趙春臨 董志遠(yuǎn) 余洋 張紅雨 李鵬輝 王水生 丁朝輝 徐化楠

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胃腸外科 河南 鄭州 450052)

胃癌組織氨基酸代謝的研究

趙春臨 董志遠(yuǎn) 余洋 張紅雨 李鵬輝 王水生 丁朝輝 徐化楠

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胃腸外科 河南 鄭州 450052)

目的觀察胃癌組織、癌旁正常組織氨基酸譜的變化規(guī)律。方法使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)40例胃癌患者癌組織、癌旁正常組織19種氨基酸的含量。結(jié)果Ⅰ、Ⅱ期胃癌組織中氨基酸含量與癌旁正常組織相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中氨基酸與癌旁正常組織相比，蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺的含量增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中多種氨基酸含量升高，表明胃癌組織存在明顯的氨基酸代謝異常，這種代謝異?？蔀榘被崾Ш獐煼ㄌ峁┡R床依據(jù)。

胃癌；氨基酸；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；氨基酸失衡療法

盡管胃腫瘤相關(guān)性的死亡率已經(jīng)有所下降，但是胃癌仍是第四最常見的癌癥類型和全球癌癥死亡的第二大原因[1]。由于大部分胃癌患者確診時(shí)已經(jīng)是中晚期，所以其常表現(xiàn)出不同程度的營(yíng)養(yǎng)不良，并伴隨嚴(yán)重的蛋白質(zhì)-氨基酸代謝紊亂，導(dǎo)致患者體力下降，免疫力低下，在放化療時(shí)由于副反應(yīng)又常常進(jìn)食不足，進(jìn)一步加重營(yíng)養(yǎng)不良，患者在此狀態(tài)下接受治療，治療效果可能有所折扣，并帶來各種并發(fā)癥，加速患者死亡[2]。因此，營(yíng)養(yǎng)支持對(duì)于胃癌患者異常重要。如何制定合理的營(yíng)養(yǎng)治療方案，制成某種氨基酸過量或減少乃至缺失的不平衡氨基酸(amino acid imbalance，AAI)，既能抑制腫瘤生長(zhǎng)，又能改善患者營(yíng)養(yǎng)狀況，即采用氨基酸失衡療法，以補(bǔ)充支持現(xiàn)有的胃癌治療手段，是胃癌綜合治療需要探索的一個(gè)重要方面[3]。本研究通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法檢測(cè)胃癌患者癌灶、癌旁組織游離氨基酸含量，了解胃癌氨基酸代謝輪廓的改變，為胃癌患者氨基酸失衡療法提供臨床依據(jù)。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象檢測(cè)標(biāo)本取自2015年12月至2016年4月鄭大一附院住院手術(shù)的40例胃癌患者。其中男29例，女11例，年齡25～77歲，平均59.7歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)17.3～26.2 kg/m2，BMI平均值為22.6 kg/m2。術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)胃管狀腺癌36例，印戒細(xì)胞癌4例。術(shù)后病理分期Ⅰ期、Ⅱ期各6例， Ⅲ期9例 ，Ⅳ期19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均行胃鏡及活檢病理、全腹部CT掃描、上消化道鋇餐造影、心電圖、血生化檢查及術(shù)后常規(guī)病理檢查；術(shù)前均未接受放化療；肝腎功、心電圖及其他生化指標(biāo)正常，無內(nèi)分泌及代謝性疾病。

1.2實(shí)驗(yàn)方法共測(cè)量19種游離氨基酸的含量，其中必需氨基酸(essential amino acid，EAA)7種，分別為：纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)及蘇氨酸(Thr)；非必需氨基酸(nonessential amino acid，NEAA)12種，分別為：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、門冬氨酸(Asp)、胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、組氨酸(His)、鳥氨酸(Orn)、脯氨酸(Pro)、絲氨酸(Ser)和酪氨酸(Tyr)。具體實(shí)驗(yàn)方法如下。

1.2.1標(biāo)本取材方法 術(shù)中取胃癌標(biāo)本時(shí)，取癌灶組織+癌旁組織(距離癌灶邊緣5 cm以上，在同一水平面上，組織重量需>1 g)，放于5 ml離心管中，迅速使用冰鹽水洗滌3次，除去血污(放于燒杯中清洗)，隨后使用濾紙吸干并轉(zhuǎn)移至凍存管中，后將凍存管存放于液氮中。

