孟明輝，賀澤英，徐亞平，王璐，彭祎，劉瀟威

（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定土壤中20種抗生素

孟明輝，賀澤英，徐亞平，王璐，彭祎，劉瀟威*

（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191）

為建立一種基于QuEChERS（快速Q(mào)uick、簡單Easy、廉價(jià)Cheap、高效Effective、耐用Rugged、安全Safe）同時(shí)測定土壤中20種抗生素多殘留的分析方法，土樣經(jīng)提取液（EDTA，乙腈∶磷酸鹽）提取、分散固相萃取材料（PSA，C18）凈化后，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行測定。通過試驗(yàn)優(yōu)化了不同提取方法、凈化吸附劑比。結(jié)果表明：該方法在7個(gè)添加水平（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·kg-1）下具有良好的回收率，回收率范圍為61.4%～118.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%（n=5）；絕大多數(shù)抗生素的方法定量限為2.0～5.0 μg·kg-1，R2大于0.990。該方法可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)土壤樣品的檢測。

QuEChERS；抗生素；多殘留分析；土壤；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

抗生素被廣泛用于大批量養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，能保護(hù)動(dòng)物免受疾病[1，3]，但它也可以通過動(dòng)物排泄以有機(jī)肥形式進(jìn)入到環(huán)境土壤和周圍的水體中[2]。在近四五十年中，這些藥物的使用量不斷增加，造成了重大的環(huán)境問題，因而備受關(guān)注。近年來，抗生素已經(jīng)被認(rèn)為是一種新型的潛在污染物[4-6]。

盡管在土壤環(huán)境基質(zhì)中已發(fā)現(xiàn)了多種抗生素藥物，但仍未有土壤中抗生素多殘留的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。由于土壤基質(zhì)的復(fù)雜性，很難從土壤中提取抗生素[7]。為了評(píng)價(jià)抗生素的環(huán)境影響，需要建立一種可靠、準(zhǔn)確的檢測土壤環(huán)境中抗生素的方法。

傳統(tǒng)環(huán)境樣品中抗生素的提取方法是基于使用乙腈-磷酸鹽超聲提取，結(jié)合固相萃?。⊿PE）凈化。Blackwell等[8]利用超聲波輔助法提取，固相萃取凈化土壤和豬糞中的獸藥抗生素，馬麗麗等[9]建立超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定土壤中18種抗生素，這兩種方法具有良好的回收率、低的定量限，然而超聲波提取和多次重復(fù)提取比較耗時(shí)。

在已有的凈化方法中，固相萃取因其較好的凈化效果和較高的回收率被廣泛應(yīng)用于土壤、糞便、牛奶和動(dòng)物組織等基質(zhì)中[10-13]。雖然固相萃取具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是其步驟繁瑣、耗時(shí)，并且材料昂貴。2003年Anastassiades等[14]建立了一種快速、簡單、廉價(jià)、高效、安全的方法，即QuEChERS方法，最初是用于蔬果類農(nóng)藥殘留的提取、凈化，近年來，它也被用于抗生素的多殘留分析中[15-17]。這種方法采用乙腈提取，經(jīng)分散固相萃取材料（d-SPE），如PSA（PrimarySecondaryAmine）、C18（Octadecylsilane）、GCB（Grafted Carbon Black）的凈化，然后上機(jī)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是具有簡單的前處理步驟、高的回收率、準(zhǔn)確的測定結(jié)果，并且大幅降低了材料和試劑的成本以及實(shí)驗(yàn)人員接觸有害溶劑的可能性。Bourdat-Deschamps等[18]建立了環(huán)境水樣中抗生素的QuEChERS方法，回收率一般在75.0%以上。Dorival-García等[19]建立了QuEChERS方法用于檢測堆肥中17種抗生素，回收率范圍為95.3%～106.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于7.0%。但是，在土壤基質(zhì)中抗生素多殘留的QuEChERS分析方法尚未見報(bào)道。

