楊菊梅，馬建忠,*，王永剛，鄧子兵，魏 艷，潘 博，李印武

草莓輕型黃邊病毒外殼蛋白抗原表位預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其免疫原性分析

楊菊梅1，馬建忠1,*，王永剛1，鄧子兵1，魏 艷1，潘 博2，李印武2

（1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅啟明星節(jié)能科技有限公司，甘肅 白銀 730913）

應(yīng)用IEDB、DNAStar、DNAMAN和SnapGene等生物信息學(xué)工具對(duì)草莓輕型黃邊病毒外殼蛋白的氨基酸殘基序列進(jìn)行分析。選擇一段抗原性較強(qiáng)的肽段（位于外殼蛋白27～38氨基酸殘基處），依據(jù)大腸桿菌（Escherichia coli）的密碼子偏好性化學(xué)合成了該肽段的DNA編碼序列（AE）。AE片段克隆至E. coli表達(dá)載體pET32a（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pET32a（+）-AE。含AE片段的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)561 bp，編碼了一個(gè)187氨基酸殘基的重組融合蛋白，理論分子質(zhì)量為20.29 kD。重組質(zhì)粒pET32a（+）-AE分別在E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta中進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化。重組融合蛋白在E. coli Rosetta中的最佳表達(dá)條件為1.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、35 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h，產(chǎn)率為13.22 mg/L；在E. coli BL21（DE3）中的最佳表達(dá)條件是為0.5 mmol/L IPTG、30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h，產(chǎn)率為9.55 mg/L。重組融合蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、質(zhì)譜鑒定表明，其含有所預(yù)測(cè)的草莓輕型黃邊病毒外殼蛋白抗原表位肽段AE。AE重組融合蛋白經(jīng)Ni2+親和色譜純化、EK酶切、分子篩除去融合蛋白標(biāo)簽后，免疫產(chǎn)蛋雞。從免疫雞所產(chǎn)雞蛋中提取雞卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，Igy），Dot-Blot檢測(cè)抗體結(jié)合活性。結(jié)果表明，所提取的Igy可特異性識(shí)別AE肽段和SMyEV外殼蛋白。這一結(jié)果表明所預(yù)測(cè)的AE肽段具有較好的免疫原性。

草莓輕型黃邊病毒；外殼蛋白；抗原表位預(yù)測(cè)；原核表達(dá)；質(zhì)譜鑒定；免疫原性

目前已經(jīng)報(bào)道的可侵染草莓的病毒有30余種[1]，且類(lèi)型多樣，對(duì)草莓的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害很大。草莓輕型黃邊病毒（strawberry mild yellow edge virus，SMyEV）隸屬甲型線形病毒科（Alphaflexiviridae）馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus）[2]。SMyEV侵染草莓植株后，植株長(zhǎng)勢(shì)衰退、葉緣褪綠、小葉凹陷[3]。SMyEV單獨(dú)侵染草莓可致其產(chǎn)量下降20.8%，和其他病毒混合侵染可致其產(chǎn)量下降80%[4]。SMyEV的基因組包含1 條單鏈RNA，長(zhǎng)5 966 bp，含有6 個(gè)不同的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。其中，ORF5編碼其外殼蛋白，含有242 個(gè)氨基酸殘基、理論分子質(zhì)量為26 kD[5]。病毒的外殼蛋白決定其免疫學(xué)特異性[6]。據(jù)此，通過(guò)表達(dá)、純化SMyEV外殼蛋白或其抗原表位、制備其抗體，可建立SMyEV的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)系統(tǒng)簡(jiǎn)單、成熟，是目前使用最為廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)[7]。E. coli具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、外源基因表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)研究的深入，E. coli表達(dá)系統(tǒng)具備了可用于不同來(lái)源基因、不同蛋白質(zhì)修飾的表達(dá)菌株[7]。E. coli BL21是E. coli B菌株的蛋白酶缺陷株，通常用來(lái)表達(dá)異源蛋白。DE3是一段插入E. coli基因組中并穩(wěn)定遺傳的DNA片段，主要由乳糖操縱子的啟動(dòng)子、操縱基因、T7噬菌體RNA聚合酶編碼基因等部分組成。在乳糖或異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)下可表達(dá)T7噬菌體RNA聚合酶，后者專(zhuān)一識(shí)別pET32a（+）載體上的T7噬菌體啟動(dòng)子后的讀碼框并對(duì)其大量轉(zhuǎn)錄[8]。E. coli Rosetta宿主菌是E. coli BL21衍生菌，能明顯增強(qiáng)帶有E. coli稀有密碼子的真核蛋白的表達(dá)。該菌株通過(guò)一個(gè)相容性氯霉素抗性質(zhì)粒補(bǔ)充密碼子AUA、AGG、AGA、CUA、CCC和GGA的tRNAs[9]。

