邱 娟，沈建東，翁 凌,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

利用牡蠣制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化

邱 娟1，沈建東1，翁 凌1,2，張凌晶1,2，劉光明1,2，曹敏杰1,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門(mén) 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門(mén) 361021）

運(yùn)用正交試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化牡蠣血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE）抑制肽的分步酶解制備工藝。采用復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)牡蠣進(jìn)行分步酶解，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析和ACE抑制率為考核指標(biāo)優(yōu)化工藝參數(shù)。結(jié)果表明，第1步復(fù)合蛋白酶最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶4、加酶量1.2%、pH 7.0、反應(yīng)溫度50 ℃、酶解時(shí)間1 h；第2步堿性蛋白酶最佳工藝參數(shù)為：加酶量0.42%、pH 8.3、反應(yīng)溫度53 ℃、酶解時(shí)間73 min。凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)得牡蠣酶解液分子質(zhì)量在3 000 D以下小肽所占比例為99.72%，其ACE抑制活性IC50為0.8 mg/mL。同時(shí)，氨基酸組成分析表明，牡蠣肽中Glu含量最高，Cys含量最低；必需氨基酸和疏水性氨基酸含量分別占總氨基酸的36.6%和37.2%。本研究制備的低分子質(zhì)量、高ACE抑制活性牡蠣肽，可為牡蠣資源的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考。

牡蠣；酶解；ACE抑制肽；分子質(zhì)量分布；氨基酸組成

牡蠣是福建省重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，2014年產(chǎn)量達(dá)161.2萬(wàn) t，占全國(guó)總量的37%[1]，資源極為豐富。牡蠣含有多種活性物質(zhì)，是我國(guó)第一批被列為藥食同源的食品[2-3]，牡蠣中必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于人乳和牛乳[4-5]。研究表明，蛋白質(zhì)降解后可生成小分子質(zhì)量肽類(lèi)，某些肽類(lèi)具有抗氧化、降血壓、抗菌等生物活性功能。目前，牡蠣以鮮食和干制為主，隨著消費(fèi)者對(duì)高質(zhì)量海洋食品需求的提高，行業(yè)加工水平低和產(chǎn)品種類(lèi)少等問(wèn)題日益凸顯，實(shí)現(xiàn)牡蠣精深加工和高值化利用具有重要意義。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin-Ⅰ converting enzyme，ACE）是一種膜結(jié)合的二肽羧基酶，對(duì)人體血壓有重要的調(diào)控作用[6-7]。化學(xué)合成藥物如卡托普利和依那普利等對(duì)高血壓具有良好治療效果，但該類(lèi)藥物往往具有一定副作用[8]。天然來(lái)源的ACE抑制肽因安全性高、易被人體吸收而受到廣泛關(guān)注[9]。目前，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者已從海參[10]、貽貝[11]、蝦殼[12]、牛奶[13]、蛇腹[14]、小球藻[15]、牦牛乳酪蛋[16-17]等中獲得ACE抑制肽。以牡蠣為原料制備ACE抑制肽有一定研究[18]，然而系統(tǒng)研究其制備工藝較少，直接影響其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究以福建高產(chǎn)的太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）為原料，運(yùn)用正交試驗(yàn)及響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，以獲得分子質(zhì)量小、ACE抑制活性高的牡蠣肽，以期為牡蠣資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮太平洋牡蠣（Crassostrea gigas） 廈門(mén)集美菜市場(chǎng)。

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶 諾維信生物技術(shù)有限公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 立陶宛Fermentas公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺、N,N-亞甲叉雙丙烯酰胺 美國(guó)Bio-Rad公司；甘氨酸中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；Tris-堿 德國(guó)Roche公司；馬尿酰組胺酰亮氨酸（hippuryl-histidyl-leucine，HHL） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PT-2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；Lambda 35紫外分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司；Stater 3100 pH計(jì) 美國(guó)Ohaus公司；Centrifuge 541小型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；G-BOX凝膠成像分析系統(tǒng) 英國(guó)Syngene公司；1260高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣基本成分分析