本研究的目的是建立一種檢測土壤基質(zhì)中20種抗生素的QuEChERS方法。研究內(nèi)容包括：色譜條件、提取步驟、凈化步驟的優(yōu)化，并通過回收率、線性、定量限、基質(zhì)效應(yīng)、實(shí)際樣品的檢測驗(yàn)證所建立方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺醋酰（Sulfacetamide，SAA），磺胺二甲異嘧啶（Sulfisomidine，SIM），磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ），磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ），磺胺砒啶（Sulfapyridine，SPD），磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine， SMR），磺胺對(duì)甲氧嘧啶（Sulfameter，SME），磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDD），磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT），磺胺鄰二甲氧嘧啶（Sulfadoxin，SDX），磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ），磺胺噁唑（Sulfamoxole，SMX），磺胺間甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM），磺胺二甲異噁唑（Sulfisoxazole，SIX），磺胺苯酰（Sulfabenzamide，SBA），磺胺喹惡啉（Sulfaquinoxaline，SQX），磺胺間二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM），紅霉素（Erythromycin，ERY），羅紅霉素（Roxithromycin，ROX），克拉霉素（Clarithromycin，CLR），標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于98.0%，購于德國DrEhrenstorfer公司。上述標(biāo)準(zhǔn)品均使用甲醇配制成1000 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存。用甲醇配制上述20種抗生素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1 mg·kg-1，-20℃儲(chǔ)存。

1.2 材料與試劑

甲醇和乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司），甲酸（98.0%，Acros Organics公司），Na2EDTA·2H2O（分析純，國藥有限公司）；磷酸，氯化鈉（天津化學(xué)試劑公司）。實(shí)驗(yàn)用水均經(jīng)Milli-Q凈水系統(tǒng)凈化。分散固相萃取材料（PSA、C18、GCB）購于Agilent公司，HLB固相萃取小柱（500 mg，6 mL）購于Waters公司。磷酸鹽緩沖液（27.2 g KH2PO4與1.3 mL H3PO4用超純水定容至1 L）。

1.3 儀器

渦旋振蕩器（美國Thermo公司）；高速冷凍離心機(jī)（香港Heal Force公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；Acquity高效液相色譜儀，C18色譜柱（1.8 μm；2.1 mm×100 mm,美國Waters公司）；Qtrap 4500三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）。

1.4 色譜條件

液相條件：柱溫40℃，流動(dòng)相為乙腈（A）、0.1%甲酸（B），流速0.3 mL·min-1；流動(dòng)相梯度為0～1.5 min 10%A，1.5～8 min 10%～70%A，8～8.1 min 70%～10%A，8.1～10 min 10%A。

質(zhì)譜條件：離子噴霧電壓4.5 kV；離子源溫度500℃；離子源氣體1（GS1）50 psi（1 psi=6.89 kPa）；離子源氣體2（GS2）50 psi；采用正離子檢測模式。目標(biāo)抗生素的保留時(shí)間、離子對(duì)、去簇電壓、碰撞能等質(zhì)譜條件見表1。

1.5 土壤樣品的制備

土樣采自天津市西青區(qū)農(nóng)田0～20 cm的表層土壤（經(jīng)檢測未含目標(biāo)抗生素），在直徑2.0 m左右的范圍內(nèi)取樣約10.0 kg，自然風(fēng)干后過2.0 mm孔徑篩。土壤pH 7.2，有機(jī)質(zhì)含量1.5%。

