楊東升，朱齊南

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程系，海南?？?70228）

低壓貯藏對(duì)甜米酒高級(jí)醇和酯的影響

楊東升，朱齊南

（海南大學(xué)材料與化工學(xué)院生物工程系，海南?？?70228）

低壓CO2貯藏海南甜米酒，是一種非熱加工貯藏的方法。將進(jìn)入酵母主發(fā)酵后期的甜米酒清液裝入耐壓容器中，利用酵母自產(chǎn)CO2所形成的壓力對(duì)甜米酒進(jìn)行保鮮貯藏。在帶壓貯藏期中，酵母生長(zhǎng)受限于壓力和CO2濃度，因而酒中大部分殘?zhí)窃?2個(gè)月貯藏后得以保留，使甜米酒依然具備甜的自然屬性。壓力貯藏令主要風(fēng)味物質(zhì)高級(jí)醇和酯類的生成受到抑制。高級(jí)醇在壓力貯藏期前期生成量大，后期由于發(fā)生轉(zhuǎn)化作用而有所減少，對(duì)風(fēng)味影響較小。酯類在壓力貯藏后期持續(xù)增加，主要是因?yàn)楦呒?jí)醇的酯化反應(yīng)生成。主要酯成分乳酸乙酯在壓力貯藏期間增加2.45倍，強(qiáng)化了其主要香味特征。

低壓貯藏；甜米酒；高級(jí)醇；酯

甜米酒是海南最受歡迎的酒精氣體飲料，主要產(chǎn)自五指山、保亭、白沙、瓊中等黎族苗族地區(qū)[1]。原料采用當(dāng)?shù)禺a(chǎn)旱稻——山蘭稻，山蘭稻種類繁多，適宜釀甜酒的一般是糯山蘭稻，外皮顏色略帶紅褐色。由于山蘭稻產(chǎn)量較少，而甜米酒需求量大，因此，市面上出現(xiàn)了許多以普通糯米為原料釀成的甜米酒。因其相同的釀制工藝，成品口感基本不變。酒曲的采用各地不同，原始作坊多采用米粉加某些植物塊莖等搗碎釀成的土制酒曲；現(xiàn)代作坊多采用市售酒曲，產(chǎn)出甜酒風(fēng)格基本一致，淡紫紅色，以甜味為主，略帶酸，少許苦，酒精度約為5%～8%（體積分?jǐn)?shù)），其中的特殊香氣物質(zhì)使海南甜米酒酒體豐滿，具備良好的適口性。然而，甜米酒不容易保存，一般在25℃下放置3 d以上，酒質(zhì)就會(huì)發(fā)生變化，主要體現(xiàn)在酒味沖，苦味重，甚至酸敗。在冰箱（5℃）中也只能保存30 d。因此，如何延長(zhǎng)其貨架期是目前研究的重點(diǎn)。用加熱的方法可以延長(zhǎng)其貨架期，像中國(guó)黃酒一樣，通過(guò)加熱殺滅微生物再裝瓶包裝[2]，但會(huì)使甜米酒失去特有的氣體飲料的特性，同時(shí)容易使其特有的香氣物質(zhì)揮發(fā)掉。用非熱處理的方法——低壓CO2貯藏甜米酒使其保持原來(lái)的風(fēng)味特色，通過(guò)定期抽樣測(cè)定高級(jí)醇以及酯類的變化，研究其對(duì)主要香氣物質(zhì)的影響是十分必要的。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

糯米、甜酒曲：海南省保亭黎族苗族自治縣縣城；耐壓（耐壓0.2 MPa）PVC空瓶（加裝壓力表）：超市；正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、甲酸乙酯、丁二酸二乙酯（GR級(jí)）：阿拉丁試劑公司；無(wú)水乙醇（GR級(jí)）：廣州化學(xué)試劑廠。

1．2 儀器設(shè)備

干燥空氣罐（氮純度79%）：?？诮鸷裉胤N氣體有限公司；高純氮罐：海口金厚特種氣體有限公司；GC-6890N氣相色譜儀、DB-1701毛細(xì)管色譜柱：（30 mm×0.32 nm×1 μm）：Agilent Technologies；DL-5000B-B 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；7001-A型CO2含量測(cè)定儀：廣東華勝科學(xué)儀器廠。

1．3 試驗(yàn)方法

糯米預(yù)處理：糯米1 kg清洗并篩凈于室溫下晾干，用電蒸鍋蒸煮30 min。將熟米自然攤涼至40℃～45℃。將甜酒曲研磨成粉末狀備用。

甜米酒發(fā)酵：1 kg熟米置于發(fā)酵容器內(nèi)，加入5 g酒曲充分?jǐn)嚢?。?層紗布蓋上蓋子置于室溫（25℃）發(fā)酵約7 d。將發(fā)酵醪置于5 000 r/min離心機(jī)中離心20 min，取上清液分別密封和敞口貯藏于耐壓PVC瓶中。敞口貯藏瓶口覆蓋八層紗布，加蓋。

