吳 浩，周 昱，陳靖博，陳德啟，金曉蕾，靳保輝，謝麗琪，林光輝

基于元素含量和穩(wěn)定同位素比值的寧夏賀蘭山東麓地區(qū)有機(jī)葡萄酒甄別

吳 浩1，周 昱2，陳靖博2，陳德啟3，金曉蕾1，靳保輝1，謝麗琪1，林光輝4,5

（1.深圳出入境檢驗檢疫局食品檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518016；2.廈門出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361000；3.寧夏德龍酒業(yè)有限公司，寧夏 銀川 750100；4.清華大學(xué)深圳研究生院，廣東 深圳 518055；5.清華大學(xué)地球系統(tǒng)科學(xué)系，地球系統(tǒng)數(shù)值模擬教育部重點實驗室，北京 100084）

對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的元素含量和穩(wěn)定C、N同位素比值分布特征進(jìn)行分析，并利用此數(shù)據(jù)對寧夏賀蘭山東麓地區(qū)有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行甄別。結(jié)果表明，有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒在一些金屬元素如Na、Mg、K、Al和Cu的含量上具有顯著差異，而且有機(jī)葡萄酒的乙醇和丙三醇的δ13C值顯著低于非有機(jī)葡萄酒，但δ15N顯著高于非有機(jī)葡萄酒。利用C、N穩(wěn)定同位素和一些金屬元素含量，結(jié)合主成分分析，可對賀蘭山東麓地區(qū)有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行有效區(qū)分，為我國有機(jī)葡萄酒摻假檢測以及該地區(qū)的葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支撐，具有重要的應(yīng)用前景。

有機(jī)肥；葡萄；酒精飲料；礦質(zhì)元素；食品鑒定

隨著我國經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展，人民生活水平和購買力不斷提高，葡萄酒的消費量呈現(xiàn)快速增長趨勢[1]。有機(jī)葡萄酒在種植技術(shù)、釀造工藝、生態(tài)可持續(xù)發(fā)展等方面具有明顯優(yōu)勢，因此有機(jī)概念的引入也將葡萄酒的品質(zhì)提升到了新的高度，同時滿足了目前消費者追求安全飲食、健康飲食、綠色飲食的需求，具有很大的發(fā)展空間。有機(jī)葡萄酒是指獲得“有機(jī)葡萄釀造”認(rèn)證商標(biāo)的葡萄酒，特指葡萄來自有機(jī)葡萄園，或采取有機(jī)種植法，一概不允許使用化學(xué)肥料和農(nóng)藥[2]。對于葡萄酒中農(nóng)藥殘留的檢測已有大量方法和標(biāo)準(zhǔn)[3-5]，但對判斷葡萄種植過程中是否使用化肥的研究鮮見報道。目前對市場上銷售的有機(jī)葡萄是否為有機(jī)的研究較少[6]。

穩(wěn)定同位素技術(shù)的快速發(fā)展為有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的區(qū)分提供了可能。賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)大部分為砂礫土壤，有機(jī)質(zhì)含量少，肥力低，種植過程中必須施肥保證葡萄的產(chǎn)量[7]。土壤中N元素是影響植物體N穩(wěn)定同位素變化的主要因素[8]，因此利用N同位素比值能一定程度上對農(nóng)產(chǎn)品N素來源進(jìn)行追溯。其次，葡萄酒含有豐富的礦質(zhì)元素，包括K、Ca、Na、Mg等常見元素，F(xiàn)e、Cu、Zn、Mn等微量元素，以及Pb、Sr、Cr等痕量金屬元素[1,9]。這些元素主要來自于葡萄種植土壤，所以利用礦質(zhì)元素在葡萄酒中的含量分布特征可對葡萄酒的原產(chǎn)地進(jìn)行溯源[10-13]。影響葡萄酒中元素含量變化不僅是產(chǎn)地差異，已有研究表明使用不同類型的肥料可能直接影響葡萄酒中微量元素含量[14-16]。因此通過分析特定元素含量的差異，也可以對葡萄酒是否有機(jī)進(jìn)行區(qū)分。

為了揭示有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒在穩(wěn)定同位素和元素含量分布特征等方面的差異，探索利用穩(wěn)定同位素和微量元素對有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行精準(zhǔn)區(qū)分的有效性，本實驗選取寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)的有機(jī)葡萄園和非有機(jī)葡萄園作為研究對象，分析有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒的元素含量和C、N穩(wěn)定同位素比值，并利用多元統(tǒng)計模型對有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