抗原數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、抗原表位共性的深入研究，產(chǎn)生了一系列抗原表位預(yù)測(cè)的方法或算法[10]。這些方法的準(zhǔn)確性雖有待于進(jìn)一步的提高，但毫無(wú)疑問(wèn)，基于這些算法預(yù)測(cè)高抗原活性表位，進(jìn)一步利用基因工程手段實(shí)現(xiàn)抗原表位的克隆、表達(dá)和純化，可大大簡(jiǎn)化傳統(tǒng)抗原的篩選流程、縮短抗原的制備工作。

抗體（免疫球蛋白，immunoglobulin，Ig）是機(jī)體受到外來(lái)抗原物質(zhì)刺激后，機(jī)體免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生的可以特異性地識(shí)別和結(jié)合外來(lái)抗原并使之失活的一類(lèi)球蛋白。雞（或者說(shuō)禽類(lèi)）經(jīng)特定抗原免疫后，可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體，并不斷儲(chǔ)存于卵黃中，即雞卵黃抗體（immunoglobulin of yolk，Igy）。Igy分離自雞蛋卵黃，不需要處死動(dòng)物，其熱穩(wěn)定性和抗酸性均優(yōu)于IgG，在免疫學(xué)的診斷技術(shù)和免疫治療方面的應(yīng)用日益廣泛[11]。由于鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物之間較遠(yuǎn)的進(jìn)化距離，哺乳動(dòng)物的蛋白質(zhì)更易免疫雞使其產(chǎn)生抗體[12]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)SMyEV外殼蛋白的親水性、可及性、可塑性、抗原性和二級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了綜合預(yù)測(cè)。通過(guò)比較潛在抗原表位區(qū)段的平均抗原指數(shù)并選擇活性強(qiáng)、特異性高的抗原表位肽段，設(shè)計(jì)、合成了其DNA編碼片段，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了其原核表達(dá)、分離純化和質(zhì)譜鑒定。以此策略制備免疫用抗原快速、成本低，并可避免外源基因在E. coli中表達(dá)時(shí)的密碼子偏好性等問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種和載體

感染SMyEV的草莓（Fragaria nipponica，栽培名為紅顏）植株為蘭州理工大學(xué)馬建忠教授實(shí)驗(yàn)室所保存；受疫雞（Gallus gallus）品種為京紅一號(hào)，購(gòu)自正大養(yǎng)雞場(chǎng)。

E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、E. coli Rosetta、表達(dá)載體pET32a（+）為蘭州理工大學(xué)馬建忠教授實(shí)驗(yàn)室所保存。

1.2 試劑

SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式膠回收試劑盒、IPTG、β-巰基乙醇、一步法植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶、DNA Marker、蛋白質(zhì)Marker 寶生物工程（大連）有限公司；腸激酶（enterokinase，EK）、Ni-Agarose Resin 華瑞德生物科技有限公司；Sephadex G-50 北京索萊寶科技有限公司；胸苷激酶1檢測(cè)試劑盒 華瑞同康生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)性質(zhì)分析及抗原表位優(yōu)勢(shì)肽段AE的確定