甜米酒貯藏：甜米酒分別分瓶密封和敞口貯藏于耐壓瓶中，分別置于恒溫（5、25℃）室，定期取樣檢測(cè)，貯藏期一年。

CO2含量測(cè)定：用國(guó)產(chǎn)華勝CO2含量測(cè)定儀測(cè)定。

高級(jí)醇和酯含量測(cè)定：用高效氣相色譜方法測(cè)定[3-4]。

樣品預(yù)處理：酒液中含有部分CO2氣體和小部分的淀粉、糊精、葡萄糖、蛋白質(zhì)等非揮發(fā)性有機(jī)物，直接進(jìn)樣會(huì)對(duì)儀器進(jìn)樣口與色譜柱造成較大的危害，同時(shí)影響結(jié)果的精確度，因此先將酒液排氣，再用雙層紗布過(guò)濾，然后按乙醇測(cè)定的方法進(jìn)行蒸餾，蒸餾時(shí)加入適量消泡油，同時(shí)加入6粒玻璃珠。準(zhǔn)確收集餾出液95 mL后再經(jīng)蒸餾水定容到100 mL搖勻，靜止30 min后進(jìn)樣。

氣相色譜條件為，進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：230 ℃，分流比：20 ∶1；載氣類型：N2；流速：1.0 mL/min；柱溫采用程序升溫：初溫50℃，保持5 min后以15℃升至220℃，保持9 min；檢測(cè)器溫度：250℃；氫氣流量30 mL/min，空氣流量300 mL/min，尾吹氣流量20 mL/min。

殘?zhí)菧y(cè)定：斐林試劑法[5]。

乙醇含量測(cè)定：蒸餾密度瓶法。

酸度測(cè)定：精密pH計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力變化

澄清甜米酒分別分瓶密封和敞口貯藏于耐壓瓶中，分別置于恒溫（5、25℃）室，密封耐壓瓶中壓力迅速上升，可于貯藏2個(gè)月達(dá)到最大值，分別為0.13 MPa（25℃）和 0.1 MPa（5℃）（表 1）。貯藏期壓力基本無(wú)變化。

表1 貯藏期間壓力（相對(duì)）變化Table 1 Evolution of CO2top pressure(relative)during preservation

2.2 高級(jí)醇的變化

高級(jí)醇在貯藏期間濃度變化見(jiàn)圖1～圖5。

圖1 正丙醇在貯藏期間濃度變化Fig.1 Evolution of n-propyl alcohol concentration during preservation

在甜米酒貯藏期間，由于受CO2影響，酵母生長(zhǎng)受限，同時(shí)伴隨高級(jí)醇生成的受限。在貯藏的前4個(gè)月，可以觀察到敞口貯藏樣品的高級(jí)醇增長(zhǎng)曲線比密封的陡峭得多，接下來(lái)開(kāi)始下降（圖1～圖5）。

乙酸乙酯和高級(jí)醇構(gòu)成了黃酒的主要香氣物質(zhì)[6]。通過(guò)直接進(jìn)樣的氣相色譜分析方法，結(jié)合大量的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏年份的增加，黃酒中的異戊醇和β-苯乙醇是呈不斷減少趨勢(shì)的，同樣被發(fā)現(xiàn)減少的還有糠醛、苯甲醛[7]。在敞口的環(huán)境下，黃酒中的酵母在殘?zhí)潜缓谋M之前將不會(huì)停止發(fā)酵，并不斷生成酪醇、色醇等苦味高級(jí)醇[8]，總之，敞口發(fā)酵用利于積累各種高級(jí)醇[9]。而在極端環(huán)境下，如高壓、高鹽、高溫下，酵母的生長(zhǎng)代謝受到抑制，高級(jí)醇也就不能產(chǎn)生了。在CO2低壓貯藏過(guò)程中，可以觀察到酵母的生長(zhǎng)受限，同時(shí)高級(jí)醇生成也比敞口貯藏低得多。圖1～圖5中顯示了正丙醇、異丁醇、異戊醇、β-苯乙醇和總高級(jí)醇在開(kāi)始2個(gè)月壓力貯藏期間增長(zhǎng)幅度比敞口貯藏小得多，在后4個(gè)月中減少并輕微波動(dòng)。可以說(shuō)是壓力減緩了高級(jí)醇的增長(zhǎng)。

