潘光照，張奎，李重陽，趙羽卒，申利，徐曼，蘇晶晶，林西，崔紅娟

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家蠶組織蛋白酶L（Bm）基因鑒定、表達及其功能分析

潘光照，張奎，李重陽，趙羽卒，申利，徐曼，蘇晶晶，林西，崔紅娟

（西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，重慶 400716）

【目的】鑒定克隆家蠶組織蛋白酶L基因Bm（Bm），分析其序列和表達特征。分析家蠶組織蛋白酶L在大腸桿菌誘導(dǎo)下mRNA表達量的變化趨勢，為進一步研究家蠶組織蛋白酶L的功能打下基礎(chǔ)?！痉椒ā炕诩倚Q基因組數(shù)據(jù)庫（SilkDB）中序列BGIBMGA006893設(shè)計引物，利用RACE技術(shù)克隆家蠶組織蛋白酶L基因的cDNA全長序列，通過在線工具對基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)分子量及等電點進行預(yù)測；在NCBI數(shù)據(jù)庫下載其他物種組織蛋白酶L同源序列，利用Clustalx（1.83）和MEGA 6.0 軟件進行同源比對并構(gòu)建進化樹。運用RT-PCR和qRT-PCR對其時空表達特征進行分析。選取該基因的特異性片段，經(jīng)PCR擴增，測序驗證后將其連接至pET-28載體，轉(zhuǎn)化至Rosseta感受態(tài)表達菌株，經(jīng)IPTG在適宜溫度條件下誘導(dǎo)，獲得組織蛋白酶L重組蛋白。然后再利用鎳離子親和層析法對該蛋白進行純化，獲得純度較高的重組蛋白。最后利用大腸桿菌對家蠶血液系統(tǒng)進行攻毒，檢測家蠶組織蛋白酶L基因的表達水平?！窘Y(jié)果】通過查詢家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)分析得出，家蠶組織蛋白酶L基因定位于家蠶第10號染色體上，基因編號為BGIBMGA006893, nscaf2860?；蜷_放閱讀框全長687 bp，編碼228個氨基酸，含有保守的Pept_C1結(jié)構(gòu)域。通過在線網(wǎng)站預(yù)測，得出該蛋白酶的分子量為26.132 kD，等電點為4.57。進化分析表明該基因與同為鱗翅目昆蟲的草地貪夜蛾和黑脈金斑蝶親緣關(guān)系最為接近。RT-PCR顯示該基因集中表達于血細胞，在血液不同齡期也較高表達。用His抗體檢測經(jīng)純化后的蛋白，最終成功孵育出純化后的蛋白條帶;大腸桿菌個體攻毒免疫試驗檢測顯示，其mRNA表達水平隨攻毒時間呈現(xiàn)拋物線式的顯著性變化規(guī)律，從而揭示出BmCat L與家蠶免疫系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)性?！窘Y(jié)論】克隆獲得家蠶組織蛋白酶L基因的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)其特異性高表達于血細胞。通過原核表達和蛋白純化成功獲得了該基因的重組蛋白。大腸桿菌的刺激能夠顯著上調(diào)其表達，推測組織蛋白酶L可能參與家蠶免疫反應(yīng)。