檢索NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)，提取SMyEV外殼蛋白的基因序列（AJ577358.1）和蛋白質(zhì)序列（AKN20471.1）。應(yīng)用IEDB、DNAStar、DNAMAN和SnapGene等軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析和抗原表位預(yù)測(cè)?；贕arnier-Robson和Chou-Fasman兩種算法預(yù)測(cè)SMyEV外殼蛋白抗原表位[13-14]；Hopp-Woods算法預(yù)測(cè)親水性[15]；Karplus-Schulz算法預(yù)測(cè)柔韌性[16]；Emini算法預(yù)測(cè)表面可及性[17]；Jameson-Wolf算法預(yù)測(cè)抗原性指數(shù)[18]。參考吳玉章等[19]的算法計(jì)算潛在抗原表位區(qū)段的平均抗原指數(shù)。以Protein BLAST檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析優(yōu)勢(shì)抗原肽段的特異性。利用GeneDesign（http://54.235.254.95/gd）以及E. coli的密碼子偏好性反轉(zhuǎn)譯獲得優(yōu)勢(shì)肽段的核苷酸編碼序列[17]。之后以在線軟件Rare Coden Caltor（http://www. doembi.ucla.edu/sumchan/caltor.htmL）分析核苷酸編碼序列中的稀有密碼子[18]。

本研究中所預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)抗原表位肽段AE的DNA編碼序列如下：

F片段：5’-aattcCTGCCGGGTCGTACCCCGAACCC GAACGCTAACGTTc-3’

R片段：5’-tcgagAACGTTAGCGTTCGGGTTCGGGG TACGACCCGGCAGg-3’

上述片段退火后，可形成編碼AE肽段11 個(gè)氨基酸殘基的密碼子。其5’端含有限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ的黏性末端（AATT），3’端含有限制性?xún)?nèi)切酶XhoⅠ的黏性末端（TCGA）。核苷酸片段F和R由生工生物工程有限公司（上海）合成。

1.3.2 抗原優(yōu)勢(shì)表位肽段AE的克隆

將AE的編碼序列F片段和R片段的濃度調(diào)至1 pmoL/μL。F片段和R片段的退火反應(yīng)10 μL：F片段5 μL，R片段5 μL；退火條件：95 ℃、3 min，69 ℃、10 min。參考SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒DNA pET32a（+），用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ將載體pET32a（+）進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系60 μL：pET32a（+）DNA 3 μg，10×H Buffer 6 μL，EcoRⅠ 2 μL （10 U/μL），XhoⅠ 2 μL（10 U/μL），ddH2O補(bǔ)充至60 μL，37 ℃保溫2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，SanPrep柱式凝膠回收試劑盒回收載體片段。回收后的載體pET32a（+）與AE混合后16 ℃連接過(guò)夜[20]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜[20]。次日挑取單菌落接種于4 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，菌液送蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.3.3 表達(dá)條件的優(yōu)化

為了目的蛋白能夠高效表達(dá)，分別選用E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta進(jìn)行表達(dá)條件（誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度）的優(yōu)化。重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化菌涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑單菌落于4 mL含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，過(guò)夜培養(yǎng)物按1%的接種量接入20 mL含50 μg/mL氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.847時(shí)加入0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，取1 mL樣品12 000 r/min離心2 min收集菌體，加入100 μL水和100 μL 2×Loading Buffer煮沸5 min，15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行電泳[18]，BandScan掃描計(jì)算誘導(dǎo)表達(dá)蛋白帶的相對(duì)含量。以相同的方法，在最佳IPTG濃度條件下以20、25、30、35、40 ℃培養(yǎng)E. coli，確定誘導(dǎo)表達(dá)蛋白帶相對(duì)含量最高的培養(yǎng)溫度。類(lèi)似地，在最佳IPTG濃度和最佳誘導(dǎo)溫度條件下培養(yǎng)E. coli 0、1、2、4、6、8 h，確定誘導(dǎo)表達(dá)蛋白帶達(dá)最高相對(duì)含量時(shí)的最短培養(yǎng)時(shí)間。

在E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta菌株的最佳表達(dá)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)重組融合蛋白，SDS-PAGE分離，BandScan掃描目的蛋白的含量，并用考馬斯亮藍(lán)法[21]測(cè)定總蛋白質(zhì)量濃度，分別計(jì)算目的蛋白在E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta中的產(chǎn)率。

