肖 旺，孫大文，蒲洪彬，韋慶益*

基于癸硫醇修飾的銀納米點陣列的苯并（a）芘檢測

肖 旺，孫大文，蒲洪彬，韋慶益*

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，現(xiàn)代食品工程研究中心，廣東省冷鏈?zhǔn)称分悄芨兄c過程控制工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510640）

利用陽極氧化鋁模板法制備大面積高度有序的可調(diào)控的銀納米點陣列，并在其表面組裝一層癸硫醇單分子層用于水中苯并（a）芘（benzo(a)pyrene，BaP）的快速檢測。首先，通過掃描電鏡、紫外-可見透過光譜、羅丹明6G探針分子對不同擴孔時間制備的銀納米點陣列進(jìn)行表征，結(jié)果表明擴孔時間為80 min制備的基底拉曼增強效果最好，增強因子可達(dá)1.6×106。然后，在此基底表面修飾一層癸硫醇分子，利用癸硫醇與BaP之間的疏水相互作用可以實現(xiàn)BaP的預(yù)富集，進(jìn)而實現(xiàn)BaP的高靈敏度、穩(wěn)定的檢測。研究表明：利用此基底檢測BaP的檢測限可達(dá)1.0 ng/mL，特征峰處的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.7%，滿足高穩(wěn)定性表面增強拉曼光譜基底的標(biāo)準(zhǔn)。該方法在BaP快速檢測方面具有極大的潛力。

表面增強拉曼光譜；苯并（a）芘；銀納米點陣列；陽極氧化鋁

苯并（a）芘（benzo(a)pyrene，BaP）是由一個芘分子與一個苯環(huán)稠合而成的一種多環(huán)芳烴類化合物[1]，會暴露在空氣、土壤及水等環(huán)境中，具有高度致癌性[2]。目前常用于檢測BaP的方法包括熒光光譜法[3-4]、液相色譜結(jié)合熒光法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-9]等。這些方法大多需要昂貴的設(shè)備，檢測步驟復(fù)雜、耗時、需要消耗大量的化學(xué)試劑。因此，建立一種快速、高通量、靈敏度高的檢測BaP的方法具有重要意義。

表面增強拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）是一種通過貴重金屬納米結(jié)構(gòu)（金、銀、銅）增強分子拉曼信號的振動光譜技術(shù)，它不需要標(biāo)記，具有快速、無損、靈敏高的特點，常用于食品、環(huán)境、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的生物或化學(xué)分析[10-11]。SERS的增強機理主要包括電磁增強和化學(xué)增強，其中電磁增強起主導(dǎo)作用。電磁增強主要是由于金屬表面的局域表面等離子體共振（localized surface plasmon resonance，LSRP），通?？拷饘偌{米結(jié)構(gòu)邊緣或者處于納米結(jié)構(gòu)間隙的區(qū)域會產(chǎn)生更強的LSRP，進(jìn)而更容易形成SERS“熱點”[12]。SERS的化學(xué)增強主要是指分析物與金屬納米顆粒之間形成化學(xué)鍵，或在其表面吸附聚集等[13]。

目前，已有相關(guān)研究利用SERS技術(shù)檢測食用油或水中的BaP。由于BaP沒有特殊官能團能夠與金屬納米結(jié)構(gòu)表面相互作用，很難直接利用金或銀納米結(jié)構(gòu)基底對BaP進(jìn)行檢測，因此需要對基底進(jìn)行修飾。例如，Du Jingjing等[14]利用硫醇修飾的Fe3O4@Ag磁性納米粒子檢測水中的BaP；Fu Shuyue等[15]利用植酸修飾的金納米粒子溶膠檢測食用油中的BaP。但是基于納米粒子溶膠的方法大多穩(wěn)定性較差，這是因為納米粒子尺寸差異大，檢測分子在納米溶膠體系中分布不均勻，且容易發(fā)生聚集。通常利用模板法制備的固體納米結(jié)構(gòu)基底具有較好的穩(wěn)定性，本研究利用陽極氧化鋁（anodic aluminum oxide，AAO）模板法制備了高度有序的銀納米點陣列，并在納米點陣列表面組裝了一層癸硫醇，利用癸硫醇與BaP之間的范德華力可以實現(xiàn)BaP的預(yù)聚集，進(jìn)而實現(xiàn)BaP的檢測。本實驗旨在建立一種基于癸硫醇修飾的銀納米點陣列快速、穩(wěn)定檢測BaP的方法，為環(huán)境中多環(huán)芳烴類污染物的檢測提供一種重要的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單通多孔AAO模板（孔徑50 nm，孔間距100 nm，孔深300 nm） 上海上木科有限公司；99.999%純銀顆粒 北京中金研新材料科技有限公司；石英片（30 mm×30 mm×1 mm） 江蘇久通石英制品有限公司；聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；BaP、癸硫醇 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、丙酮、二氯甲烷、磷酸、鹽酸、水合四氯化錫均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LabRAM HR Evolution顯微共聚焦拉曼光譜儀 法國Horiba公司；JC450-4C熱蒸發(fā)鍍膜設(shè)備 沈陽聚智真空設(shè)備有限公司；KW-4A臺式勻膠機 中國科學(xué)院微電子研究所；Merlin掃描電子顯微鏡 德國蔡司公司；L5S紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB-25-12DT超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；JC101電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海成順儀器儀表有限公司；HH-2恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 銀納米點陣列的制備