為了避免由于產(chǎn)地背景引起的元素和同位素比值的差異，有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒選自同一產(chǎn)地。有機(jī)葡萄酒樣品采自寧夏德龍十萬畝有機(jī)葡萄產(chǎn)業(yè)園，位于賀蘭山東麓葡萄園產(chǎn)區(qū)。該葡萄園獲得中國有機(jī)認(rèn)證（認(rèn)證號：CHC11010178R1M-1）和美國USDA有機(jī)認(rèn)證（認(rèn)證號：7327CN100(NOP)）。管理過程中實現(xiàn)全程有機(jī)，種植過程中不使用任何農(nóng)藥和化肥，以家畜糞肥作為有機(jī)肥料（主要為牛羊糞肥）。非有機(jī)葡萄酒采自賀蘭山東麓非有機(jī)種植葡萄酒廠，具體樣品信息見表1。所有葡萄品種均屬于歐亞葡萄品種（Vitis vinifera）。

表1 葡萄酒樣品品種信息Table 1 Information about grape varieties for the selected wines

元素分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：Ca、K、Na、Mg、B、Al、Cr、Mn、Fe、Cu、Zn、Rb、Sr、Ba元素標(biāo)準(zhǔn)品采用國家單元素標(biāo)準(zhǔn)（質(zhì)量濃度10～1 000 mg/L），購于國家鋼鐵材料測試中心。

同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：除乙醇外，其他揮發(fā)性成分標(biāo)準(zhǔn)品均沒有相應(yīng)的同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因此香氣成分的C穩(wěn)定同位素比值測定以乙醇作為質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品。乙醇同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為BCR-656由歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供，δ13CV-PDB=（26.91±0.07）‰，純度96%；氮穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用國際原子能機(jī)構(gòu)IAEA-600咖啡因標(biāo)準(zhǔn)，δ15N=（1.0±0.2）‰。

其他標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：乳酸乙酯（純度99.5%）購于天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；2-甲基丁醇（純度98%）購于美國Sigma公司；乙酸、丙三醇（純度98%）（均為優(yōu)級純）購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。以上標(biāo)準(zhǔn)品僅作為揮發(fā)性成分在氣相色譜-穩(wěn)定同位素質(zhì)譜法的定性。所有標(biāo)準(zhǔn)品待測前均用超純水稀釋10 倍。超純水由Millpore公司制造的Milli-Q系統(tǒng)制備。He（純度99.999%，載氣）、CO2（純度99.999%，參考?xì)猓2（純度99.999%，參考?xì)猓┵徲诿绹鳤ir Products公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）美國安捷倫公司；Xseries2電感耦合等離子質(zhì)譜儀、DELTA V advantage同位素質(zhì)譜主機(jī)（配備Trace GC氣相色譜儀、GC-Isolink氣相色譜接口、Flash EA 1112元素分析儀） 美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

元素分析前處理：取葡萄酒樣品0.5 mL，加入0.5 mL濃硝酸，常溫消解過夜，稀釋至15 mL備測。

揮發(fā)性成分C同位素分析前處理：葡萄酒開瓶后搖勻，一次性注射器（5 mL）吸取葡萄酒樣，用0.22 μm水系濾膜過濾至1.5 mL樣品瓶中，待測。

N穩(wěn)定同位素分析前處理：取葡萄酒樣品5 mL，冷凍干燥，取干燥后樣品2 mg左右，置于錫杯中，包裹嚴(yán)密待測。

1.3.2 分析方法

元素分析：元素含量分析采用王丙濤等[13]分析方法。濃硝酸與葡萄酒樣品以1∶1的體積比混合消解后，利用電感耦合等離子質(zhì)譜儀分析元素含量。質(zhì)譜條件：功率1 400 W；霧化器流速0.85 mL/min；冷卻氣流速14.2 L/min；輔助氣流速0.8 L/min；采樣深度150 mm；脈沖電壓3 380 V；模擬電壓1 800 V。其中K、Ca、Na、Mg檢出限為0.5 mg/L，Al為0.2 mg/L，其他元素為0.01 mg/L。為了獲取更準(zhǔn)確的分析結(jié)果，將K、Ca、Na、Mg和其他元素分開測定。