1.3.4 重組融合蛋白的鑒定

為了鑒定含AE肽段的重組融合蛋白是否正確，在E. coli Rosetta菌株中誘導(dǎo)表達(dá)的可溶性蛋白進(jìn)行SDSPAGE分離，參照蛋白質(zhì)低分子質(zhì)量標(biāo)志，從凝膠上切下與重組融合蛋白理論分子質(zhì)量相近的誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶，送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，以確定誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的氨基酸殘基序列。

1.3.5 重組融合蛋白的純化及免疫原性分析

原核表達(dá)、質(zhì)譜鑒定氨基酸序列正確的重組融合蛋白，經(jīng)過(guò)Ni2+親和色譜純化[20]、EK酶切，酶切體系為200 μL（融合蛋白150 μL（2 mg）、EK 16 μL（0.032 μg）、10×Buffer 20 μL，ddH2O補(bǔ)至200 μL），23 ℃條件下反應(yīng)16 h。用SephadexG-50分子篩層析回收AE小片段[20]。1 μg/μL的AE抗原500 μL（500 μg）與完全弗氏佐劑500 μL混勻，肌肉注射免疫雞（京紅一號(hào)）。2 周之后，同樣劑量注射第2次。間隔2 周，用2 倍劑量的AE抗原免疫第3次。水稀釋-冰乙醇沉淀法[22]提取免疫后雞蛋中的雞卵黃免疫球蛋白（Igy）。根據(jù)一步法植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒從感染SMyEV草莓植株葉片中提取總可溶性蛋白，作為檢測(cè)樣品。以pET32a（+）空載體在E. coli Rosetta中的表達(dá)產(chǎn)物（10 ng）為陰性對(duì)照，pET32a-AE在E. coli Rosetta中的表達(dá)產(chǎn)物（10 ng）陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)Dot-Blot分析抗體活性。Dot-Blot檢測(cè)時(shí)草莓病株總可溶性蛋白為200 ng。Igy稀釋200 倍，質(zhì)量濃度為5 μg/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原表位預(yù)測(cè)

2.1.1 潛在抗原表位預(yù)測(cè)

抗原表位的親水性、可及性和可塑性較高，一般不會(huì)分布在α-螺旋、β-折疊區(qū)段，α-螺旋和β-折疊因其內(nèi)部鍵能較高，形態(tài)固定，常處于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，難以與抗體嵌合，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲多處于蛋白質(zhì)分子的表面，結(jié)構(gòu)松散，有利于與抗體嵌合，成為抗原表位的可能性大[18]。根據(jù)以上原則，分別分析SMyEV外殼蛋白的親水性、可及性、可塑性、抗原性和二級(jí)結(jié)構(gòu)。在預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，為提高其準(zhǔn)確性，首先通過(guò)IEDB工具在線預(yù)測(cè)SMyEV外殼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊區(qū)段，又用DNAStar軟件中提供的Garnier-Robson、Chou-Fasman兩種算法來(lái)預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)，綜合分析后得到了SMyEV外殼蛋白的潛在抗原表位（表1）。

表1 SMYEV外殼蛋白抗原表位綜合預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 Comprehensive prediction of antigen epitopes of the SMYEV coat protein

2.1.2 優(yōu)勢(shì)抗原表位肽段AE的確定

目前的多個(gè)抗原表位預(yù)測(cè)方法即可預(yù)測(cè)具表位活性的氨基酸殘基區(qū)段，也可預(yù)測(cè)每個(gè)區(qū)段活性的強(qiáng)弱。據(jù)此，按吳氏平均抗原指數(shù)算法[19]，對(duì)表1的抗原表位活性區(qū)段的強(qiáng)弱進(jìn)行了比較（表2）。其中，27～38氨基酸殘基區(qū)段（LPGRTPNPNANVE，即AE片段）的平均抗原指數(shù)最高。為避免多肽免疫產(chǎn)生的抗體與天然蛋白之間的親和力低的風(fēng)險(xiǎn)，抗原表位的氨基酸殘基數(shù)應(yīng)當(dāng)在8～20 個(gè)之間[15]。AE片段的氨基酸殘基數(shù)為12 個(gè)，符合上述要求。此外，為避免所預(yù)測(cè)的抗原表位區(qū)域隱藏在蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部，應(yīng)優(yōu)先選擇位于蛋白質(zhì)分子N、C兩端的肽段。因?yàn)樵谕暾牡鞍踪|(zhì)分子中，N、C兩端通常暴露在蛋白質(zhì)分子表面。AE肽段則剛好位于SMyEV外殼蛋白的N端，因此，該肽段被確定為優(yōu)勢(shì)抗原表位。