采用AAO模板法[16-18]制備銀納米點陣列，具體流程如圖1所示。操作要點如下：

1）旋涂PMMA：在單通AAO模板正面旋涂2 mL含6% PMMA的二氯甲烷溶液，然后放置在加熱板上150 ℃條件下加熱30 min。PMMA層在后續(xù)的處理過程中可以起到保護作用。

2）去鋁基：利用置換反應(yīng)除去鋁基。按無水SnCl4與去離子水體積比1∶4配制SnCl4溶液，將PMMA-AAO模板浸泡在加熱到60 ℃的SnCl4溶液中，鋁基與SnCl4溶液發(fā)生劇烈的置換反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，將PMMA-AAO撈起，依次用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的HCl溶液、去離子水沖洗。

3）去阻擋層及擴孔：把PMMA-AAO浸泡在30 ℃條件下質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的磷酸溶液中，保持PMMA面朝上，分別反應(yīng)50、65、80 min得到不同孔徑的AAO模板。

4）去PMMA及與基片的結(jié)合：在培養(yǎng)皿中加入1/3量的丙酮，將清洗干凈的石英片放在培養(yǎng)皿中，然后把經(jīng)過擴孔的PMMA-AAO放在石英片上方，PMMA面朝上，輕輕搖晃培養(yǎng)皿30 s左右，利用鑷子拖出PMMA層，使AAO與PMMA分離，浸泡60 min，更換丙酮再次浸泡60 min，最后利用丙酮輕輕沖洗AAO模板樣品表面，放入真空干燥箱中烘干備用。

5）真空鍍銀：將承載不同孔徑雙通AAO模板的石英片置于真空鍍膜機中，在真空度為6×10-5Pa、蒸發(fā)速率為0.3～0.4 nm/s的條件下蒸鍍一層50 nm厚的銀膜。

6）去AAO模板：蒸鍍后利用靜電膠帶去除AAO模板及表層的銀，得到附在石英片上的銀納米點陣列。

圖1 AAO模板法制備銀納米點陣列的流程圖Fig. 1 Schematic diagram of the fabrication of Ag nanodot arrays using AAO template method

1.3.2 拉曼探針分子羅丹明6G的SERS檢測及增強因子的計算

選用羅丹明6G作為拉曼探針分子，利用制備的銀納米點陣列作為基底采集1.0×10-6mol/L羅丹明6G溶液的SERS。滴加5 μL的羅丹明6G溶液于基底上，自然晾干后采集單點的SERS，每個樣品重復(fù)測定3 次。檢測條件：633 nm激光器；積分時間10 s，累積次數(shù)2 次。另外，在相同的測試條件下檢測1.0×10-3mol/L羅丹明6G溶液的普通拉曼光譜，利用Gupta等[19]報道的方法計算銀納米點陣列的增強因子：

式中：EF為增強因子；IRaman和ISERS分別為探針分子的普通拉曼特征峰強度和SERS特征峰強度；NRaman和NSERS分別為對普通拉曼和SERS有貢獻(xiàn)的探針分子數(shù)。

1.3.3 癸硫醇修飾

由于BaP無法吸附在銀納米點顆粒表面，很難直接利用銀納米基底檢測BaP[20]。在銀納米點陣列表面修飾一層癸硫醇會改變基底的界面性質(zhì)，另外利用癸硫醇與BaP之間的范德華力可以實現(xiàn)BaP的預(yù)聚集。