組織蛋白酶L基因；家蠶；基因克??；原核表達；蛋白純化；免疫應(yīng)激

0 引言

【研究意義】組織蛋白酶L（CathepsinL）是一種重要的蛋白水解酶，屬于溶酶體木瓜蛋白酶家族半胱氨酸蛋白酶，是蛋白酶Clan CA中的木瓜蛋白酶家族（C1）的主要成員，以酶原的形式存在于溶酶體中。組織蛋白酶是動植物體內(nèi)廣泛存在的一種蛋白水解酶類，從低等到高等的生物體類群中均有組織蛋白酶的發(fā)現(xiàn)[1]。組織蛋白酶L參與了生物體的許多生理過程，如腫瘤侵襲的調(diào)控[2]、免疫應(yīng)答[3-6]，甚至是某些腫瘤干細胞輻射敏感度的調(diào)控因子[7]。家蠶（）作為一種鱗翅目模式昆蟲，對其組織蛋白酶L進行研究，對于深入了解該酶的功能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】組織蛋白酶這一概念最先提出于20世紀(jì)20年代，在20世紀(jì)40年代人們先發(fā)現(xiàn)了組織蛋白酶C，其后約40年內(nèi)對組織蛋白酶的研究進展緩慢，只有組織蛋白酶B、H、L陸續(xù)被鑒定并測序，到了20世紀(jì)90年代，通過測定組織蛋白酶B的晶體結(jié)構(gòu)后，越來越多的組織蛋白酶被發(fā)現(xiàn)，到目前為止，組織蛋白酶A—Z均已有報道[8-9]。在昆蟲學(xué)的研究中，從20世紀(jì)60年代至今，已有關(guān)于家蠶、果蠅（）、棉鈴蟲（）、蚜蟲以及蚊類等數(shù)種昆蟲組織蛋白酶的報道；20世紀(jì)90年代，日本研究者KAGEYAMA等從家蠶卵殼中鑒定出半胱氨酸蛋白酶（BCP），并對其結(jié)構(gòu)及活性作出了分析[10-11]。隨著研究的不斷深入，有相關(guān)研究指出組織蛋白酶類B和L在家蠶絲腺細胞程序性死亡方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[12]；近年來，對于其功能的研究也逐漸完善，對于完全變態(tài)的昆蟲而言，在經(jīng)歷蛻皮和變態(tài)過程中，幼蟲組織如血淋巴和脂肪體的重塑是非常重要的過程，組織蛋白酶在此過程中被認(rèn)為起到了關(guān)鍵性的作用并且是非常關(guān)鍵的調(diào)控因子[13]；在棉鈴蟲中有報道表明，在蛻皮期和化蛹前的表達量最大，在喂食期其表達量最低，表明Cathepsin L在對角質(zhì)層和表皮的降解中的作用[14]；蘇晶晶等[15]發(fā)現(xiàn)家蠶組織蛋白酶O基因特異性持續(xù)表達于家蠶血細胞，推測在家蠶蛻皮以及變態(tài)發(fā)育過程中發(fā)揮作用。近年來有研究表明，組織蛋白酶L與人類心血管疾病機制相關(guān)，組織蛋白酶L被認(rèn)為是水解膠原蛋白和彈性蛋白能力最強的蛋白水解酶，如果其表達發(fā)生異變，可能會導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生[16-19]；在病理狀態(tài)下，因為某些原因（如病原微生物、氧化應(yīng)激、炎癥因子等）所導(dǎo)致的細胞損傷將導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高甚至引起膜的破裂，致使大量組織蛋白酶L蛋白釋放至細胞質(zhì)或者組織間隙，并被激活，可降解細胞成分或細胞基質(zhì)成分（包括層粘素、IV型膠原纖維及纖維連接素等）；組織蛋白酶L還與人類許多疾病如關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、腎病、阿爾茨海姆病、多發(fā)性硬化癥及其他慢性炎癥性疾病甚至腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有關(guān)[20-25]。Lah等[26]發(fā)現(xiàn)Cathepsin L在乳腺癌病人中活性的提高完全“得益”于Cathepsin L與其抑制劑含量的失衡，這充分說明了的表達水平與腫瘤的發(fā)生水平存在密切關(guān)系?！颈狙芯壳腥朦c】組織蛋白酶是一種重要的蛋白水解酶類，在動物體免疫系統(tǒng)中起重要作用。家蠶作為一種重要的經(jīng)濟昆蟲，目前有關(guān)其組織蛋白酶的研究甚少，而其中對家蠶組織蛋白酶L基因的研究更是微乎其微?！緮M解決的關(guān)鍵問題】鑒定并克隆家蠶組織蛋白酶L基因，并分析其序列特征；構(gòu)建原核表達載體，誘導(dǎo)表達對應(yīng)的重組蛋白，并將其純化；設(shè)計免疫應(yīng)激檢測，探索家蠶組織蛋白酶L與免疫的聯(lián)系，為后期功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2015年6月至2017年4月在西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室完成。

1.1 材料及試劑

1.1.1 家蠶 供試家蠶品種為大造（P50），由西南大學(xué)家蠶基因資源庫提供。家蠶在27℃下飼喂桑葉。

1.1.2 質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒的提取運用Qiagen公司試劑盒；載體為PMD19-T simple、限制性內(nèi)切酶、Taq酶及DNA Marker和T4連接酶均為TakaRa公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑運用Promega公司生產(chǎn)的試劑盒；RACE Kit和Trizolz試劑盒均購自Invitrogen公司；特異性引物和相關(guān)基因測序均由北京六合華大基因完成；Rosetta表達菌株及pET-32、pET-28、pET-22b表達載體由筆者實驗室現(xiàn)有保存。甲醇、乙醇、PBS、DMSO、BSA甘油等試劑均為國產(chǎn)或者進口分裝產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 將5齡3 d的家蠶幼蟲置于冰盒上解剖，摘取頭部、中腸、馬氏管、血細胞、精/卵巢、表皮、中部絲腺、脂肪體等組織于預(yù)冷的EP管中，液氮速凍，材料收齊后于液氮中研磨，運用Trizol法先提取各組織的RNA，最后運用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄RNA以獲得cDNA。

1.2.2 家蠶Bm的克隆和分析 首先從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）和家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室數(shù)據(jù)庫（SilkDB）下載Bm序列的mRNA預(yù)測序列，根據(jù)預(yù)測的CDS序列，經(jīng)過比對后，運用Primer 5.0軟件針對此序列設(shè)計引物。由此得到該基因的部分中間序列。再送華大基因測序，經(jīng)核對序列正確后，據(jù)此序列設(shè)定基因特異性引物GSP1、NGSP1、GSP2、NGSP2（表1）。隨后按照RACE試劑盒進行5′和3′ RACE擴增。將產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收并將目的片段連接至PMD19-T simple載體上，轉(zhuǎn)化挑選陽性克隆，送華大基因測序。分析拼接結(jié)果，最后得到cDNA序列。

1.2.3 基因結(jié)構(gòu)及序列特征分析 將拼接得到的序列利用ORF Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ gorf.html）進行ORF預(yù)測以及氨基酸序列翻譯；在家蠶數(shù)據(jù)庫SilkDB中對全長cDNA進行序列比對，并運用NCBI在線程序Splign（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form）對基因的外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行鑒定分析。從GenBank下載其他物種同源的Cathepsin L基因序列，然后運用clustalx（1.83）和MEGA6.0軟件構(gòu)建進化樹。使用SMART（http://smart.embl- heidelberg.de/）、SignalP4.1 Server（http://www.cbs.dtu. dk/services/Signalp/）、TMHMM Server v.2.0（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）、ExPasy（http:// www.expasy.org/tools/）等在線網(wǎng)站預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域、分子量和等電點等信息。