表2 SMYEV外殼蛋白B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū)段的平均抗原指數(shù)Table 2 Average antigenic index of the B cell epitope dominant regions in the SMYEV coat protein

2.2 優(yōu)勢(shì)抗原表位編碼片段AE的克隆

圖1 酶切載體DNA和退火后的AE片段DNA的瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Separation of the enzymatically-digested vector DNA and the annealed AE fragment by agarose gel electrophoresis

載體pET32a（+）經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離后回收大片段（圖1a）。F片段與R片段退火后形成的雙鏈DNA片段AE的大小為42 bp，2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，出現(xiàn)一條均一的條帶，大小與AE的理論預(yù)期值基本一致（圖1b）。將AE與雙酶切的載體pET32a（+）連接后，挑取重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列分析以確定AE片段的正確插入。含AE片段的重組克隆pET32a（+）-AE的誘導(dǎo)表達(dá)區(qū)的ORF長(zhǎng)561 bp，編碼了一個(gè)187氨基酸殘基的重組融合蛋白（圖5a），理論分子質(zhì)量為20.29 kD。

2.3 重組融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

外源基因在E. coli表達(dá)時(shí)影響因素較多，密碼子偏好性、稀有密碼子、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等都可影響到外源基因的表達(dá)。本研究的AE片段雖然是依據(jù)E. coli的密碼子偏好性設(shè)計(jì)，而且排除了稀有密碼子的存在，但其表達(dá)效率仍依賴(lài)于實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)。據(jù)此，選擇E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta來(lái)表達(dá)pET32a（+）-AE，以此了解不同E. coli菌株對(duì)同一外源基因的表達(dá)是否效果不同。

2.3.1 誘導(dǎo)劑IPTG最適濃度的確定

圖2 誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)重組融合蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effects of IPTG concentration on expression of the recombinant fusion protein

IPTG作為誘導(dǎo)劑，能夠解除阻遏物對(duì)lac操縱子的抑制，使啟動(dòng)子啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄。在低IPTG濃度下，基因表達(dá)隨IPTG濃度升高而增強(qiáng)。但I(xiàn)PTG有一定的毒性，濃度過(guò)高又會(huì)抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。所以，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度是重組融合蛋白高效表達(dá)的基礎(chǔ)。圖2結(jié)果表明，當(dāng)宿主菌株為E. coli BL21（DE3），IPTG濃度在0～2.0 mmol/L時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量在0.5 mmol/L IPTG時(shí)最高，占可溶性總蛋白的51.1%。當(dāng)宿主菌株為E. coli Rosetta時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量在1.5 mmol/L IPTG時(shí)最高，占到可溶性總蛋白的72.4%。在E. coli BL21（DE3）菌株中，在誘導(dǎo)重組融合蛋白表達(dá)最高的IPTG濃度（0.5 mmol/L）之后，隨IPTG濃度增加，重組融合蛋白的表達(dá)量較E. coli Rosetta明顯下降（圖2）。在E. coli Rosetta菌株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白含量都高于60%；而在E. coli BL21（DE3）菌株中，目的蛋白的最高含量也只有51.1%。據(jù)此可以確定，E. coli Rosetta菌株比E. coli BL21（DE3）菌株更適合表達(dá)本實(shí)驗(yàn)中的重組融合蛋白。

2.3.2 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

培養(yǎng)溫度通過(guò)影響細(xì)菌體內(nèi)新陳代謝的速率進(jìn)而影響到細(xì)菌的生長(zhǎng)，也就是說(shuō)，溫度會(huì)影響到細(xì)菌體內(nèi)基因的表達(dá)、蛋白的積累。E. coli的最適生長(zhǎng)溫度為37 ℃，但是不同外源蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度不一定是其最佳生長(zhǎng)溫度。培養(yǎng)溫度高，細(xì)菌生長(zhǎng)快，蛋白表達(dá)量大，但多以包涵體的形式存在；培養(yǎng)溫度低，菌體生長(zhǎng)緩慢，蛋白表達(dá)量通常也降低。不同培養(yǎng)溫度對(duì)重組融合蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果表明，在E. coli BL21（DE3）中，誘導(dǎo)溫度為30 ℃時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量最高，為48.8%；在E. coli Rosetta中，誘導(dǎo)溫度為35 ℃時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量最高，為64.1%。不同溫度條件下，重組融合蛋白在E. coli Rosetta中的相對(duì)含量均高于E. coli BL21（DE3）菌株（圖3）。