揮發(fā)性成分C穩(wěn)定同位素分析：不同揮發(fā)性組分C穩(wěn)定同位素分析方法參考文獻(xiàn)[17]。對葡萄酒樣品中的揮發(fā)性成分乙醇、丙三醇、2-甲基丁醇、乳酸乙酯和醋酸分別測定各自的C穩(wěn)定同位素比值。由于以上揮發(fā)性成分在葡萄酒中的含量差異較大，不能同時保證每種成分的同位素質(zhì)譜信號強(qiáng)度在其線性范圍內(nèi)，將極大影響分析準(zhǔn)確性。為了保證樣品分析準(zhǔn)確，本方法將按照不同組分在葡萄酒中的質(zhì)量濃度進(jìn)行分開測試。

乙醇?xì)庀嗌V條件：HP-INNOWAX色譜柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量0.1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣高純He；流速1.5 mL/min；分流比200∶1。程序升溫：初溫40 ℃，保留1 min，50 ℃/min升溫至220 ℃，保留3 min。

丙三醇?xì)庀嗌V條件：HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量0.2 μL；進(jìn)樣口溫度270 ℃；載氣高純He；流速1.5 mL/min；分流比20∶1。程序升溫：初溫80 ℃，保留1 min，15 ℃/min升溫至240 ℃，保留2 min。

其他組分氣相色譜條件：HP-INNOWAX色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量0.5 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣高純He；流速1.5 mL/min；分流比10∶1。程序升溫：初溫80 ℃，保留1 min，15 ℃/min升溫至240 ℃，保留6 min。

氣相色譜接口條件：燃燒管溫度1 000 ℃，切入質(zhì)譜時間200 s。

元素分析儀條件：氧化爐960 ℃；柱溫60 ℃；O2流速175 mL/min；充氧時間3 s；載氣流速110 mL/min。

質(zhì)譜條件：離子源電壓2.97 kV；真空度1.4× 10-6mBar；電子能量120.8 eV。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Thermo Electron Isodat version 3.0軟件用于同位素值的計算和數(shù)據(jù)獲取。獨立樣本t-檢驗和主成分分析（principal component analysis，PCA）采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。繪圖軟件采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 礦質(zhì)元素含量測定結(jié)果

表2 有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒元素含量比較Table 2 Comparison of elemental contents between organic and non-organic wines mg/L

如表2所示，賀蘭山產(chǎn)區(qū)有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的元素含量總體分布趨勢一致，但Ca、K、Mg和Na含量遠(yuǎn)高于其他元素。t-檢驗分析顯示有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒樣品中僅K、Mg、Na、Al和Cu相對大量元素有顯著差異（P＜0.05），而微量元素沒有顯著差異。有機(jī)葡萄酒中K、Na和Cu含量顯著高于無機(jī)葡萄酒，而Mg、Al則相反。有機(jī)葡萄酒中各元素變異范圍為14.77%～55.56%，而非有機(jī)葡萄酒中各元素變異范圍較大，為7.71%～114.29%，較大的變異可能與葡萄酒的年份和品種差異有關(guān)。

影響葡萄酒中元素含量變化的并不僅是產(chǎn)地差異。已有研究表明，耕作方式的差異可直接影響葡萄酒中微量元素含量[14-15]。有機(jī)和非有機(jī)葡萄的種植和生產(chǎn)地較為接近，土壤中元素背景含量理論上應(yīng)一致，因此葡萄酒中元素含量差異來源可能與肥料種類和使用量有關(guān)[11]。長期使用有機(jī)肥料可導(dǎo)致土壤中某些元素的富集[18-19]，其次也可能引入一些土壤中原來沒有或者含量很少的微量元素，同時也可能降低一些元素的有效性和可利用性[20]。本實驗結(jié)果可以看出，有機(jī)肥料的使用增加了葡萄酒中K、Na和Cu的含量。由于我國北方土壤中一般不缺K[21]，因此葡萄園幾乎不使用K肥，有機(jī)葡萄中較高的K含量一方面可能與有機(jī)肥中含有一定量的K有關(guān)，另一方面可能是有機(jī)肥料對土壤的改良作用促進(jìn)了K的吸收和利用[22]。無機(jī)肥料的使用增加了葡萄酒中Mg和Al的含量，說明化肥使用可能引入了Mg和Al[23]，或者由于化肥的使用引起土壤性質(zhì)的改變[16]，提高了Mg和Al可利用性，從而引起葡萄中Mg和Al含量增加。因此，可通過元素含量追蹤種植方式的差異，實現(xiàn)對同一產(chǎn)區(qū)的有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的有效鑒別。