1.2.4 RT-PCR檢測目的基因各組織中的表達情況 提取家蠶5齡3 d各組織（血液、馬氏管、頭、表皮、絲腺等9個組織）的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板進行PCR擴增，將產(chǎn)物經(jīng)過以高度保守的序列Actin3（肌動蛋白3）作為內(nèi)參，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，后經(jīng)EB染色，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像并分析結(jié)果。為了更進一步精準(zhǔn)地探討其特異性表達情況，基于半定量檢測結(jié)果，進行定量PCR（qRT-PCR）試驗，經(jīng)數(shù)據(jù)分析得出其表達結(jié)果。

1.2.5 原核表達及表達載體構(gòu)建 根據(jù)測序結(jié)果和比對結(jié)果，選擇比對后的特異性序列，設(shè)計相應(yīng)帶有H I和I酶切位點的引物進行PCR擴增，然后再進行1%瓊脂糖檢測，將目的片段進行切膠回收，并與pMD-19-Tsimple載體連接并轉(zhuǎn)化、陽性克隆菌的篩選及檢測，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，產(chǎn)物用H I和I進行雙酶切，得到目的片段Bm，同時將pET-32、pET-22b和pET-28質(zhì)粒載體也用同樣的酶進行雙酶切，得到載體骨架。最后把目的片段和載體連接得pET32-Bm、pET22b-Bm、pET32-Bm重組表達質(zhì)粒。

1.2.6 菌株轉(zhuǎn)化涂板誘導(dǎo)表達 將連接的pET-28/32/22b-Bm重組質(zhì)粒2 μL轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細胞，37℃，220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 h，后取10 μL菌液+10 μL相應(yīng)抗生素（載體為pET-32和pET-22b的用氨芐青霉素，載體為pET-28的用卡那霉素）+ 90 μL ddH2O涂板，37℃培養(yǎng)，0.5 h后倒置平板，后37℃過夜培養(yǎng)。挑選單菌落，各載體中各選取兩個單克隆斑接入到25—30 mL含有相應(yīng)抗生素（載體為pET-32和pET-22b的用氨芐青霉素，載體為pET-28的用卡那霉素）的LB液體培養(yǎng)基三角瓶中，37℃，250 r/min條件下擴大培養(yǎng)過夜。設(shè)計預(yù)試驗，探索不同濃度的IPTG和不同溫度條件下表達質(zhì)粒對蛋白表達的影響，進行條件優(yōu)化，選擇最佳的條件進行蛋白誘導(dǎo)。通過條件優(yōu)化試驗，最后選擇pET-28-Bm進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度16℃，IPTG誘導(dǎo)物濃度為0.1 mmol·L-1，220 r/min轉(zhuǎn)速和誘導(dǎo)時間24 h條件下，誘導(dǎo)Bm重組蛋白的表達，以獲得較高表達量的目的蛋白。

1.2.7 BmCat L蛋白純化 按照上述優(yōu)化條件，將大規(guī)模誘導(dǎo)表達的2 L菌液在5 000 r/min，常溫條件下離心20 min收菌，倒掉培養(yǎng)基；使用25 mmol·L-1Tris重懸洗滌菌體，4℃，15 000 r/min下離心15 min，棄上清，用25 mmol·L-1Tris重懸菌體；然后將懸于25 mmol·L-1Tris液體中的菌進行高壓破碎，4℃，15 000 r/min下離心15 min，分別收集上清和沉淀；5%乙酸、1% Triton以1﹕20的質(zhì)量體積比洗滌BmCat L蛋白包涵體50 min，高速冷凍離心，分別收集上清和沉淀；5%乙酸、1% Triron X-100重復(fù)上一步洗滌沉淀一次；隨后用2 mol·L-1尿素、25 mmol·L-1Tris、5 mmol·L-1EDTA洗滌沉淀一次，高速冷凍離心，分別收集上清和沉淀；2 mol·L-1尿素、25 mmol·L-1Tris、5 mmol·L-1EDTA重復(fù)上一步洗滌沉淀一次；20 mmol·L-1Tris、0.5 mol·L-1NaCl、50%乙醇，pH 7.0洗滌，高速冷凍離心，分別收集上清和沉淀；20 mmol·L-1Tris、0.5 mol·L-1NaCl、50%乙醇，pH 7.0重復(fù)上一步洗滌沉淀一次；用雙蒸水洗滌沉淀而去鹽，高速冷凍離心，分別收集上清和沉淀；用8 mol·L-1尿素，25 mmol·L-1Tris-HCl，0.3 mol·L-1NaCl, pH 8.0溶解包涵體，調(diào)pH至11.5—12.0，攪拌過夜，次日離心（20 000 r/min，30 min），分別收集上清和沉淀；將以上上清pH調(diào)回8.0，再用0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。最后用Ni+柱（Ni+-NTA）純化重組蛋白（按照GE公司提供的操作說明進行），收集洗脫液，利用SDS-PAGE分析洗脫蛋白質(zhì)的組分。

1.2.8 Bm免疫應(yīng)激檢測 為了檢測家蠶組織蛋白酶L的免疫應(yīng)答功能，選擇具有致病能力的大腸桿菌作為致病源。利用LB培養(yǎng)基接種大腸桿菌，并經(jīng)37℃過夜培養(yǎng)后，4℃1 000×離心15 min，然后用1×PBS重懸菌液。取5齡2 d處于盛食的健康家蠶，并將其分為兩組，分別向每組中注射10 μL（107CFU/幼蟲）的大腸桿菌液和等體積1×PBS緩沖液，分別于0.5、2、6、12、24、48 h后取血，經(jīng)快速離心，棄去上清，加入1 mL Trizol放于-80℃冰箱冷凍保存，待材料收齊后，取出融化并提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)獲得cDNA材料，定量PCR檢測其表達水平。