修飾方法：將制備好的銀納米點陣列用蒸餾水沖洗干凈，在20 mL 1 mmol/L的癸硫醇乙醇溶液中浸泡24 h，然后用無水乙醇輕輕沖洗，烘干待用。

1.3.4 BaP檢測

取BaP粉末10 mg溶于100 mL無水乙醇中，得到10-4g/mL的BaP乙醇溶液，然后利用去離子水稀釋分別得到1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1× 10-9g/mL的BaP溶液，將修飾后的基底浸泡在BaP溶液中10 min，然后在1.3.2節(jié)相同條件下進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)測定3 次。另外，利用Mapping直線成像模式采集50 個點的1×10-5g/mL BaP溶液的拉曼光譜，范圍100 μm，步長2 μm，研究此基底檢測BaP的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Image J圖像處理軟件測定納米點的粒徑；利用LabSpec 6軟件進(jìn)行拉曼光譜的前處理：去噪、去背景、標(biāo)峰位；運用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀納米點陣列的表征

2.1.1 不同擴孔時間AAO模板和Ag納米點陣列的掃描電子顯微鏡圖像

圖2 不同擴孔時間AAO模板和銀納米點陣列的掃描電子顯微鏡圖Fig. 2 SEM images of AAO and Ag nanodot arrays with different expanding times

如圖2所示，雙通AAO模板和銀納米點陣列大面積高度有序，分布均勻，形狀大小較為一致，孔徑和粒徑的標(biāo)準(zhǔn)差在3 nm以內(nèi)；隨著擴孔時間的延長，雙通AAO模板的孔徑逐漸增大（從60.4～79.3 nm），同時銀納米點陣列的粒徑也相應(yīng)增大（從59.6～78.4 nm），AAO模板的孔徑和銀納米點陣的粒徑基本保持一致。但是銀納米點陣的平均粒徑比AAO模板的平均孔徑略?。ú钪翟? nm以內(nèi)），可能是模板有一定的深度，蒸鍍過程中銀無法完全填滿AAO小孔的底部。由以上分析可知，可以通過控制擴孔時間來調(diào)控銀納米陣列中顆粒的粒徑，進(jìn)而對SERS活性基底進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.2 紫外-可見透過光譜結(jié)果

由于石英片在可見光范圍內(nèi)是透明的，可以直接通過透過光譜對銀納米點陣列的局域表面等離子體共振進(jìn)行表征。如圖3所示，在400～700 nm范圍內(nèi)，銀膜表現(xiàn)出較寬的吸收譜帶，而銀納米點陣列則表現(xiàn)出明顯的LSRP吸收帶，主要集中在450 nm左右。隨著納米點陣列粒徑的變大，LSRP吸收帶發(fā)生一定程度的藍(lán)移，且強度相應(yīng)變大。發(fā)生藍(lán)移的主要原因是：納米點間距的減小會加快磁場的共振頻率進(jìn)而導(dǎo)致共振峰位向高頻移動[21]。由以上分析可知，納米點粒徑越大，LSRP效應(yīng)越強，依據(jù)電磁增強理論，其增強因子將會越大。

圖3 不同粒徑銀納米點陣列的透過光譜Fig. 3 UV-VIS transmission spectrum of Ag nanodot arrays with different pore diameters

2.1.3 探針分子的拉曼光譜

圖4 探針分子羅丹明6G的拉曼光譜Fig. 4 Raman spectra of raman probe molecule (Rhodamine 6G)

為探究不同粒徑銀納米點陣列的拉曼增強效果，先利用未修飾過的基底檢測探針分子羅丹明6G的拉曼光譜。如圖4所示，隨著納米點陣列粒徑的增大，拉曼信號顯著增強，且粒徑為78.4 nm的銀納米點陣列的SERS信號最強，利用1.3.2節(jié)公式計算得到其增強因子為1.6×106。這是因為隨著納米點陣列粒徑變大，納米點之間的間距變小，LSRP效應(yīng)增強，能夠產(chǎn)生更多的“熱點”，從而拉曼光譜強度增大[22]，這與圖3紫外-可見光譜表征的結(jié)果一致。依據(jù)SERS的電磁增強原理，納米點顆粒之間的距離越近，增強因子會越大[23]。但是，當(dāng)擴孔時間大于80 min之后，超薄的AAO模板已經(jīng)沒有穩(wěn)定牢固的構(gòu)架，給實驗操作帶來極大的難度。在后續(xù)實驗中選擇粒徑為78.4 nm的銀納米點陣列進(jìn)行修飾，然后檢測BaP溶液。