2.2 揮發(fā)性成分C穩(wěn)定同位素比值

圖1 有機(jī)（n=10）和非有機(jī)（n=9）葡萄酒中5種揮發(fā)性成分的C比較Fig. 1 Comparisons of the mean carbon stable isotope ratios (δ13C) of several volatile components between organic (n = 10) and non-organic (n = 9) winesδ13

如圖1所示，對2 種葡萄酒中5種揮發(fā)性組分的C穩(wěn)定同位素比值分析表明，有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒乙醇的δ13C值分別為-（26.71±0.25）‰和-（25.77±0.56）‰，而丙三醇的δ13C值分別為-（31.53±0.41）‰和-（29.85±0.47）‰。由此可見，有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒之間在乙醇和丙三醇的δ13C值上具有顯著差異（P＜0.05）。乙醇和丙三醇為葡萄酒主要發(fā)酵產(chǎn)物，其C同位素比值取決于葡萄漿果的C穩(wěn)定同位素比值。植物體C穩(wěn)定同位素比值與種類[24]和種植方式有關(guān)，如肥料的使用[25]。同時土壤N素與植物C同位素比值也存在著一定相關(guān)性[26]，可以推測有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒之間乙醇和丙三醇δ13C的顯著差異與肥料的使用有關(guān)。相反，2-甲基丁醇、乳酸乙酯和醋酸等次生發(fā)酵產(chǎn)物與肥料使用關(guān)系不大，與發(fā)酵工藝過程關(guān)系更密切[17]，因此其同位素比值差異不顯著。

2.3 N穩(wěn)定同位素特征

圖2 非有機(jī)（n=9）和有機(jī)（n=10）葡萄酒中δ15N的比較Fig. 2 Comparison of the mean nitrogen stable isotope ratios (δ15N) between non-organic (n = 9) and organic (n = 10) wines

葡萄酒中有機(jī)質(zhì)的N同位素主要來自于土壤中氮肥。如圖2所示，非有機(jī)和有機(jī)葡萄酒中有機(jī)質(zhì)的δ15N值分別為（2.20±0.40）‰和（4.36±0.58）‰，因此有機(jī)葡萄酒N穩(wěn)定同位素極顯著高于非有機(jī)種植葡萄酒（P＜0.01）。N穩(wěn)定同位素分析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)與非有機(jī)農(nóng)作物的區(qū)分[27-29]。由于化學(xué)合成氮肥（如尿素、碳酸氫銨）是由空氣中的N2在高溫高壓條件下合成的，并沒有發(fā)生N同位素分餾，因此δ15N值與N2很接近。有機(jī)肥多來源于植物不可食用部分和人畜糞便等經(jīng)過堆沃、發(fā)酵、殺蟲、滅菌等過程形成[30]，這些過程都會使有機(jī)肥料中的15N出現(xiàn)富集。Bateman等[31]研究發(fā)現(xiàn)，化學(xué)肥料中15N的豐度變化范圍小，80%的樣品中δ15N值為-2‰～2‰，98.2%的樣品δ15N值低于4‰，其平均值為0.1‰；而有機(jī)肥料（如堆肥、糞肥和魚粉等）中δ15N值變化范圍大，在0.2‰～36.2‰之間波動，其平均值為8.2‰。由此可見，有機(jī)肥料使用比例對葡萄酒中N穩(wěn)定同位素會顯著影響，因而可作為區(qū)分有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒的關(guān)鍵指標(biāo)。

2.4 有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的區(qū)分

圖3 有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒中元素含量和穩(wěn)定同位素比值的PCAFig. 3 PCA plot of elemental contents and stable isotope compositions of organic and non-organic wines