1.6 提取和凈化步驟

QuEChERS方法步驟：稱取5.0 g土樣于50 mL離心管中，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，靜置一段時(shí)間，然后加入0.4 g Na2EDTA、10.0 mL緩沖液和10.0 mL乙腈，劇烈搖晃3 min，再加入2.0 g NaCl繼續(xù)手搖1 min，8000 r·min-1離心5 min；吸取2.0 mL上清液于5.0 mL含有分散固相萃取材料（25.0 mg PSA、10.0 mg C18、100.0 mg MgSO4）的離心管中，渦旋1 min，5000 r· min-1離心3 min，吸取1.0 mL上清液于玻璃離心管中，在35℃水浴中氮吹至近干，1.0 mL甲醇∶水（體積比1∶1）復(fù)溶，過0.22 μm纖維濾膜，LC-MS/MS上機(jī)。方法優(yōu)化時(shí)，每組另加兩個(gè)全程序空白平行樣（上機(jī)之前加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液），以校正各待測化合物在土壤基質(zhì)中存在的不可忽略的基質(zhì)效應(yīng)。

SPE方法步驟：稱取5.0 g土壤樣品于50 mL離心管中，加入0.4 g Na2EDTA、10.0 mL緩沖液和10.0 mL乙腈，手搖3 min，8000 r·min-1離心5 min，將上清液全部倒入球形瓶，然后旋蒸至10.0 mL以下，再用超純水稀釋至100 mL，用甲酸調(diào)節(jié)pH至2.5，開始過HLB小柱，過柱前，預(yù)先用6.0 mL甲醇、6.0 mL超純水活化SPE小柱。過柱后，用6.0 mL甲醇洗脫HLB柱，將洗脫液氮吹至近干，后同QuEChERS方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

采用超聲輔助提取可提高目標(biāo)物的回收率[2]，本試驗(yàn)對(duì)該方法的效果進(jìn)行了驗(yàn)證。按文1.6中QuEChERS方法步驟進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果（圖1）表明超聲對(duì)目標(biāo)抗生素的提取幾乎沒有影響。因此，本試驗(yàn)不采用超聲輔助提取，進(jìn)而節(jié)約前處理時(shí)間。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

提取完成后，為減少基質(zhì)效應(yīng)，將含有目標(biāo)抗生素的有機(jī)相加入到d-SPE凈化材料（PSA、C18、GCB）中進(jìn)行下一步凈化。PSA作為弱陰離子交換劑，可以形成強(qiáng)相互作用的氫鍵，并去除脂肪酸和其他極性有機(jī)酸；非極性吸附劑C18反相吸附脂肪和一些礦物質(zhì)；GCB保留平面物質(zhì)，用于去除色素[19，22-23]。無水硫酸鎂作為傳統(tǒng)干燥劑用于去除有機(jī)溶劑殘留的水。如圖2所示，在添加濃度為100.0 μg·kg-1水平下，選用5.0 mg GCB、100.0 mg MgSO4作為凈化材料得到較低的回收率。其中，GCB對(duì)磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺噁唑、磺胺二甲異噁唑、磺胺間二甲氧嘧啶有少量吸附，回收率約60.0%，特別是對(duì)紅霉素具有強(qiáng)烈的吸附作用，回收率為0.6%。因此，本試驗(yàn)沒有選擇GCB，而是選用PSA和C18作為凈化材料。本試驗(yàn)對(duì)這兩種凈化材料分別設(shè)計(jì)了3個(gè)水平：C18（10.0、25.0、50.0 mg），PSA（10.0、25.0、50.0 mg）。為優(yōu)化到其最佳配比，回收率和基質(zhì)效應(yīng)必須同時(shí)考慮?；|(zhì)效應(yīng)（Matrix Effects，ME）計(jì)算公式[24]如下：

表1 目標(biāo)抗生素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized chromatographic parameters for the selected antibiotics

式中：Sm和Ss分別表示基質(zhì)標(biāo)曲和溶劑標(biāo)曲的斜率。

當(dāng)ME為-20.0%～20.0%、-50.0%～-20.0%和20.0%～50.0%、＜-50.0%和＞50.0%時(shí)，分別表示輕微、中等、較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。