2 結(jié)果

2.1 Bm克隆與序列分析

通過PCR技術(shù)獲得了Bm大片段克隆產(chǎn)物，其大小約為1.6 kb的單帶（圖1-A）；對Bm進行大片段PCR擴增后，對此片段進行切膠回收、T/A克隆，轉(zhuǎn)化并篩選陽性克隆測序，所得結(jié)果經(jīng)比對為Bm大片段。根據(jù)Bm大片段序列和巢式PCR原理設(shè)計Bm的3′/5′ RACE引物，并進行3′/5′ RACE反應(yīng)，結(jié)果顯示3′ RACE后檢測有一條條帶，大小約為600 bp；5′ RACE后也為一條大小約為700 bp的條帶（圖1-A）。將RACE產(chǎn)物進行切膠回收，連接T載，轉(zhuǎn)化并挑選陽性克隆進行測序，將結(jié)果與Bm大片段進行拼接，獲得全長序列。通過比對發(fā)現(xiàn)該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫預(yù)測的序列一致，從而進一步證實Bm的正確性（圖1-B）。BmcDNA全長為871 bp，包括24 bp的5′ UTR和160 bp的3′ UTR；該基因由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成，全長為4 228 bp，含有完整的開放閱讀框，其大小為687 bp（圖1-C）。通過將克隆序列在家蠶數(shù)據(jù)庫（SilkDB）中進行比對，結(jié)果顯示該基因定位于第10號染色體。

表1 家蠶組織蛋白酶L基因引物

GSP: Gene specific primes; NGSP: Nested gene specific primes; Bm-YH引物劃線部分為酶切位點，劃線后部分序列為oligo序列 Restriction enzyme cutting sites of Bm-YH prime were underlined, followed by Oligo sequence

M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight standards；1：大片段產(chǎn)物The large pieces product；2、3：3′ RACE產(chǎn)物3′ RACE products；4、5：5′ RACE產(chǎn)物5′ RACE products。A：1%瓊脂糖分析檢測家蠶BmCat L克隆大片段Using 1% agarose to test the clone product of BmCat L；B：1%瓊脂糖檢測BmCat L全長擴增產(chǎn)物Using 1% agarose to test the PCR amplification of the complete cDNA sequence；C：BmCat L基因組信息分析（黑色框為外顯子，折線表示內(nèi)含子）The structure diagram of the BmCat L (exon and intron were represented by black box and black lines, respectively)

家蠶組織蛋白酶L開放閱讀框從ATG開始，終止子為TAA，利用SMART蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和SignalP信號肽預(yù)測等在線軟件分析其蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)存在信號肽，氨基酸從第1—25位是信號肽（圖2-A），第26—227位氨基酸區(qū)域為保守的Pept_C1結(jié)構(gòu)域（圖2-B），屬于溶酶體木瓜蛋白C1家族。通過預(yù)測，該蛋白質(zhì)分子量平均大小為26.132 kD，理論等電點為4.57。

2.2 Bm同源進化分析

為了進一步研究Bm與其他物種同源基因在進化上的親緣關(guān)系，對其與其他20種物種的Cathepsin L進行比對，進行聚類分析，并運用MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建進化樹。從進化樹來看，共分為兩大支。海綿綱的堡礁海綿位于單獨一大支，其中家蠶組織蛋白酶L（Bm）與同屬鱗翅目的草地貪夜蛾（rd）和黑脈金斑蝶的同源基因（）親緣關(guān)系最為相近，而與海綿綱的堡礁海綿和雙翅目的果蠅、地中海實蠅等親緣關(guān)系相對較遠；通過clustalx（1.83）軟件對序列比對分析得知這些物種的氨基酸序列均存在很大的相似度，說明該基因進化過程中的保守性（圖3）。

A：家蠶組織蛋白酶L全長cDNA 推導(dǎo)以及氨基酸序列分析（紅色方框為信號肽，黑色方框為保守的Pept_C1結(jié)構(gòu)域）The predicted full length cDNA sequence of BmCat Land its amino acids (The signal peptide and Pept_C1 domain were represented by red boxs and black boxs, respectively)；B：家蠶組織蛋白酶L結(jié)構(gòu)域預(yù)測The protein domains prediction of Bmcat L

圖3 家蠶與其他物種Cathepsin L聚類分析

2.3 時空表達分析

通過查詢家蠶基因組數(shù)據(jù)庫（http://www.silkdb. org/silkdb）發(fā)現(xiàn)，對應(yīng)的芯片探針號為sw08544和sw17791。通過家蠶基因芯片數(shù)據(jù)庫（http://www.silkdb.org/microarray/）發(fā)現(xiàn)，sw08544探針顯示，該基因集中表達于頭部和血細胞，極少數(shù)表達于外表皮和脂肪等，而sw17791探針顯示，集中表達于頭部和血細胞。由此推測該基因在血細胞和頭部具有表達特異性。