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組融合蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 The effect of the induced temperatures on expression of the recombinant fusion protein

2.3.3 最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

誘導(dǎo)時(shí)間通過(guò)影響菌體的數(shù)量及外源蛋白的積累量而影響外源蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短菌體數(shù)量太少，外源蛋白表達(dá)積累量低。誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體進(jìn)入衰退期。而且，若外源蛋白不穩(wěn)定，則有可能隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降解。不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組融合蛋白表達(dá)量的影響結(jié)果表明，在E. coli BL21（DE3）中，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量最高，為47.0%；在E. coli Rosetta中，誘導(dǎo)時(shí)間為2 h時(shí)，重組融合蛋白的相對(duì)含量最高，為69.3%。不同誘導(dǎo)時(shí)間下，重組融合蛋白在E. coli Rosetta中的相對(duì)含量均高于E. coli BL21（DE3）菌株（圖4）。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，目的蛋白的相對(duì)含量有所下降，這可能是其他蛋白的表達(dá)量相對(duì)增加或是目的蛋白出現(xiàn)的降解速率較快所致。

圖4 重組融合蛋白表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程Fig. 4 Time-courses of fusion protein expression

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，分別優(yōu)化出了重組融合蛋白在E. coli BL21（DE3）和E. coli Rosetta菌株中的最佳表達(dá)

條件。重組融合蛋白在E. coli Rosetta中的最佳表達(dá)條件是1.5 mmol/L IPTG，35 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h，在最佳條件下其產(chǎn)率為13.22 mg/L；在E. coli BL21（DE3）中的最佳表達(dá)條件是0.5 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2 h，在最佳條件下產(chǎn)率為9.55 mg/L。

2.4 重組融合蛋白的鑒定

圖5 重組融合蛋白的質(zhì)譜鑒定Fig. 5 Identification of the recombinant fusion protein by mass spectrometry

為進(jìn)一步確定含pET32a（+）-AE E. coli誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶是否包含了所設(shè)計(jì)的AE肽段，E. coli Rosetta（pET32a（+）-AE）在最適誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)后分離可溶性總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE分離，所誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的大小處在22.1 kD的位置，與重組融合蛋白的理論分子質(zhì)量20.29 kD比較接近但并不一致。切出22.1 kD蛋白條帶后送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。質(zhì)譜分析共檢測(cè)到6 個(gè)胰蛋白酶酶解肽段（圖5）。這6 個(gè)肽段的氨基酸殘基序列與目的融合蛋白的6 段氨基酸殘基序列完全一致（圖5a）。串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果證明，誘導(dǎo)表達(dá)的重組融合蛋白含有AE肽段的12 個(gè)氨基酸殘基序列。

2.5 Igy抗AE肽段和草莓SMyEV的活性分析

圖6 純化的AE肽段免疫雞后制備的IgY進(jìn)行的Dot-Blot分析Fig. 6 Dot-Blot analysis of the immunogenicity of AE peptide

AE是理論預(yù)測(cè)的SMyEV外殼蛋白中具有較強(qiáng)抗原表位活性的肽段。但目前抗原表位的預(yù)測(cè)方法或算法并不100%準(zhǔn)確。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證AE的抗原活性則是必須工作。鎳離子親和色譜純化的上述重組融合蛋白經(jīng)腸激酶消化、葡聚糖分子篩分離AE肽段，再免疫產(chǎn)蛋雞。以首次免疫21 d后的雞卵黃中制備的Igy為一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗雞抗體為二抗，以Dot-Blot分析3 種來(lái)源的蛋白混合物（含有pET32a（+）載體的E. coli Rosetta的總可溶性蛋白、含有pET32a（+）-AE載體的E. coli Rosetta的總可溶性蛋白和感染了SMyEV病毒草莓葉片的總可溶性蛋白）。結(jié)果表明（圖6），以AE肽段免疫雞產(chǎn)生的Igy可以專(zhuān)一性地結(jié)合SMyEV的外殼蛋白。也就是說(shuō)，所預(yù)測(cè)的SMyEV外殼蛋白抗原表位AE確實(shí)具有免疫原性。