1.2.2標(biāo)本上機(jī)前處理 將組織(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇中，勻漿(A) ，隨后在16 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min(B)，取上清，加入120 μl的50%甲醇，重懸獲得極性成分后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)；或者將組織(50 mg)加入1.5 ml冰冷的50%甲醇，勻漿(A)，然后在16 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min(B)，在獲得的沉淀中加入1.6 ml CHCl2∶乙腈(3∶1)，重復(fù)A、B操作，隨后揮干上清，加入120 μl的50%甲醇重懸，獲得非極性成分，最后上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器參數(shù)設(shè)定①超高效液相色譜(UPLC)條件：本實(shí)驗(yàn)使用的液相色譜儀為Dionex的UltiMate 3000包括液相泵(HPG-3400 SD)、柱溫箱(TCC-3000 SD)和自動(dòng)進(jìn)樣器(WPS-3000SL)，組織樣品采用ACQUITY ULC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)及UPLC C18 保護(hù)柱(2.1 mm×5 mm)(Water 中國(guó)有限公司)進(jìn)行檢測(cè)，柱溫為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃，流動(dòng)相A為水+0.1%甲酸，B為乙腈+0.1%甲酸(見表1)。②質(zhì)譜條件：質(zhì)譜檢測(cè)所用的儀器為Thermo公司生產(chǎn)的四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q Exactive)，離子源為加熱型電噴霧(HESI)，掃描模式分別為ESI+，離子源溫度為300 ℃，噴霧電壓為3.6 kV，傳輸毛細(xì)管溫度為320 ℃，鞘氣流速為40 arb，輔助氣流速為10 arb；掃描模式為Full MS，F(xiàn)ull MS/dd-MS2，掃描質(zhì)量范圍為60～900 m/z，一級(jí)掃描和二級(jí)掃描分辨率分別為70 000和17 500。

表1 組織樣品流動(dòng)相梯度洗脫條件

2 結(jié)果

2.1胃癌與癌旁正常組織中氨基酸含量的對(duì)比胃癌組織中Val、Met、Thr、Gln、Gly、Pro含量高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，EAA、NEAA、TAA含量也高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織與癌旁正常組織氨基酸含量對(duì)比Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gln、Gly、Ser含量高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且EAA、NEAA、TAA含量均增加(P<0.05)。見表3。

表2 胃癌組織與癌旁正常組織游離氨基酸含量的變化

注：EAA，必需氨基酸；NEAA，非必需氨基酸；TAA，總氨基酸。

3 討論

平衡氨基酸的營(yíng)養(yǎng)支持對(duì)腫瘤的促增值作用，以及不平衡氨基酸對(duì)腫瘤的抑制作用，使得更多關(guān)于不平衡氨基酸與腫瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究被進(jìn)一步深入開展[4]。本研究結(jié)果表明，在Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中多種游離氨基酸含量明顯增高，且EAA、NEAA、TAA含量均高于癌旁正常組織，腫瘤組織的高氨基酸含量可能反應(yīng)腫瘤組織對(duì)氨基酸需求較高以進(jìn)行能量代謝、核酸及新的蛋白質(zhì)合成，并且癌組織游離氨基酸的變化與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)。同時(shí)Ⅲ、Ⅳ期腫瘤組織中Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln的顯著增加可能提示腫瘤組織對(duì)這幾種氨基酸的特殊需求，正常組織中的一些非必需氨基酸可能就是腫瘤組織的必需氨基酸，這也是氨基酸失衡療法的理論基礎(chǔ)[5]。國(guó)內(nèi)關(guān)于癌癥患者癌組織內(nèi)游離氨基酸譜的變化已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，各類惡性腫瘤細(xì)胞的代謝規(guī)律也不盡相同，有其不同而又特殊的游離氨基酸代謝改變[6]。王倩等[7]研究發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織游離氨基酸含量出現(xiàn)特征性病理改變：Ⅲ期TAA含量增加，Thr、Met、Ile、Leu、Val、Ala、Tyr、Pro、Ser、Gly含量增加；Ⅳ期TAA含量增加，Met、Leu、Thr、Ile、Asp、Gly、Pro、Ser及Glu含量增加。王亮等[8]研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織游離Gln、Arg、Met含量較正常胃黏膜明顯增高，而Ala、Try含量較正常胃黏膜降低。

表3 Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織與癌旁正常組織氨基酸含量比較

腫瘤組織對(duì)糖的需求增加，宿主細(xì)胞只能通過分解蛋白質(zhì)提供大量的氨基酸，糖異生可達(dá)到此目的。Pro、Thr、Ser、Val、Met及Gln均是生糖氨基酸，故在腫瘤組織中增加。Met是含硫必需氨基酸，是體內(nèi)物質(zhì)代謝的主要甲基供體，參與眾多活性物質(zhì)的甲基化反應(yīng)，而腫瘤組織在分化過程中需要大量的Met進(jìn)行甲基化[9]。Val是一種支鏈氨基酸，為腫瘤生長(zhǎng)代謝所必需。He等[10]研究發(fā)現(xiàn)去Val和去Met均能抑制荷瘤大鼠腫瘤的生長(zhǎng)。去除Val抑癌效果雖明顯，但最大的不良反應(yīng)是脂肪肝的發(fā)生率高，宿主也會(huì)出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、腹瀉、低蛋白血癥等癥狀[11]。