水分含量測(cè)定采用直接干燥法，參照GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；粗蛋白含量測(cè)定采用凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；總糖含量測(cè)定采用蒽酮硫酸法[19]；粗脂肪含量測(cè)定采用索氏提取法，參照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》。

1.3.2 牡蠣肽制備工藝

第1步酶解：取牡蠣肉100 g，加入一定比例蒸餾水組織勻漿，調(diào)節(jié)pH值至酶解所需，并加入一定量的復(fù)合蛋白酶進(jìn)行恒溫酶解，反應(yīng)結(jié)束后95 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。所得酶解液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析，并測(cè)定其ACE抑制率。

第2步酶解：以第1步酶解液為反應(yīng)底物，調(diào)整pH值至酶解所需值，加入一定量的堿性蛋白酶進(jìn)行恒溫酶解，酶解結(jié)束后95 ℃加熱10 min終止反應(yīng)。所得酶解液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并測(cè)定其ACE抑制率及分子質(zhì)量分布。

1.3.3 第1步酶解條件優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗(yàn)

選定第1步酶解最優(yōu)蛋白酶，以SDS-PAGE分析和ACE抑制率為指標(biāo)，比較料液比、加酶量及酶解時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白降解的影響。1）料液比的影響：在加酶量1%、pH 7.0酶解2 h條件下，考察不同料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4（g/mL））對(duì)牡蠣蛋白酶解和ACE抑制率的影響。2）加酶量的影響：在料液比1∶2、pH 7.0酶解2 h條件下，考察復(fù)合蛋白酶添加量（0%、0.1%、0.3%、0.5%、0.8%、1.0%、2.0%）對(duì)牡蠣蛋白酶解和ACE抑制率的影響。3）酶解時(shí)間的影響：在料液比1∶2、加酶量0.8%、pH 7.0條件下，考察酶解時(shí)間（0、1、2、3、4 h）對(duì)牡蠣蛋白酶解和ACE抑制率的影響。4）pH值的影響：在料液比1∶2、加酶量0.8%、反應(yīng)2 h條件下，考察反應(yīng)pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）對(duì)牡蠣蛋白酶解和ACE抑制率的影響。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)牡蠣第1步酶解的最佳單因素條件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)（表1），以SDS-PAGE分析為依據(jù)，分析比較不同試驗(yàn)組條件對(duì)牡蠣蛋白的降解情況，篩選第1步酶解最優(yōu)條件。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of optimization parameters used in orthogonal array design

1.3.4 牡蠣蛋白第2步酶解條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

選定第2步酶解最優(yōu)蛋白酶，以SDS-PAGE分析及ACE抑制率為指標(biāo)，比較蛋白酶添加量及酶解時(shí)間對(duì)牡蠣蛋白酶解和ACE抑制率的影響。

1.3.4.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取加酶量、pH值、反應(yīng)溫度、酶解時(shí)間進(jìn)行酶解條件優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化的試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of optimization parameters used in responses surface analysis

1.3.5 ACE抑制活性的測(cè)定

ACE抑制活性的測(cè)定參照Wu Qiang等[20]方法，并稍作修改，具體步驟如下：離心管中依次加入125 μL 6.5 mmol/L HHL和50 μL樣品，37 ℃預(yù)熱5 min后加入50 μL ACE，接著在37 ℃條件下水浴反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后加入125 μL 1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，繼續(xù)加入750 μL乙酸乙酯提取，吸取500 μL抽提液于2.0 mL離心管中，揮發(fā)除去乙酸乙酯后加入1.5 mL去離子水充分溶解，在228 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。其中，對(duì)照組用去離子水代替樣品，空白組預(yù)先加入HCl，其余條件不變。ACE抑制率計(jì)算如下式所示：