因?yàn)楦呒?jí)醇分別是氨基酸和糖代謝的產(chǎn)物，因此影響酵母對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的參數(shù)如溫度等同樣影響高級(jí)醇的生成[10]。圖1～圖5顯示不管有沒(méi)有壓力存在，溫度越高，高級(jí)醇生成量越大，而低溫可以強(qiáng)化CO2的作用。在實(shí)際應(yīng)用中，帶壓發(fā)酵已經(jīng)被成功運(yùn)用于補(bǔ)償由于提高發(fā)酵溫度帶來(lái)的酒風(fēng)味缺失。在發(fā)酵過(guò)程中逐漸加大施以0.1 MPa的壓力，可以發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比敞口發(fā)酵有所減少。除了高級(jí)醇外，酯的含量因不同壓力也會(huì)發(fā)生不同變化。在發(fā)酵期間，增加CO2壓力用來(lái)減少因?yàn)樯邷囟榷黾拥母呒?jí)醇。這項(xiàng)操作可以減少高達(dá)50%的高級(jí)醇，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，壓力發(fā)酵對(duì)應(yīng)提高的發(fā)酵溫度可以高達(dá)0.18 MPa[11]。

圖2 異丁醇在貯藏期間濃度變化Fig.2 Evolution of isobutyl alcohol concentration during preservation

圖3 異戊醇在貯藏期間濃度變化Fig.3 Evolution of isoamyl alcohol concentration during preservation

圖4 β-苯乙醇在貯藏期間濃度變化Fig.4 Evolution of β-phenylethyl alcohol concentration during preservation

圖5 總高級(jí)醇在貯藏期間濃度變化Fig.5 Evolution of total higher alcohols concentration during preservation

2.3 酯的變化

乳酸乙酯和乙酸乙酯是甜米酒中的主要揮發(fā)酯。本文研究了海南甜米酒中乳酸乙酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯和丁二酸二乙酯在CO2壓力貯藏下的變化，結(jié)果見(jiàn)圖 6～圖 10。

圖6 乙酸乙酯在貯藏期間濃度變化Fig.6 Evolution of ethyl acetate concentration during preservation

圖7 乳酸乙酯在貯藏期間濃度變化Fig.7 Evolution of ethyl lactate concentration during preservation

圖8 甲酸乙酯在貯藏期間濃度變化Fig.8 Evolution of ethyl formate concentration during preservation

圖9 丁二酸二乙酯在貯藏期間濃度變化Fig.9 Evolution of diethyl succinate concentration during preservation

從圖7、圖9可見(jiàn)乳酸乙酯和丁二酸二乙酯分別從0.1 mg/L上升到0.9 mg/L，從0.05 mg/L上升到0.6 mg/L。雖然乳酸乙酯增加了2.45倍，甲酸乙酯卻只增加了10%（圖8）。比較敞口貯藏，壓力貯藏限制了酯類的生成量（圖 6～圖 10）。

中國(guó)黃酒貯藏過(guò)程中同樣發(fā)現(xiàn)乳酸乙酯隨著年份的增加而增加。而在封閉的環(huán)境下，在相對(duì)較短時(shí)期內(nèi)發(fā)現(xiàn)總酯和乙酸乙酯的減少，癸酸乙酯的巨幅增加[12]。乳酸乙酯的快速增加意味著酒液當(dāng)中乳酸的增加，當(dāng)然這取決于乳酸菌的作用。因此，在發(fā)酵的后期，很可能存在著酵母與乳酸菌的競(jìng)爭(zhēng)，酵母與乳酸菌均生長(zhǎng)良好直到受到CO2壓力和酒精的抑制作用為止，富余的乳酸用來(lái)生成乳酸乙酯[13]。

壓力和溫度是甜米酒生產(chǎn)的主要參數(shù)，正如前面所述，溫度有助于強(qiáng)化壓力對(duì)酯生成的影響。低溫（5℃）下生成的酯比高溫（25℃）下生成的酯要少（圖6～圖10）。增加發(fā)酵溫度能減少發(fā)酵時(shí)間，提高CO2壓力可以改善由于增加溫度帶來(lái)的負(fù)面的風(fēng)味物質(zhì)的影響[14]。目前研究認(rèn)為，CO2不單消極影響酵母的細(xì)胞數(shù)量和酯的形成速度，同時(shí)也影響高級(jí)醇的生成。相同的麥汁可以通過(guò)壓力和溫度對(duì)酯類的調(diào)控生成不同風(fēng)格的啤酒[15]。合適的溫度和壓力調(diào)控可以影響酵母生長(zhǎng)，CO2的生成，總酯和高級(jí)醇的濃度，生成風(fēng)格適宜的酒體[16]。

密封發(fā)酵容器可以積累CO2同時(shí)積累大量揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些存在于發(fā)酵醪中的揮發(fā)性物質(zhì)同時(shí)也是酵母的毒素，繼而對(duì)生產(chǎn)造成影響。甜米酒的感官多樣性取決于貯藏期間所采取的方式。在12個(gè)月的貯藏期中，除了揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其它風(fēng)味物質(zhì)如氨基酸、乳酸等也需要進(jìn)行深入研究。