腫瘤生長(zhǎng)時(shí)明顯改變了宿主的蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，并導(dǎo)致機(jī)體不同程度的營(yíng)養(yǎng)不良。本研究認(rèn)為，在胃癌的氨基酸失衡液中應(yīng)減少Thr、Tyr、Val、Pro、Met、Gly、Ser及Gln等氨基酸的含量，使得它們?cè)谥С炙拗鞯耐瑫r(shí)又不會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，甚至抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但同時(shí)必須重視氨基酸最低需要量的問題。目前，氨基酸失衡療法抗腫瘤的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，氨基酸相關(guān)研究的目的正朝著增強(qiáng)抗癌藥物的敏感性、改善患者代謝和增強(qiáng)免疫功能的方向發(fā)展。因此，在深入了解胃癌組織與癌旁正常組織代謝差異的基礎(chǔ)上結(jié)合臨床，尋找更加合理的氨基酸失衡液的組成及含量，才能更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)并改善患者的代謝。

[1] Li D,Xu C Y,Cui R J,et al.DNA methylation inhibitor, decitabine, promotes MGC803 gastric cancer cell migration and invasion via the upregulation of NEDD41[J].Mol Med Rep,2015,12(6):8201-8208.

[2] Roth E,Druml W.Plasma amino acid imbalance: dangerous in chronic diseases [J].Curr Opin Clin Nutr Metab Care,2011,14(1):67-74.

[3] Heys S D,Park K G,McNurlan M A,et al.Stimulation of protein synthesis in human tumours by parenteral nutrition: evidence for modulation of tumour growth[J].Br J Surg,1991,78(4):483-487.

[4] Kawaguchi T,Shiraishi K,Ito T,et al.Branched-chain amino acids prevent hepatocarcinogenesis and prolong survival of patients with cirrhosis[J].Clin Gastroenterol Hepatol,2014,12(6):1012-1018.

[5] Shingyoji M,Iizasa T,Higashiyama M,et al.The significance and robustness of a plasma free amino acid (PFAA) profile-based multiplex function for detecting lung cancer[J].BMC Cancer,2013,13:77.

[6] Lai H S,Lee J C,Lee P H,et al.Plasma free amino acid profile in cancer patients[J].Semin Cancer Biol,2005,15(4):267-276.

[7] 王倩,劉彤,朱理瑋,等.胃癌組織氨基酸代謝的改變[J].中國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)雜志,2002,10(1):27-30.

[8] 王亮,李保義,李慶瑞,等.胃癌組織氨基酸與腫瘤體積相關(guān)性研究[J].腸外與腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng),2000,7(1):41-44.

[9] Zhang P C,Pang C P.Plasma amino acid patterns in cancer[J].Clin Chem,1992,38(6):1198-1199.

[10]He Y C,Cao J,Chen J W,et al.Influence of methionine aline-depleted enteral nutrition on nucleic acid and protein metabolism in tumor-bearing rats[J].World J Gastroenterol,2003,9(4):771-774.

[11]金玉坤,陸偉,羅雁.不平衡氨基酸的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2010,16(11):1647-1649.

RecentStudiesonAminoAcidMetabolisminGastricCarcinoma

Zhao Chunlin, Dong Zhiyuan, Yu Yang, Zhang Hongyu, Li Penghui, Wang Shuisheng, Ding Chaohui, Xu Huanan
(TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450000,China)

ObjectiveTo investigate the metabolism of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent normal tissues.MethodsNineteen kinds of amino acids in gastric carcinoma tissues and adjacent tissues were detected by ultrahigh performance liquid chromatography(UPLC)tandem masss pectrometry method.ResultsThe contents of amino acids were not significantly changed in gastric carcinoma withⅠandⅡstage, Compared with adjacent normal tissues, contents of Thr, Tyr, Ser, Gly, Val, Pro, Met and Gln increased significantly in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage.ConclusionsThe amino acid in gastric carcinoma tissues with Ⅲand Ⅳstage were significantly changed, which showed that there were obvious metabolism abnormalities of amino acid in gastric carcinoma, providing clinical evidence for amino acid imbalance therapy.

gastric carcinoma；amino acid；ultrahigh performance liquid chromatography tandem masss pectrometry；amino acid imbalance therapy

趙春臨，E-mail：zhao_chunlin@163.com。

R 735.2doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2017.15.004

2016-11-28)