2.2 BaP檢測的定性分析

在檢測BaP之前，首先在銀納米點陣列表面修飾一層癸硫醇單分子層。圖5b為修飾后基底的SERS，明顯為癸硫醇的拉曼光譜，其中709 cm-1對應(yīng)反式C—S鍵的伸縮振動，890 cm-1對應(yīng)CH3基團的彎曲振動，1 066 cm-1對應(yīng)間扭式C—C鍵的伸縮振動，1 122 cm-1對應(yīng)反式C—C鍵的伸縮振動[24]。利用修飾后的基底檢測得到10 mg/L BaP樣品的拉曼光譜，如圖5a所示，與癸硫醇修飾的基底和BaP固體標(biāo)準(zhǔn)品的拉曼峰對比得知，除了包含癸硫醇的拉曼峰（704、875、1 070、1 122 cm-1）之外，還出現(xiàn)一些新的峰（1 232、1 340、1 379、1 578 cm-1等），而這些峰與BaP標(biāo)準(zhǔn)品的峰基本對應(yīng)，說明修飾后的基底可以實現(xiàn)BaP的檢測。在這些新出現(xiàn)拉曼峰中，1 379 cm-1對應(yīng)芳香環(huán)上C—C鍵的伸縮振動，1 351 cm-1對應(yīng)C—C—C鏈的反對稱伸縮振動，1 232、1 578 cm-1均與芳香環(huán)上H的偏轉(zhuǎn)有關(guān)[25-26]。另外，與癸硫醇光譜相比，樣品的拉曼峰中C—S鍵的峰從709 cm-1處偏移到704 cm-1處，說明BaP分子進(jìn)入了癸硫醇單分子層內(nèi)部，一定程度上影響了癸硫醇的分子取向[27]。

圖5 BaP樣品、癸硫醇修飾的基底和BaP固體標(biāo)準(zhǔn)品拉曼光譜Fig. 5 Raman spectra of 10 mg/L BaP, decanethiol-modified substrate, and solid BaP standard

2.3 BaP檢測的定量分析

利用修飾后的基底檢測了不同質(zhì)量濃度BaP樣品的SERS，對其進(jìn)行定量分析。圖6為去基線后質(zhì)量濃度1×10-9～1×10-5g/mL BaP樣品的拉曼光譜，隨著質(zhì)量濃度的升高，BaP的拉曼特征峰（1 232、1 340、1 379、1 493 cm-1）的強度逐漸增強，說明強度和質(zhì)量濃度的相關(guān)性較好。另外，隨著BaP在質(zhì)量濃度的增大，癸硫醇的特征峰（704、1 122 cm-1）強度有一定的減弱，可能是因為高質(zhì)量濃度時，較多的BaP分子進(jìn)入癸硫醇單分子層影響了癸硫醇分子的振動。

圖6 不同質(zhì)量濃度BaP樣品的拉曼光譜Fig. 6 Raman spectra of BaP sample at different concentrations

利用1 379 cm-1處的峰強進(jìn)行定量分析得到如圖7所示的拉曼強度-質(zhì)量濃度曲線，1 379 cm-1處的強度與BaP質(zhì)量濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。線性擬合得到方程y＝233.42x+2 1147.9，其中相關(guān)系數(shù)R2為0.981 7。對BaP溶液的檢測限為1×10-9g/mL，雖然未達(dá)到GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中飲用水BaP含量的限量標(biāo)準(zhǔn)（1×10-11g/mL），但通過對基底的進(jìn)一步優(yōu)化，該方法仍具有極大的潛力。理論上，SERS基底的增強因子可達(dá)106～109，特殊情況下甚至可以達(dá)到“單分子水平”檢測[28]。本實驗中制備的基底增強因子僅為1.6×106，主要是因為擴孔時間大于80 min后，超薄的AAO模板已經(jīng)沒有穩(wěn)定牢固的構(gòu)架，操作難度大。為達(dá)到國標(biāo)中的限量標(biāo)準(zhǔn)，在今后的研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，制備粒徑更大的銀納米點陣列，從而獲得更大的增強因子。另一方面，可以制備金銀復(fù)合納米點陣列，通常，金銀復(fù)合納米結(jié)構(gòu)基底比單獨的金或銀基底增強因子更大[29]。