為了探索Bm在家蠶各組織的表達情況，運用RT-PCR分析幼蟲4齡4 d與5齡3 d血細胞、馬氏管、精巢等9種組織表達情況，結(jié)果顯示Bm在4齡4 d與5齡3 d均表達于血細胞，而其他組織表達均較不顯著或者不表達，預(yù)測Bm具有血細胞表達特異性（圖4-A）。針對此結(jié)果，進一步探索該基因在血細胞各時期的表達情況，當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)為35個時，結(jié)果如圖4-B，從圖中可看出4齡3 d至預(yù)蛹1 d血細胞中均有表達，但無明顯的表達變化趨勢；而當(dāng)PCR循環(huán)數(shù)為25個時，4齡3 d至預(yù)蛹1 d Bm均有表達，但隨齡期的變化呈規(guī)律性變化?；谠谘毎磉_特異性，針對其在各組織和各齡期進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示家蠶仍在血細胞居高表達，而在頭部次之（圖4-C），與數(shù)據(jù)庫（silkDB）預(yù)測結(jié)果相似。而4齡2 d至PP2時期，Bm表達水平呈現(xiàn)波折性變化（圖4-D），與RT-PCR結(jié)果相似。推測這可能與家蠶變態(tài)發(fā)育過程中血淋巴隨齡期的變化有關(guān)。

A：RT-PCR檢測BmCat LmRNA在4齡4 d和5齡3 d各組織表達情況the expression of BmCat L mRNA in different tissues of the 4th day of 4th and 3rd day of 5th larvae tested by RT-PCR。Ha：血細胞haemocyte；Ma：馬氏管malpighian tubules；Te：精巢testis；Si：絲腺silk gland；Ep：表皮epidermis；He：頭部head；Ov：卵巢ovary；Fb：脂肪體fat body；Mi：中腸midgut；B：RT-PCR檢測BmCat L mRNA在4齡3 d起至預(yù)蛹1 d血細胞中表達情況The expression of BmCat L mRNA in haemocyte from the molting period of the 3rd day of 4th instar larvae to the 1st day prepupa tested by RT-PCR；C：qRT-PCR分析BmCat L在4齡4 d各組織表達情況the expression of BmCat L in different tissues of the 4th day of 4th larvae analyzed by qRT-PCR；D：qRT-PCR分析BmCat L在4齡2 d至預(yù)蛹2 d mRNA表達情況The mRNA expression of BmCat L from the 2nd day of 4th instar larvae to the 2nd day of prepupa analyzed by qRT-PCR

2.4 原核表達及蛋白純化

根據(jù)Bm全長序列以及BmCat L蛋白親水性在線軟件分析，選取該基因ORF序列（除信號肽外的部分）設(shè)計特異性原核表達引物Bm-YH（表1），通過PCR得到一條長約為640 bp的目的DNA片段，將該片段測序，比對無誤后連接于H I和I酶切處理的pET-28原核表達載體，得到Bm-pET-28重組質(zhì)粒（圖5-A）。再經(jīng)雙酶切檢測，顯示得到一條約為630 bp的片段（圖5-A），與預(yù)期結(jié)果相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)化至Rosseta感受態(tài)菌株，經(jīng)多次條件試驗檢測，得到16℃時，IPTG終濃度為0.1或0.2 mmol·L-1，220 r/min搖菌轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)20 h后，可在破菌后的包涵體中獲得高表達量的目的蛋白，經(jīng)過15% SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖5-B箭頭所指。為了更進一步驗證純化過程中目的蛋白去向，分別檢測了純化過程中各個階段的蛋白收集品，結(jié)果如圖5-C所示，由于原核表達載體自帶His-Tag，所以為了進一步驗證原核表達產(chǎn)物為目標(biāo)蛋白，運用His抗體進行Western blot雜交試驗驗證，得到一條清晰可見、大小約為30 kD的目標(biāo)蛋白條帶（圖5-D）。最后，經(jīng)蛋白濃縮超濾膜用聚乙二醇濃縮后，得到了較為純凈的蛋白樣品。

A：pET-28-BmCat L原核表達載體的構(gòu)建The construction of the PET-28-BmCat L plasmid；M：核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA marker；1：pET-28空質(zhì)粒檢測結(jié)果pET-28-plasmid；2：BmCat L擴增產(chǎn)物PCR product of BmCat L；3：pET-28-BmCat L質(zhì)粒pET-28-BmCat L plasmid；4：pET-28-BmCat L質(zhì)粒酶切驗證The restriction enzyme digestion analysis of pET-28-BmCat L plasmid。B：16℃，IPTG濃度梯度下誘導(dǎo)20 h，pET-28-BmCat L的表達情況The expression of BmCat L plasmid were induced 20 h through different concentrations of IPTG at 16℃；M：彩色預(yù)染蛋白Marker Prestained color protein Marker；1、2：非誘導(dǎo)上清、沉淀Non-IPTG induced supernatant/sediment；3、4：0.05 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清、沉淀0.05 mmol·L-1 IPTG induced supernatant/sediment；5、6：0.1 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清、沉淀0.1 mmol·L-1 IPTG induced supernatant/sediment；7、8：0.2 mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo)上清、沉淀0.2 mmol·L-1 IPTG induced supernatant/sediment。C：16℃，0.1 mmol·L-1 IPTG條件誘導(dǎo)20 h，包涵體的His-鎳柱純化結(jié)果檢測The result detection of the purified inclusion body after being induced 20 h by 0.1 mmol·L-1 IPTG at 16℃；M：彩色預(yù)染蛋白Marker Prestained color protein Marker；1：穿透液Flowthrough；2：復(fù)平衡Rebalance；3：40 mmol·L-1咪唑40 mmol·L-1 imidazole；4：60 mmol·L-1咪唑60 mmol·L-1 imidazole；5：100 mmol·L-1咪唑（洗脫峰1）100 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 1)；6：100 mmol·L-1咪唑（洗脫峰2）100 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 2)；7：200 mmol·L-1咪唑（洗脫峰1）200 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 1)；8：200 mmol·L-1咪唑（洗脫峰2）200 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 2)；9：200 mmol·L-1咪唑（洗脫峰3）200 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 3)；10：200 mmol·L-1咪唑（洗脫峰4）200 mmol·L-1 imidazole (eluting peak 4)；11：濃縮后的蛋白泳道The protein after concentrated。D：運用His抗體通過Western blot檢測純化后的家蠶組織蛋白酶L Using His antibody to detect the purified protein by western blot；1、2：均為純化后的蛋白樣品Both 1 and 2 were protein samples