3 討 論

隨著生命科學(xué)與數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)的交叉融合，產(chǎn)生了一門(mén)新的學(xué)科——生物信息學(xué)。生物信息學(xué)理論、方法已廣泛應(yīng)用于大分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、藥物設(shè)計(jì)、大分子相互作用等研究領(lǐng)域[23]。以生物信息學(xué)理論和方法為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)抗原表位預(yù)測(cè)對(duì)于疫苗的設(shè)計(jì)、抗體的制備以及分子檢測(cè)試劑盒的研制等都是必不可少的工具[23]。運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法/軟件綜合預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子抗原表位成功率已達(dá)到86%[24]。目前預(yù)測(cè)多肽抗原表位，主要的生物信息學(xué)方法綜合考慮了蛋白質(zhì)氨基酸殘基序列的親水性、可及性、柔韌性、抗原性及二級(jí)結(jié)構(gòu)等參數(shù)[25]。對(duì)于上述參數(shù)，其選擇的原則是：親水性高，疏水性低，可及性高，選擇的氨基酸序列不存在α-螺旋、β-折疊，在β-轉(zhuǎn)角附近，且易于或有可能形成不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[26]?？乖砦恍蛄幸?～20 個(gè)氨基酸殘基為宜，應(yīng)避免出現(xiàn)4 個(gè)以上連續(xù)相鄰的疏水性氨基酸殘基，并且疏水性殘基數(shù)目不超過(guò)6 個(gè)，序列中帶電荷的氨基酸殘基越多越好[25]。為提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，本研究在對(duì)SMyEV外殼蛋白抗原表位預(yù)測(cè)時(shí)，在采用多種生物信息學(xué)工具軟件對(duì)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行綜合分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步以位于蛋白質(zhì)分子C端或N端的肽段為優(yōu)先選擇。因?yàn)檫@類(lèi)肽段通常位于蛋白質(zhì)分子的表面且多為無(wú)規(guī)卷曲。由此確定了SMyEV的最終候選抗原表位肽段AE，由12 個(gè)氨基酸殘基組成，位于SMyEV外殼蛋白分子的N端。

AE肽段的DNA編碼序列雖以E. coli的偏好密碼子反轉(zhuǎn)譯而來(lái)，而且排除了稀有密碼子的出現(xiàn)，但在兩個(gè)常用的E. coli表達(dá)株系中重組融合蛋白的表達(dá)量存在明顯差異。E. coli Rosetta為E. coli BL21（DE3）的衍生菌，是針對(duì)稀有密碼子的優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌株。雖然本研究所設(shè)計(jì)的抗原表位已經(jīng)排除了E. coli稀有密碼子的存在，但是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組融合蛋白在E. coli Rosetta中的表達(dá)量明顯高于E. coli BL21（DE3）。為何在E. coli Rosetta中的誘導(dǎo)表達(dá)量明顯較高其原因還有待于進(jìn)一步研究。