如圖3至圖6所示，當(dāng)選擇50.0 mg PSA作為凈化材料時(shí)，磺胺醋酰、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺噁唑的回收率低于55.0%。對(duì)于C18，三組基質(zhì)效應(yīng)均低于60.0%，大多數(shù)低于40.0%，但使用10.0 mg C18時(shí)的回收率均大于65.0%。所以，本試驗(yàn)最終選擇25.0 mg PSA、10.0 mg C18作為凈化材料。圖7為最終優(yōu)化后的基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 與SPE方法的比較

圖1 超聲和不超聲的回收率對(duì)比Figure 1 The comparison of recoveries with and without ultrasonic bath

本研究將QuEChERS方法和傳統(tǒng)SPE方法進(jìn)行了回收率對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。對(duì)于絕大多數(shù)抗生素而言，QuEChERS方法的回收率大于SPE方法，尤其是磺胺二甲異惡唑和紅霉素。

實(shí)際試驗(yàn)過程對(duì)比表明，QuEChERS方法簡單的前處理步驟僅耗時(shí)1 h，較SPE方法5 h大為縮短；QuEChERS方法單個(gè)樣品比SPE方法節(jié)省約70元（主要節(jié)省了Waters Oasis HLB小柱）；QuEChERS方法整個(gè)流程的試劑基本處于封閉狀態(tài)，很大程度上降低了實(shí)驗(yàn)人員接觸有害溶劑的可能性。試驗(yàn)證明，對(duì)于本試驗(yàn)所選定的目標(biāo)抗生素，QuEChERS方法優(yōu)于SPE方法。

2.4 方法驗(yàn)證

本試驗(yàn)通過線性、回收率和定量限對(duì)QuEChERS方法進(jìn)行了驗(yàn)證。

由空白基質(zhì)配制的8個(gè)濃度水平（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg·kg-1）的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線呈現(xiàn)良好的線性，R2在0.990～0.998之間（表2）。

在7個(gè)添加濃度水平（2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0μg·kg-1）下得到的回收率為61.4%～118.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差低于20.0%。

圖2 使用5.0 mg GCB作為d-SPE凈化材料時(shí)20種抗生素的回收率Figure 2 Recoveries of 20 antibiotics using 5.0 mg GCB as d-SPE sorbent

圖3 不同PSA加入量的基質(zhì)效應(yīng)Figure 3 ME of different masses of PSA as d-SPE sorbent

圖4 不同C18加入量的基質(zhì)效應(yīng)Figure 4 ME of different masses of C18as d-SPE sorbent

圖5 不同PSA加入量下20種抗生素的回收率Figure 5 The recoveries of 20 antibiotics using different masses of PSA as d-SPE sorbent

該方法的定量限取值為具有可接受的回收率（60.0%～120.0%）和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（小于20.0%）時(shí)的最低濃度。本試驗(yàn)所選取的目標(biāo)抗生素的定量限大部分都低于5.0 μg·kg-1，比Peysson等[25]所報(bào)道的值低。在10.0、50.0、200.0 μg·kg-1添加濃度下的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差、定量限見表3。

2.5 實(shí)際樣品檢測

在天津市東麗區(qū)菜地共采集10個(gè)土樣：Q-1茄子地，Q-2甘藍(lán)地，Q-3菠菜地，Q-4紅薯地，Q-5花菜地，Q-6大白菜地，Q-7污灌區(qū)，Z-1、C-1、F-1為玉米地。每個(gè)樣品約500 g，自然風(fēng)干后過2.0 mm孔徑篩，隨后用本研究建立的QuEChERS方法進(jìn)行檢測，其中8個(gè)土樣有檢出，大部分檢出抗生素低于定量限，Q-2中羅紅霉素濃度高于定量限，濃度為3.7 μg· kg-1，Q-1和Q-5中克拉霉素濃度高于定量限，濃度分別為2.9、2.4 μg·kg-1。羅紅霉素和克拉霉素這兩種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在土壤中降解較慢，吸附性較強(qiáng)[24]，可較長時(shí)間穩(wěn)定地殘留在土壤基質(zhì)中。上述結(jié)果表明，本方法可應(yīng)用于土壤中抗生素含量的檢測。