式中：A樣為樣品組吸光度；A樣空為樣品空白組吸光度；A對(duì)為對(duì)照組吸光度；A對(duì)空為對(duì)照空白組吸光度。

1.3.6 牡蠣酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定牡蠣酶解液的分子質(zhì)量分布[20]。其中，標(biāo)準(zhǔn)品為：小清蛋白：11515 D；脯氨酸內(nèi)肽酶小肽：4907 D；3 個(gè)合成小肽ALLAGDPSVLED、YGDEY和AMN的分子質(zhì)量分別為：1 199、645、334 D。色譜條件：1260 Agilent高效液相色譜純化系統(tǒng)；色譜柱為T(mén)SK gel G2000 SWXL（φ7.8 mm×300 mm）；流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45∶55∶0.1；進(jìn)樣體積為10 μL；流速為0.5 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。所得數(shù)據(jù)利用GPC Offline軟件分析，確定樣品的分子質(zhì)量分布。

1.3.7 氨基酸組成分析

氨基酸的測(cè)定參考毋瑾超等[21]方法，并作修改，具體步驟為：取酶解液于可密封消化管中，加入6 mol/L HCl和苯酚，在-8 ℃酒精中預(yù)冷10 min，抽真空后充入氮?dú)?，置?10 ℃水解22 h，反應(yīng)結(jié)束后蒸餾法除去鹽酸，經(jīng)0.22 μm膜過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

為了解所用牡蠣原料基本營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)其水分、粗蛋白、總糖及粗脂肪含量進(jìn)行測(cè)定。牡蠣水分含量為74.52%，粗蛋白含量為12.62%，總糖含量為10.10%，粗脂肪含量為1.89%，表明牡蠣是一種高蛋白、糖原豐富、低脂肪的優(yōu)質(zhì)食品。

2.2 牡蠣第1步酶解條件優(yōu)化

圖1 單因素對(duì)第1步酶解效果的SDS-PAGE分析Fig. 1 SDS-PAGE analysis of the effects of various factors in the first hydrolysis step on protein breakdown

由圖1a可知，隨著溶劑用量增加，牡蠣蛋白降解隨之加快，同時(shí)ACE抑制率結(jié)果顯示當(dāng)料液比為1∶2時(shí)酶解液活性高于1∶4，故選擇料液比為1∶2（圖中未體現(xiàn)）。由圖1b可知，隨著加酶量增大，蛋白逐漸被降解。當(dāng)加酶量為0.8%時(shí)，降解條帶和ACE抑制活性基本保持不變，綜合考慮選擇加酶量為0.8%。同時(shí)，綜合考慮SDSPAGE分析結(jié)果和ACE抑制活性，選擇酶解最佳時(shí)間為2 h（圖1c），pH值為7.0（圖1d）。

圖2 第1步酶解效果的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of hydrolysates obtained from nine orthogonal array runs

以料液比、加酶量、pH值和酶解時(shí)間進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化第1步酶解工藝。由圖2可知，經(jīng)酶解后，牡蠣全蛋白分子質(zhì)量主要分布在14.4 kD以上。牡蠣蛋白經(jīng)復(fù)合蛋白酶酶解后，試驗(yàn)組3、9的大部分蛋白被酶解，但在60 kD及14.4 kD附近仍有少量蛋白存在。從成本角度考慮，試驗(yàn)組3酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，故選擇試驗(yàn)組9為第1步復(fù)合蛋白酶的最佳條件，即料液比1∶4、加酶量1.2%、pH 7.0，酶解時(shí)間1 h。

2.3 牡蠣第2步酶解最優(yōu)蛋白酶的選擇及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.3.1 牡蠣第2步酶解最優(yōu)蛋白酶的選擇

以第1步酶解產(chǎn)物為底物，比較木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶4 種酶對(duì)第2步酶解的效果。

圖3 4 種蛋白酶第2步酶解效果的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of hydrolysates obtained after the second hydrolysis step with four different proteinase