于翠梅等[27]報(bào)道了草莓輕型黃邊病毒CP基因的克隆、序列分析及原核表達(dá)工作。與他們的研究工作相比，本研究工作省去了草莓病毒苗的尋找、種植，總RNA的制備以及RT-PCR擴(kuò)增目的蛋白的編碼基因（即CP的編碼基因）。其次，直接擴(kuò)增自草莓SMyEV的CP基因在原核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)由于密碼子偏好性或稀缺性往往表達(dá)效率低或不表達(dá)。而本研究通過(guò)抗原表位預(yù)測(cè)、密碼子優(yōu)化、化學(xué)合成一較小的DNA片段（編碼12 個(gè)氨基酸殘基的AE肽段），不僅大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序，而且降低了實(shí)驗(yàn)成本，最重要的是該方案極易實(shí)現(xiàn)外源片段在原核系統(tǒng)中的高效表達(dá)。雖然抗原表位預(yù)測(cè)目前還不能做到百分之百的準(zhǔn)確，但這條途徑的上述優(yōu)越性肯定了這是一個(gè)值得探索并不斷提高其準(zhǔn)確性的方案。在本研究中，純化的AE肽段免疫雞后，其卵黃免疫球蛋白對(duì)細(xì)菌表達(dá)的含AE肽段的重組蛋白（未進(jìn)行分離純化）和來(lái)自感染SMyEV的草莓可溶性蛋白均表現(xiàn)了較好的結(jié)合活性。這也表明，本研究所使用的抗原表位簡(jiǎn)單、快速、低成本的制備策略確實(shí)可行。

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Epitope Prediction, Cloning, Expression and Immunogenicity of the Coat Protein of Strawberry Mild Yellow Edge Virus

YANG Jumei1, MA Jianzhong1,*, WANG Yonggang1, DENG Zibing1, WEI Yan1, PAN Bo2, LI Yinwu2
(1. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China; 2. Gansu Qimingxing Energy-Saving Company, Baiyin 730913, China)

The amino acid sequence of epitope peptides of the coat protein of strawberry mild yellow edge virus was predicted by bioinformatic tools including IEDB, DNAStar, DNAMAN and SnapGene. The peptide from the 27thto 38thamino acid residues with predicted high antigenic activity, referred to as AE, was reversely translated into its encoding DNA sequence according to the codon bias of E. coli. The encoding DNA fragment AE was then synthesized and cloned into the expression vector pET32a (+) between the EcoRⅠ and XhoⅠ sites. The open reading frame (ORF) containing the AE fragment was 561 bp, which encoded a fusion protein of 187 amino acid residues. The theoretical molecular mass of the recombinant fusion protein was 20.29 kD. Expression of the target gene in the recombinant plasmid pET32a (+)-AE was induced and optimized in E. coli BL21 (DE3) and E. coli Rosetta, respectively. The optimal expression conditions of the fusion protein in E. coli Rosetta were 1.5 mmol/L IPTG at 35 ℃ for 2 h, resulting in a yield of 13.22 mg/L, while those for expression in E. coli BL21(DE3) were 0.5 mmol/L IPTG at 30 ℃ for 2 h, giving a yield of 9.55 mg/L. The recombinant fusion protein was isolated by SDS-PAGE and identified by tandem mass spectrometry. The results showed that the recombinant fusion protein contained the designed peptide AE. The recombinant fusion protein was purified by Ni2+-affinity chromatography, digested by EK enzyme, and separated from the fusion protein tag by molecular sieve. Chicken immunoglobulin (Igy) was extracted from chicken eggs collected on the 21stday after the first injection. The binding activity of the Igy to AE and SMyEV was analyzed by the Dot-Blot method. The results showed that the Igy could specifically recognize both AE peptide and SMyEV indicating that the predicted AE peptide has desired immunogenicity.

strawberry mild yellow edge virus; coat protein; epitope prediction; prokaryotic expression; tandem mass spectrometry; immunogenicity

10.7506/spkx1002-6630-201716011

Q785；Q786

A

1002-6630（2017）16-0071-08

2016-09-19

甘肅省科技計(jì)劃項(xiàng)目（1504WKCA020）；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（DC2015085）；甘肅省橫向科技項(xiàng)目（10-2203）；蘭州理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理處教研項(xiàng)目

楊菊梅（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿訖z測(cè)。E-mail：cherry_yjm@sina.cn

*通信作者：馬建忠（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ?。E-mail：majz@lut.cn

楊菊梅, 馬建忠, 王永剛, 等. 草莓輕型黃邊病毒外殼蛋白抗原表位預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及其免疫原性分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 71-78. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716011. http://www.spkx.net.cn

YANG Jumei, MA Jianzhong, WANG Yonggang, et al. Epitope prediction, cloning, expression and immunogenicity of the coat protein of strawberry mild yellow edge virus[J]. Food Science, 2017, 38(16): 71-78. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716011. http://www.spkx.net.cn