2.5 免疫應(yīng)激檢測

為了檢測BmCat L在免疫應(yīng)答中的作用，通過向5齡2 d處于盛食期的家蠶注射大腸桿菌和等體積的1×PBS，然后分別于不同時間點取血，待材料收齊后提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA，以1×PBS 組為對照組，qRT-PCR檢測其mRNA表達水平，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，對照組中，BmmRNA表達水平基本保持不變；而試驗組中，其mRNA的變化在短時間內(nèi)呈上升的趨勢，在12 h達到一個峰值，隨后又下降至一個常規(guī)水平。

t檢驗Student’s t-test：*P＜0.05; **P＜0.01; ***P＜0.001

3 討論

已有研究報道，組織蛋白酶L對細胞凋亡[27]、生物免疫等均有重要作用，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，研究者們投入了更多精力研究細胞凋亡以及免疫相關(guān)的機制，以期開發(fā)新的藥物和疾病治療手段；近年來發(fā)現(xiàn)溶酶體也與細胞凋亡有著密不可分的關(guān)系，而目前關(guān)于溶酶體與細胞凋亡的關(guān)系研究最多的是溶酶體中的組織蛋白酶，組織蛋白酶L也參與了相關(guān)的細胞凋亡過程。也有研究表明在T細胞的分選過程中組織蛋白酶L扮演著十分重要的角色。在細胞進行內(nèi)吞作用時，組織蛋白酶L可將MHCⅡ分子的恒定鏈迅速降解，然而降解下來的多肽始終會與MHCⅡ相結(jié)直到在分子伴侶H-2M的協(xié)同下才會分離[28]。Hou等[29]研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶L也會通過調(diào)節(jié)輔助T細胞Th17的分化從而間接地調(diào)控生物體的免疫作用；此外，在昆蟲的生長發(fā)育過程中，組織蛋白酶也起著極其重要的作用，組織蛋白酶作為重要的蛋白水解酶類，在線蟲、果蠅、棉鈴蟲、家蠶、二化螟等無脊椎動物中均檢測到了組織蛋白酶的表達。目前為止，關(guān)于哺乳動物組織蛋白酶的研究已相當(dāng)深入，而對于昆蟲組織蛋白酶的研究仍暫處于滯后階段。

通過檢索NCBI數(shù)據(jù)庫和家蠶基因資源庫，發(fā)現(xiàn)生物體普遍存在組織蛋白酶L。利用家蠶大造P50品種作為試驗材料，通過RACE和PCR技術(shù)成功獲得其全序列片段的克隆。為了探索組織蛋白酶L在家蠶中的作用，本研究檢測了Bm在幼蟲4齡4 d與5齡3 d血細胞、馬氏管、精巢等9種組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)其在家蠶血細胞、頭部、外表皮等均有表達，尤其在血細胞中表達值得注意，預(yù)測這種特異性的表達與家蠶血液系統(tǒng)的某些相關(guān)功能存在著不可分割的聯(lián)系。通過大腸桿菌添毒免疫應(yīng)激檢測，初步推論出BmCat L在家蠶血液免疫系統(tǒng)中的關(guān)聯(lián)作用。有研究顯示，組織蛋白酶L的功能行駛往往伴隨著其他組織蛋白酶的作用而進行，Shiba等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在家蠶化蛹期絲腺和脂肪體進行組織溶解時，組織蛋白酶B伴隨組織蛋白酶L一起表達，而參與到細胞的程序性死亡過程中去，在蛹期之后，幼蟲的脂肪體和腸道會被組織溶解以便形成成蟲的脂肪體，而在這其中，天冬氨酸組織蛋白酶D會伴隨著組織蛋白酶B在5齡幼蟲的脂肪體和蛹的腸道中大量表達[31]。因此，可以推測家蠶組織蛋白酶L與家蠶變態(tài)發(fā)育各齡期蛻皮化蛹也有關(guān)。

4 結(jié)論

從家蠶大造P50品種中克隆得到了家蠶組織蛋白酶L基因（Bm）的cDNA全序列，基因開放閱讀框全長687 bp，編碼228個氨基酸。表達分析顯示該基因特異性高表達于家蠶血細胞。通過原核表達和蛋白純化，成功獲得了該基因較高純度的重組蛋白。利用大腸桿菌刺激幼蟲能夠顯著上調(diào)該基因的表達量，由此推測組織蛋白酶L可能參與家蠶免疫反應(yīng)。

References

[1] Fabien L, Jadwiga K, Dieter B. Human and parasitic papain- like cysteine proteases: their role in physiology and pathology and recent developments in inhibitor design.,2002, 102(12): 4459-4488.