由圖3可知，堿性蛋白酶降解效果最好，其次為木瓜蛋白酶，風(fēng)味蛋白酶效果最差。同時(shí)，由圖4可知，第1步酶解液的ACE抑制率為73.9%，經(jīng)第2步酶解后各酶解液的ACE抑制活性均出現(xiàn)不同程度提高，ACE抑制率達(dá)90%以上。推測(cè)可能是由于二次酶解后水解度進(jìn)一步提高，生成了新的ACE抑制肽[12]。綜合考慮SDS-PAGE分析及ACE抑制率結(jié)果，選定堿性蛋白酶進(jìn)行第2步酶解。

圖4 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的ACE抑制率Fig. 4 ACE inhibitory activities of hydrolysates produced by different proteases

2.3.2 牡蠣蛋白第2步酶解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖5 加酶量（a）和酶解時(shí)間（b）對(duì)ACE抑制率的影響Fig. 5 Effect of alkaline protease dosage and hydrolysis time on ACE inhibitory activity

以堿性蛋白酶為第2步酶解工具酶，探究加酶量及酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的影響。由圖5a可知，隨著加酶量的增加，ACE抑制率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。原因可能在于牡蠣蛋白酶解后ACE抑制肽不斷被釋放，當(dāng)酶過(guò)量時(shí)，部分ACE抑制肽降解成更小的肽或氨基酸，喪失活性[22]。因此，選擇加酶量0.3%用于下一步研究。

由圖5b可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，ACE抑制率先上升后趨于平穩(wěn)，初始酶解階段，底物與較多蛋白酶反應(yīng)，ACE抑制肽被快速釋放，時(shí)間延長(zhǎng)后底物和酶量的減少，反應(yīng)逐漸趨于平緩，ACE抑制肽不再被釋放。最終確定酶解時(shí)間為60 min，經(jīng)第2步酶解后產(chǎn)物的ACE抑制率提升至92.7%。根據(jù)圖5結(jié)果，確定牡蠣蛋白第2步酶解工藝為：加酶量0.3%、酶解時(shí)間60 min。堿性蛋白酶是在pH值偏堿性范圍內(nèi)水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類(lèi)，其酶活力在pH 8.0、50℃條件下較高（GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》），故選擇反應(yīng)pH 8.0、反應(yīng)溫度50℃。

2.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在牡蠣蛋白第2步酶解單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面法的要求，展開(kāi)29組試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design together with results for response surface analysis

續(xù)表3

利用Design-Expert軟件，以加酶量、反應(yīng)溫度、pH值及酶解時(shí)間為響應(yīng)變量，以ACE抑制率為響應(yīng)值對(duì)表4進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)模型如下：

Y=93.16+3.32A+2.38B+2.62C-0.15D-2.95AB-2.05AC+2.45AD-1.27BC+2.35BD+1.35CD-3.28A2-2.72B2-3.15C2-2.96D2

利用Design-Expert軟件對(duì)上述模型及方程系數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 4 Analysis of variance of regression model and significance test

由表4可知，模型極顯著（P＜0.000 1），試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠。模擬失擬性檢驗(yàn)，P=0.621 1＞0.05，表明模型擬合度好，能準(zhǔn)確地模擬各因素對(duì)ACE抑制率的影響。R2=0.948 1，表明模型與實(shí)際情況擬合很好，可用于預(yù)測(cè)ACE抑制率的變化情況。一次項(xiàng)中A、B、C影響極顯著，D影響不顯著；交互項(xiàng)中AB、AD與BD影響極顯著，AC影響顯著，BC與CD影響不顯著。由圖6交互項(xiàng)因素響應(yīng)面圖可知，加酶量與酶解時(shí)間、pH值與酶解時(shí)間的交互作用較強(qiáng)，而pH值與反應(yīng)溫度、反應(yīng)溫度與酶解時(shí)間的交互作用相對(duì)較弱。結(jié)合上述因素值及各因素對(duì)ACE抑制率的影響，得預(yù)測(cè)最優(yōu)酶解條件為：加酶量0.42%、pH 8.29、反應(yīng)溫度52.97 ℃、酶解時(shí)間72.94 min，該模型預(yù)測(cè)ACE抑制率為94.54%。考慮到實(shí)際情況，修正最優(yōu)酶解條件為加酶量0.42%、pH 8.3、反應(yīng)溫度53 ℃、酶解時(shí)間73 min，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在該最優(yōu)條件下獲得的酶解液其ACE抑制率達(dá)到94.36%，與預(yù)測(cè)值相近，證明在實(shí)踐中應(yīng)用該模型可行。