圖6 不同C18加入量下20種抗生素的回收率Figure 6 The recoveries of 20 antibiotics using different masses of C18as d-SPE sorbent

圖7 使用優(yōu)化后的凈化材料得到的20種抗生素的基質(zhì)效應(yīng)Figure 7 The matrix effects of the optimized combination adsorbents for 20 analytes

圖8 QuEChERS方法與SPE方法的回收率對(duì)比Figure 8 The recoveries of 20 antibiotics using QuEChERS and SPE

3 結(jié)論

（1）通過對(duì)提取方式、凈化材料用量及配比的優(yōu)化，并進(jìn)行方法的驗(yàn)證，建立了基于QuEChERS方法同時(shí)檢測土壤中20種抗生素多殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。

（2）對(duì)于所選定的目標(biāo)抗生素，QuEChERS方法優(yōu)于SPE方法，體現(xiàn)了快速、簡單、廉價(jià)等特點(diǎn)。

（3）QuEChERS方法現(xiàn)已成功應(yīng)用于土壤中多種抗生素含量的檢測，可為環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供一定的數(shù)據(jù)支持。

表2 20種抗生素的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)。Table 2 Linear equation，linear range and R2of 20 antibiotics

表3 20種抗生素在10.0、50.0、200.0 μg·kg-1添加濃度下的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）和定量限Table 3 LOQs，recoveries and RSDs（n=5）of 20 antibiotics for soil spiked at 10.0，50.0 and 200.0 μg·kg-1

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GUO Xin-yan,WANG Na,HAO Li-jun,et al.Simultaneous extraction and determination of 25 antibiotics in water,soils and manure using chromatography-tandem mass spectrometry[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,2015,43（1）：13-20.

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Simultaneous extraction and determination of antibiotics in soils using a QuEChERS-based method and liquid chromatography-tandem mass spectrometry

MENG Ming-hui,HE Ze-ying,XU Ya-ping,WANG Lu,PENG Yi,LIU Xiao-wei*
（Agro-Environmental Protection Institute,Ministry of Agriculture,Tianjin 300191,China）

The aim of this work was to develop a method,based on QuEChERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe）,to extract and analyze residues of 20 antibiotics in soil.The developed method included extraction with an ACN∶EDTA∶McIlvaine buffer,clean-up with a dispersive solid phase extraction（d-SPE）adsorbent using primary secondary amine（PSA）and octadecylsilane（C18）,and finally analyte determination using liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）.This work optimized different extraction methods and ratios of clean-up adsorbents to perform at seven spiking levels（2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,and 200.0 μg·kg-1）with recoveries ranging from 61.4%to 118.9%with relative standard deviations below 20%（n=5）.The limits of quantification（LOQ）of the methods were in the range of 2.0～5.0 μg·kg-1for most analytes.Linear regression coefficients of greater than 0.990 were obtained.This method was applied to the analysis of real agricultural soil samples,confirming the feasibility of the method.

QuEChERS;antibiotics;multi-residue analysis;soil;LC-MS/MS

X833

A

1672-2043（2017）08-1672-08

10.11654/jaes.2017-0249

2017-03-01

孟明輝（1991—），男，山東菏澤人，碩士研究生，從事農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測與評(píng)價(jià)研究。E-mail：313133898@qq.com

*通信作者：劉瀟威E-mail：xwliu2006@163.com

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目

Project supported：The Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences

孟明輝，賀澤英，徐亞平，等.QuEChERS方法結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定土壤中20種抗生素[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào),2017,36（8）：1672-1679.

MENG Ming-hui,HE Ze-ying,XU Ya-ping,et al.Simultaneous extraction and determination of antibiotics in soils using a QuEChERS-based method and liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（8）：1672-1679.