[2] ZHANG Q, HAN M, WANG W, SONG Y, CHEN G, WANG Z, LIANG Z. Downregulation of cathepsin L suppresses cancer invasion and migration by inhibiting transforming growth factor??mediated epithelial?mesenchymal transition., 2015, 33(4): 1851-1859.

[3] Shen J D, Cai Q F, Yan L J, Du C H, Liu G M, Su W J, Ke C, Cao M J. Cathepsin L is an immune-related protein in Pacific abalone ()-Purification and characterization., 2015, 47(2): 986-995.

[4] Lefebvre C, Vandenbulcke F, Bocquet B, Tasiemski A, Desmons A, Verstraete M, Salzet M, Cocquerelle C. Cathepsin L and cystatin B gene expression discriminates immune c?lomic cells in the leech., 2008, 32(7): 795-807.

[5] Dixit A K, Dixit P, Sharma R L. Immunodiagnostic/protective role of Cathepsin L cysteine proteinases secreted by., 2008, 154(3/4): 177-184.

[6] Santana B G, Dalton J P, Camargo F V, Parkinson M, Ndao M. The diagnosis of human fascioliasis by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using recombinant Cathepsin L protease., 2013,7(9): e2414.

[7] Wang W, Long L, Wang L, Tan C, Fei X, Chen L, Huang Q, Liang Z. Knockdown of Cathepsin L promotes radio sensitivity of glioma stem cells bothand., 2016, 371(2): 274-284.

[8] Turk V, Turk B, Gun?ar G, Turk D, Kos J. Lysosomal cathepsins: Structure, role in antigen processing and presentation, and cancer., 2002, 42(1): 285-303.

[9] Berdowska I. Cysteine proteases as disease markers., 2004, 342(1/2): 41-69.

[10] KAGEYAMA T, TAKAHASH1 S Y. Purification and characterization of a cysteine proteinase from silkworm eggs., 1990, 193(1): 203-210.

[11] Yamamoto Y, Takimoto K, Izumi S, Toriyama-Sakurai M, Kageyama T, Takahashi S Y. Molecular cloning and sequencing of cDNA that encodes cysteine proteinase in the eggs of the silkmoth,.1994, 116(6): 1330-1335.

[12] Shiba H, Uchida D, Kobayashi H, Natori M. Involvement of cathepsin B- and L-like proteinases in silk gland histolysis during metamorphosis of., 2001, 390(1): 28-34.

[13] Saikhedkar N, Summanwar A, Joshi R, Giri A. Cathepsins of lepidopteran insects: Aspects and prospects., 2015, 64: 51-59.

[14] He H J, Wang Q, Zheng W W, Wang J X, Song Q S, Zhao X F. Function of nuclear transport factor 2 and Ran in the 20E signal transduction pathway in the cotton bollworm,.,2010, 11: 1.

[15] 蘇晶晶, 陳思源, 張奎, 余霜, 李鈺添, 梁航華, 趙羽卒, 晁會娟, 崔紅娟. 家蠶組織蛋白酶O (BmCatO) 基因鑒定及表達分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(22): 4564-4573.

SU J J, CHEN S Y, ZHANG K, YU S, LI Y T, LIANG H H, ZHAO Y Z, CHAO H J, CUI H J. Identification and expression analysis of Cathepsin O gene in silkworm ()., 2015, 48(22): 4564-4573. (in Chinese)

[16] 張新剛, 于小華, 王時俊, 李雙杰，李高平, 陳瑞珍, 楊英珍. 擴張型心肌病心肌組織中組織蛋白酶L與心功能的關(guān)系. 中國臨床醫(yī)學(xué), 2005, 12(4): 566-568.

ZHANG X G, YU X H, WANG S J, LI S J, LI G P, CHEN R Z, YANG Y Z. Relationship between Cathepsin L and dilated cardiomyopathy.,2005, 12(4): 566-568. (in Chinese)

[17] 杜九中, 于小華, 呂建華, 鄧暉, 李雙杰, 趙剛, 趙新剛, 王時俊, 陳瑞珍, 楊英珍. 溶酶體組織蛋白酶 L在小鼠病毒性心肌炎心肌組織中表達及意義. 臨床兒科雜志, 2005, 23(6): 388-390.

DU J Z, YU X H, Lü J H, DENG H, LI S J, ZHAO G, ZHAO X G, WANG S J, CHEN R Z, YANG Y Z. The expression and significance of lysosome cathepsin L in the cardiac tissue of viral myo-carditis in mice., 2005, 23(6): 388-390. (in Chinese)

[18] 王峻, 劉穎嫻, 李向平, 彭道泉, 譚崢, 劉鴻敏, 秦英楠, 薛彥瓊. 組織蛋白酶L與冠心病及其危險因素的相關(guān)性. 中南大學(xué)學(xué)報 (醫(yī)學(xué)版), 2009, 34(2): 130-134.

WANG J, LIU Y X, LI X P, PENG D Q, TAN Z, LIU H M, QIN Y N, XUE Y Q. Association of cathepsin L with coronary heart disease and its risk factors., 2009, 34(2): 130-134. (in Chinese)

[19] Kitamoto S, Sukhova G K, Sun J, Yang M, Libby P, Love V, Duramad P, Sun C, Zhang Y, Yang X, Peters C, Shi G P. Cathepsin L deficiency reduces diet-induced atherosclerosis in low-density lipoprotein receptor-knockout mice., 2007, 115(15): 2065-2075.