圖7 BaP樣品1 379 cm－1處的拉曼強度與質(zhì)量濃度的關(guān)系圖Fig. 7 Raman intensity at 1 379 cm-1 of BaP sample at different concentrations

2.4 穩(wěn)定性分析

為了探究基底檢測BaP的穩(wěn)定性，利用直線Mapping模式收集了51 個點的拉曼光譜，成像結(jié)果如圖8所示，圖像整體色度較為分明，表明整體的穩(wěn)定性較好。其中癸硫醇C—S鍵的特征峰位（705 cm-1）和BaP的定量峰位（1 379 cm-1）處明暗均一，成像效果較好。圖9為51 個點1 379 cm-1處的拉曼強度值，計算得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.7%，滿足一個高穩(wěn)定性SERS基底的標(biāo)準(zhǔn)[30]。

圖8 質(zhì)量濃度為mL的BaP樣品的拉曼成像圖Fig. 8 Raman mapping of 1 ×g/mL BaP solution g/

圖9 BaP樣品在1 379 cm－1處的拉曼強度Fig. 9 Raman intensity of BaP solution at 1 379 cm-1

本實驗建立了一種基于癸硫醇修飾的銀納米點陣列SERS基底快速檢測水中BaP的方法。首先，通過擴孔時間可以調(diào)控銀納米點陣列的粒徑，研究表明粒徑越大的銀納米點陣列拉曼增強效果越好。其次，通過在銀納米點陣列表面組裝一層癸硫醇實現(xiàn)了水中BaP的高靈敏度、穩(wěn)定性的檢測。利用此基底檢測BaP的檢測限可達(dá)1.0 ng/mL，特征峰處的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.7%，滿足一個高穩(wěn)定性SERS基底的標(biāo)準(zhǔn)。該方法在BaP現(xiàn)場檢測方面具有極大的潛力。

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Rapid Detection of Benzo(a)pyrene Using Decanethiol-Functionalized Ag Nanodot Arrays

XIAO Wang, SUN Dawen, PU Hongbin, WEI Qingyi*
(School of Food Science and Engineering, Academy of Contemporary Food Engineering, Engineering and Technological Research Centre of Guangdong Province on Intelligent Sensing and Process Control of Cold Chain Foods, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

A large-area, highly-ordered Ag nanodot array was prepared by anodic aluminum oxide (AAO) template method. A monolayer of decanethiol was then assembled on the surface of the nanodot array for the rapid detection of benzo(a)pyrene (BaP). The Ag nanodots array was characterized by scanning electron microscopy (SEM), UV-visible spectroscopy, and rhodamine 6G probe. The results showed that the best Raman enhancement effect of surface enhanced Raman spectroscopy (SERS)-active substrate was achieved by 80 min pore broadening, with an enhancement factor of up to 1.6 × 106. Then, a layer of decanethiol molecules was modified on the surface of the substrate. The pre-concentration of BaP could be achieved by the hydrophobic interaction between decanethiol and BaP. Sensitive and reproducible detection of BaP could be realized. The detection limit (LOD) of BaP was 1.0 ng/mL, and the relative standard deviation (RSD) of characteristic Raman peak was 9.7%, which met the standard for a highly repeatable SERS substrate. This method has a great potential in the rapid detection of BaP.

surface-enhanced Raman spectroscopy; benzo(a)pyrene; Ag nanodot arrays; anodic aluminum oxide

10.7506/spkx1002-6630-201716048

O657.37

A

1002-6630（2017）16-0298-06

肖旺, 孫大文, 蒲洪彬, 等. 基于癸硫醇修飾的銀納米點陣列的苯并(a)芘檢測[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(16): 298-303. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201716048. http://www.spkx.net.cn

XIAO Wang, SUN Dawen, PU Hongbin, et al. Rapid detection of benzo(a)pyrene using decanethiol-functionalized Ag nanodot arrays[J]. Food Science, 2017, 38(16): 298-303. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201716048. http://www.spkx.net.cn

2017-02-18

廣州市協(xié)同創(chuàng)新重大專項（201604020007）

肖旺（1992—），男，碩士研究生，研究方向為食品快速無損檢測。E-mail：xiaowangml@163.com

*通信作者：韋慶益（1977—），女，副教授，博士，研究方向為食品快速無損檢測。E-mail：feweiqingyi@scut.edu.cn