圖6 交互項(xiàng)的響應(yīng)面圖Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effects of factors on ACE inhibitory activity

2.4 牡蠣酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

圖7 牡蠣肽分子質(zhì)量分布的凝膠過(guò)濾色譜圖Fig. 7 Gel filtration chromatogram of oyster peptides

由圖7可知，標(biāo)準(zhǔn)品處于一條直線上，線性良好（R=0.9991），能較好地反映酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布情況。計(jì)算得知，牡蠣蛋白酶解后分子質(zhì)量在3 000 D以下部分小肽所占比例為99.72%，表明經(jīng)復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶兩步酶解后，牡蠣蛋白質(zhì)被完全降解為小分子物質(zhì)，推測(cè)牡蠣產(chǎn)物中高ACE抑制活性組分主要集中在分子質(zhì)量在3 000 D以下部分，與Miguel等[23]的研究結(jié)果一致。

2.5 牡蠣肽的ACE抑制活性

圖8 牡蠣肽的ACE抑制活性Fig. 8 ACE inhibitory activity of oyster peptides

對(duì)獲得的牡蠣肽ACE抑制率進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖8所示。當(dāng)質(zhì)量濃度從0 mg/mL增加到1 mg/mL時(shí)，ACE抑制活性大幅度上升，抑制率接近60%。當(dāng)質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí)，隨著肽質(zhì)量濃度的增加，ACE抑制率仍不斷上升，但增加趨勢(shì)逐漸趨于平緩。經(jīng)計(jì)算，牡蠣肽ACE抑制活性IC50為0.8 mg/mL，該結(jié)果與姜瞻梅等[24]利用酪蛋白制備的ACE抑制肽（IC50為0.68 mg/mL）相當(dāng)，具有較高ACE抑制活性。胡松青等[25]發(fā)現(xiàn)魚(yú)鱗明膠降解產(chǎn)物的ACE抑制活性IC50為0.56 mg/mL，活性稍高于牡蠣肽。此外，張艷萍等[11]發(fā)現(xiàn)貽貝降解產(chǎn)物的ACE抑制活性IC50為34.6mg/mL，低于牡蠣肽。實(shí)際上，肽的生物活性與其氨基酸組成和序列密切相關(guān)[26]。研究認(rèn)為，當(dāng)ACE抑制肽的C末端為T(mén)yr、Pro、Trp、Phe和Leu，N末端為Val、Ile、Arg、Tyr、Gly、Ala和Leu時(shí)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的ACE抑制活性[27-28]。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)生的肽 C末端常帶有疏水性氨基酸，這種結(jié)構(gòu)符合具有高ACE抑制活性肽的特點(diǎn)，且堿性蛋白酶能夠獲得較短的肽段，短肽更具潛在的ACE抑制活性[29-30]。此外，牡蠣富含多糖，從牡蠣中提取多糖進(jìn)行ACE抑制活性的測(cè)定，獲得其IC50為20.1 mg/mL，明顯低于牡蠣肽的ACE抑制活性（IC50=0.8 mg/mL），因此推測(cè)抑制活性主要來(lái)源于牡蠣肽。不足的是，本研究獲得的牡蠣肽仍是混合物，活性肽的主要組分與結(jié)構(gòu)尚不明確，今后有必要對(duì)其主要成分進(jìn)行分離，利用質(zhì)譜技術(shù)或N端測(cè)序獲得活性肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)，解明其與ACE作用的機(jī)理。

2.6 氨基酸組成分析

表5 牡蠣肽的氨基酸組成分析Table 5 Analysis of amino acid composition of oyster peptides g/100 g