[20] Kos J, Lah T T. Cysteine proteinases and their endogenous inhibitors: target proteins for prognosis, diagnosis and therapy in cancer (review)., 1998, 5: 1349-1361.

[21] Tagami K, Kakegawab H, Kamioka H, Sumitani K, Kawataa T, LenarEiE B, Turk V, Katunumab N. The mechanisms and regulation of procathepsin L secretion from osteoclasts in bone resorption., 1994, 342(3): 308-312.

[22] Fagotto F, Maxfield F R. Yolk platelets inmaintain an acidic internal pH which may be essential for sodium accumulation., 1994, 125(5): 1047-1056.

[23] Chauhan S S, Goldstein L J, Gottesman M M. Expression of cathepsin L in human tumors., 1991, 51(5): 1478-1481.

[24] Fr?hlich E, Schlagenhauff B, M?hrle M, Weber E, Klessen C, Rassner G. Activity, expression, and transcription rate of the cathepsins B, D, H, and L in cutaneous malignant melanoma., 2001, 91(5): 972-982.

[25] Kageshita T, Yoshii A, Kimura T, Maruo K, Ono T, Himeno M, Nishimura Y. Biochemical and immunohistochemical analysis of cathepsins B, H, L and D in human melanocytic tumours., 1995, 287(3/4): 266-272.

[26] Lah T T, Calaf G, Kalman E, Shinde B G, Somers R, Estrada S, Salero E, Russo J, Daskal I. Cathepsins D, B, and L in transformed human breast epithelial cells.,1996, 39(2): 221-233.

[27] Yang C, Lin X W, Xu W H. Cathepsin L participates in the remodeling of the midgut through dissociation of midgut cells and activation of apoptosis via caspase-1., 2017, 82: 21-30.

[28] Wolf P R, Ploegh H L. How MHC class II molecules acquire peptide cargo: biosynthesis and trafficking through the endocytic pathway., 1995, 11: 267-306.

[29] Hou L, Cooley J, Swanson R, Ong P C, Pike R N, Bogyo M, Olson S T, Remold-O’Donnell E. The protease cathepsin L regulates Th17 cell differentiation., 2015, 65: 56-63.

[30] Shiba H, Uchida D, Kobayashi H. Involvement of Cathepsin B- and L-Like proteinases in silk gland histolysis during metamorphosis of., 2001, 390(1): 28-34.

[31] Lee K S, Bo Y K, Choo Y M. Expression profile of cathepsin B in the fat body ofduring metamorphosis., 2009, 154(2): 188-194.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Identification, Expression, and Functional Analysis ofin Silkworm ()

PAN GuangZhao, ZHANG Kui, LI ChongYang, ZHAO YuZu, SHEN Li, XU Man, SU JingJing, LIN Xi, CUI HongJuan

(State Key Laboratory of Silkworm Biology, Southwest University, Chongqing 400716)

【Objective】The objective of this study is to identify and clone the Bm(Bm) from silkworm (), investigate its sequence features and expression profiles, and to clarify the response of Bmunderstimulate in. Results of the study will provide a theoretical basis for further studying the function of Bmin.【Method】The primers was designed based on the sequence of BGIBMGA006893 in SilkDB database. The full length cDNA of Bmwas acquired by RACE (rapid-amplification of cDNA ends) technology. The protein structure and molecular weight waspredicted online. About the homologous sequences of Cathepsin L from other species were downloaded from NCBI, and the deduced amino acid sequence of putative Bmwas aligned using the Clustal X (1.83) software, phylogenetic tree was constructed using MEGA 6.0. Its expression profile was performed by RT-PCR and qRT-PCR. Specific primers were designed to amplify the high specificity fragment, and then the PCR product was ligated to the PET-28 vector, which was transformed into RosettaThe recombinant protein was induced by IPTG and purified by Ni+affinity chromatography. Finally, the immune response was challenged byIts relative mRNA level was detected by qRT-PCR.【Result】Bmwas clustered on nscaf2860 which was located on chromosome 10, and the gene number in silkDB was BGIBMGA006893. Full length of its ORF is 687 bp, encoding 228 amino acids, there is a conservative Pept_C1 domain structure. The molecular weight and isoelectric point of the deduced protein is 26.132 kD and 4.57, respectively. Phylogenetic analysis showed that it is close to its homologous protein fromandRT-PCR results showed that Bmwas specifically and highly expressed in haemocyte. The recombinant protein of Bmwas produced and purified, and finally verified by His-antibody. The immune challenge experiments results revealed the relationship between Cathepsin L gene and its immune system in.【Conclusion】 TheBmcDNA was cloned. It was specific highly expressed in haemocytes. The recombinant proteins were obtained through prokaryotic expression and protein purification. More importantly, the expression of Bmwas significantly increased after treating within haemocytes. It is speculated that Bmmight be involved in the immune response of.

Bm;; gene cloning; prokaryotic expression; protein purification; immune challenge

2017-03-07；接受日期：2017-04-26

國家自然科學(xué)基金（31672496）、重慶自然科學(xué)基金（cstc2016jcyjA0425）、重慶高校創(chuàng)新團隊建設(shè)計劃（CXTDX201601010）

潘光照，Tel：023-68251712；E-mail：m18983708534_2@163.com。張奎，E-mail：zhangk87@163.com。潘光照和張奎為同等貢獻作者。通信作者崔紅娟，Tel：023-68251713；E-mail：Hongjuan.cui@gmail.com；hcui@swu.edu.cn