目前對有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行區(qū)分的研究有近紅外[6]、有機(jī)組分含量[32-33]等方法，從區(qū)分的準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性來看并不理想。C、N穩(wěn)定同位素比值以及元素含量由于與耕作方式密切相關(guān)，因此可提供較為準(zhǔn)確和穩(wěn)定的判別能力。本研究結(jié)合PCA法對K、Na、Mg、Al、Cu、δ13C乙醇、δ13C丙三醇以及δ15N等差異顯著的指標(biāo)值進(jìn)行PCA。將所有數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。PCA提取的3 個主成分可解釋82.59%的方差，利用所獲得的主成分得分值可對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)有機(jī)與非有機(jī)葡萄酒實現(xiàn)有效區(qū)分，如圖3所示。有機(jī)葡萄酒數(shù)據(jù)點分布較為分散可能與樣本中有機(jī)葡萄酒的葡萄品種多樣化有關(guān)，但總體上有機(jī)與非有機(jī)種植引起的差異要大于葡萄品種不同產(chǎn)生的差異。從本研究結(jié)果來看，C、N穩(wěn)定同位素顯示了較好的應(yīng)用前景。雖然本研究采集樣品僅針對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)，所獲的結(jié)論可以推廣到全國其他葡萄酒主產(chǎn)區(qū)。通過更多產(chǎn)區(qū)樣本的分析，建立我國不同產(chǎn)地有機(jī)葡萄酒數(shù)據(jù)庫，可實現(xiàn)對我國有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的區(qū)分。

3 結(jié) 論

本研究通過分析葡萄酒中相對大量的元素含量、揮發(fā)性成分C穩(wěn)定同位素以及干物質(zhì)N穩(wěn)定同位素比值，對有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒進(jìn)行了鑒別。結(jié)果表明，有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒由于種植模式和肥料使用的差別，導(dǎo)致穩(wěn)定同位素以及元素含量發(fā)生顯著變化，因此通過分析葡萄酒中C、N穩(wěn)定同位素以及元素含量，可以實現(xiàn)對有機(jī)和非有機(jī)葡萄酒的精確區(qū)分。與其他研究有機(jī)葡萄酒鑒別方法相比，利用穩(wěn)定同位素和元素含量對有機(jī)葡萄酒進(jìn)行鑒別，具有準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點。本研究結(jié)果對該地區(qū)乃至全國的有機(jī)葡萄酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展和摻假鑒定提供重要的參考依據(jù)。

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Differentiation between Organic and Non-Organic Wines from Helan Mountain East Region Based on Elemental Contents and Stable Isotope Ratios

WU Hao1, ZHOU Yu2, CHEN Jingbo2, CHEN Deqi3, JIN Xiaolei1, JIN Baohui1, XIE Liqi1, LIN Guanghui4,5
(1. Food Inspection Center of CIQ-Shenzhen, Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shenzhen 518016, China; 2. Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361000, China; 3. Ningxia Daylong Wine Co. Ltd., Yinchuan 750100, China; 4. Graduate School at Shenzhen, Tsinghua University, Shenzhen 518055, China; 5. Key Laboratory for Earth System Modeling, Ministry of Education, Department of Earth System Science, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

In this study, we analyzed elemental contents and stable isotope ratios of carbon (C) and nitrogen (N) in organic and non-organic wines from Helan mountain east region in Ningxia of China and then used the obtained data to distinguish between the two wines. Our results showed that there were significant differences in the contents of several metal elements including Na, Mg, K, Al and Cu between the organic and non-organic wines and that the δ13C ratios of ethyl alcohol and glycerol in the organic wine were much lower than those in the non-organic one, but the N stable isotope ratios were significantly higher than those in the non-organic one. Thus, C and N stable isotopes and the contents of selected metal elements could be used to effectively distinguish between organic and non-organic wines by principal component analysis. This method has a great potential to be applied for organic wine authentication and therefore can provide a technical support for the development of the wine industry in this region.

organic fertilizer; grape; alcoholic beverage; metal element; food authentication

10.7506/spkx1002-6630-201716040

TS262.6

A

1002-6630（2017）16-0251-05

吳浩, 周昱, 陳靖博, 等. 基于元素含量和穩(wěn)定同位素比值的寧夏賀蘭山東麓地區(qū)有機(jī)葡萄酒甄別[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 251-255. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716040. http://www.spkx.net.cn

WU Hao, ZHOU Yu, CHEN Jingbo, et al. Differentiation between organic and non-organic wines from Helan mountain east region based on elemental contents and stable isotope ratios[J]. Food Science, 2017, 38(16): 251-255. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716040. http://www.spkx.net.cn

2016-10-10

中國博士后科學(xué)基金項目（2014M562196）；深圳出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（SZ2014208；SZ2015103）作者簡介：吳浩（1984—），男，高級工程師，博士，研究方向為穩(wěn)定同位素生態(tài)學(xué)。E-mail：whakyo@foxmail.com