由表5可知，牡蠣肽氨基酸組成中，Glu含量最高，Asp、Arg次之，Lys和Gly等含量也很高，Cys含量最低。牡蠣肽中必需氨基酸含量占總氨基酸的36.6%，疏水性氨基酸含量占總氨基酸的37.2%，表明其良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。由于本研究樣品處理以酸水解，Trp被破壞，因此無(wú)法提供該氨基酸含量的數(shù)據(jù)。

3 結(jié) 論

通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，確定分步酶解牡蠣制備ACE抑制肽的最佳工藝為：第1步：料液比1∶4、復(fù)合蛋白酶加酶量1.2%、pH 7.0、酶解時(shí)間1 h；第2步：堿性蛋白酶加酶量0.42%、pH 8.3、反應(yīng)溫度53 ℃、酶解時(shí)間73 min。制備所得牡蠣肽分子質(zhì)量在3 000 D以下部分占99.72%，其ACE抑制活性IC50為0.8 mg/mL，具有較高活性。另一方面，牡蠣肽中Glu含量最高，Cys含量最低，必需氨基酸含量和疏水性氨基酸含量分別占總氨基酸的36.6%和37.2%。本研究建立了分步酶解法制備高ACE抑制活性的牡蠣肽工藝，為牡蠣精深加工及高值化利用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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Optimization of Preparation of Angiotensin-Ⅰ Converting Enzyme (ACE) Inhibitory Peptides Derived from Pacific Oyster (Crassostrea gigas)

QIU Juan1, SHEN Jiandong1, WENG Ling1,2, ZHANG Lingjing1,2, LIU Guangming1,2, CAO Minjie1,2,*
(1. College of Food and Biological Engineering, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. National & Local Joint Engineering Research Center of Deep Processing Technology for Aquatic Products, Xiamen 361021, China)

The stepwise enzymatic hydrolysis of Pacific oyster (Crassostrea gigas) for preparing angiotensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) inhibitory peptides was optimized by orthogonal array design and response surface methodology (RSM). Pacific oyster was sequentially hydrolyzed by protamex followed by alcalase. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and ACE inhibitory activity analysis were used to determine the optimal hydrolysis conditions. The results showed that the optimal conditions for the first hydrolysis step were determined as follows: solid to liquid ratio, 1:4 (g/mL); pH, 7.0; protamex dosage, 1.2%; hydrolysis duration, 1 h, and those for the second hydrolysis step were temperature were 53 ℃; pH, 8.3; alcalase dosage, 0.42%, and hydrolysis duration, 73 min. Gel filtration chromatography analysis showed that the molecular masses of almost all (99.72%) the peptides produced were lower than 3 000 D. Meanwhile, the oyster peptides revealed high ACE inhibitory activity, with IC50of 0.8 mg/mL. Amino acid composition analysis indicated that glutamic acid was the most abundant amino acid while cysteine was the least abundant one in the peptide products. Among the total amino acids, essential amino acids accounted for 36.6% while hydrophobic amino acids accounted for 37.2%. Our present work can provide a theoretical reference for the development of antihypertensive peptides derived from oyster.

oyster; hydrolysis; ACE inhibitory peptide; molecular mass distribution; amino acid composition

10.7506/spkx1002-6630-201716026

TQ464.7

A

1002-6630（2017）16-0165-08

邱娟, 沈建東, 翁凌, 等. 利用牡蠣制備ACE抑制肽的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 165-172. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201716026. http://www.spkx.net.cn

QIU Juan, SHEN Jiandong, WENG Ling, et al. Optimization of preparation of angiotensin-Ⅰ converting enzyme (ACE) inhibitory peptides derived from Pacific oyster (Crassostrea gigas)[J]. Food Science, 2017, 38(16): 165-172. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716026. http://www.spkx.net.cn

2016-07-24

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471640）；廈門(mén)南方海洋研究中心項(xiàng)目（14CZP030HJ04）

邱娟（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：18850570649@163.com *通信作者：曹敏杰（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：mjcao@jmu.edu.cn