèi)重要的生長發(fā)育調(diào)控因子，各種來自外界的逆境均可以影響其在植物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和轉(zhuǎn)運，從而影響植物的生長發(fā)育[31]。本研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的表達發(fā)生變化會影響蓮座葉的生長，并且這種作用是通過生長素信號途徑介導(dǎo)的，從而發(fā)現(xiàn)了一個新的調(diào)控功能。這種調(diào)控功能在蔬菜類作物中展現(xiàn)了應(yīng)用前景。但是，miRNA都是通過對靶基因的調(diào)控實現(xiàn)其功能，本研究中如何通過其靶基因NF-YA家族調(diào)控了生長素途徑還需要進一步研究分析。另外，在前期研究中發(fā)現(xiàn)也參與擬南芥開花時間的調(diào)控，那么生長素是否也介導(dǎo)了這一生物學(xué)過程？是如何協(xié)調(diào)介導(dǎo)葉片發(fā)育和開花時間的調(diào)控等問題，都值得進一步探討。

4 結(jié)論

通過介導(dǎo)生長素信號途徑參與了擬南芥葉片發(fā)育的調(diào)控，表達量發(fā)生變化會影響葉片的數(shù)量和大小，最終影響整個植株的生物量。

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（責(zé)任編輯 李莉，岳梅）

Molecular regulation mechanism of leaf development mediated by ath-miR169d in

ZHANG Min1, ZHU Ming1,2, LI WenZong1, MA Jie3, LIU YuePing3, JIANG HaiYang2, WANG Lei1, XU MiaoYun1

(1Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;3Colloge of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

【Objective】The aims of this study are 1) to analyze the role of ath-miR169d in the progress of leaf development in, 2) to illuminate the mechanisms of molecular regulation mediated by ath-miR169d, and 3) to provide a new insight into improving the photosynthetic performance and the genetic engineering of vegetables biomass and crop productivity.【Method】Ath-miR169d over-expression transgenic plants, STTM ath-miR169d knockdown transgenic plants, and WT plants were grown in a controlled culture room at 22℃ with a relative humidity of 60% and 16 h/8 h photoperiod. Number and size of rosette leaf were measured; pmiR169d::GUS vector were constructed and transformed intoEHA105, and then infected the buds of wildtype(Columbia, Col-0), the pmiR169d::GUS transgenicplants were used to observe the expression profile ofin different organs and tissues by GUS staining method. Using 8-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants as materials, morphology of leaf epidemic cells were observed by scanning electron microscope (SEM). Whole shoots were harvested from 4-week-old seedlings ofover-expressing transgenicand wild type plants, subsequently the total endogenous IAA were detected and quantified as methyl esters by gas chromatography-mass spectroscopy (GC-MS). The mRNA expression profiles were detected by microarray analysis to screen differentially expressed genes. The expression of key genes in plant auxin signal pathway were verified by real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR). 【Result】In contrast to WT, ath-miR169d overexpression plants exhibited fewer and smaller rosettes, STTM ath-miR169d knockdown plants showed more and larger rosettes. Moreover, STTM ath-miR169d plants could generate new rosette leaves incessantly even after bolting and seeds harvest, whereas the leaves of ath-miR169d overexpression and WT plants generally decayed after harvest. The epidermal cells in the leaves ofath-miR169d over-expression plants were smaller than that in the WT leaves by SEM detection. Ath-miR169d was highly expressed in SAM and leaf vasculature, and expression profile was stronger in new leaves than in old ones. Endogenous IAA content reduced by 38.6% in ath-miR169d over-expressing plants compared to wild-type plants, showingwas potentially involved in auxin signal pathway by microarray analysis. The auxin biosynthesis geneand transporter genewere downregulated inover-expressing plants whereas, auxin response factors 1 and 2 (and) genes were upregulated. Expression profile of,,andSTTMplantswere opposite to over-expressing plants. 【Conclusion】Results of the experiment showed that the leaf development was regulated by ath-miR169d through the auxin-signaling pathway. Number and size of rosette could be alerted by ath-miR169d expression level, and further affected biomass of the whole plant.

; miR169; leaf; development; auxin signaling pathway

2017-02-13；接受日期：2017-04-05

國家自然科學(xué)基金（31270318）、國家“973”計劃（2014CB138205）

張敏，Tel：13126532159；E-mail：13126532159@163.com。通信作者徐妙云，E-mail：xumiaoyun@caas.cn