圖10 總酯在貯藏期間濃度變化Fig.10 Evolution of total esters concentration during preservation

2.4 殘?zhí)呛鸵掖己康淖兓?/h3>

殘?zhí)呛鸵掖荚谫A藏期間濃度變化見(jiàn)表2、表3。

表2 殘?zhí)窃谫A藏期間濃度變化Table 2 Evolution of residual sugar concentration during preservation

表3 乙醇在貯藏期間濃度變化Table 3 Evolution of ethanol concentration during preservation

海南甜米酒以甜味著稱。在發(fā)酵階段，酒醪中的營(yíng)養(yǎng)成分被吸收，生成酒精、CO2和其它代謝副產(chǎn)物。一旦發(fā)酵容器密閉后，中止了發(fā)酵，殘?zhí)橇粼诰埔褐校傻漠a(chǎn)品即為甜米酒。如果相反，讓發(fā)酵反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，殘?zhí)菚?huì)被耗盡，產(chǎn)品不再有甜味。中國(guó)其它地區(qū)的甜酒有廣西甜米酒，含糖25%[17]和湖北甜米酒，含糖27%[18]。但是，本研究的甜米酒經(jīng)過(guò)7 d發(fā)酵后，含糖量只有8%（表2），含乙醇含量卻高達(dá)7%（體積分?jǐn)?shù)）（表3），分別比廣西甜米酒4.5%（體積分?jǐn)?shù)）和湖北甜米酒2.7%（體積分?jǐn)?shù)）高。中國(guó)甜米酒的乙醇含量通常在4%～10%（體積分?jǐn)?shù)）之間。日本米酒乙醇含量一般為10%～13%（體積分?jǐn)?shù)）[19]。

在25℃和5℃的壓力貯藏期間，甜米酒殘?zhí)欠謩e下降了34%和20%；而敞口貯藏的樣品殘?zhí)莿t分別下降83%和81%（表2）。另一方面，在25℃和5℃的壓力貯藏期間乙醇分別增加10%和7%（體積分?jǐn)?shù)）；25℃敞口貯藏的樣品乙醇含量快速升至10.01%（體積分?jǐn)?shù)），5℃敞口貯藏的樣品乙醇含量則在8個(gè)月后才升至9.6%（體積分?jǐn)?shù)）（表3）。后略有下降，原因可能為揮發(fā)所致。

壓力貯藏使甜米酒保留了大部分的殘?zhí)?，保持了酒體的甜味，而敞口貯藏的酒樣已不具備甜味特征。壓力貯藏同時(shí)使甜米酒的酒度保持在合適的水平，有醇厚感，而敞口貯藏酒樣的酒精度較高，已不具備飲用的適口性。

3 結(jié)論

1）CO2壓力影響并減緩高級(jí)醇和酯類生成，高級(jí)醇在貯藏后期參與酯化反應(yīng)，含量逐漸減少。較高溫度可以促進(jìn)高級(jí)醇和酯的生成，與壓力配合對(duì)高級(jí)醇和酯生成進(jìn)行正負(fù)調(diào)控。低溫加CO2壓力貯藏可以延長(zhǎng)甜米酒貨架期，保持海南甜米酒原始風(fēng)味。

2）甜米酒中的酯類在CO2壓力貯藏后期持續(xù)增加，主要是因?yàn)楦呒?jí)醇的酯化反應(yīng)生成。主要酯成分乳酸乙酯在壓力貯藏期間增加2.45倍，強(qiáng)化了其主要香味特征。

3）甜米酒的敞口貯藏耗盡殘?zhí)?，而低溫CO2壓力貯藏殘?zhí)莾H下降20%，乙醇僅增加7%。12個(gè)月的貯藏期仍保持酒體的甜味特征。

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Effect of Low Pressure Preservation to Higher Alcohols and Esters in Sweet Rice Wine

YANG Dong-sheng，ZHU Qi-nan
（Department of Bioengineering，College of Materials and Chemical Engineering，Hainan University，Haikou 570228，Hainan，China）

Preservation of sweet rice wine treated with low pressure of carbon dioxide is non-thermal processing.Sweet rice wine was preserved well by the low pressure of carbon dioxide at different temperatures.Growth of yeast was stuck by the pressure and the carbon dioxide in the wine.Most residual sugar was retained and kept the wine sweet sensory after 12 months storage.The production of higher alcohols and esters were inhibited by preservation with pressure.A great mount of higher alcohols were produced during the initial phase and a decline followed due to the esterification.Conversely，esters increased during the post preservation.Ethyl lactate was the dominated ester increased by 2.45 times after preservation by pressure，which enhanced the principal aroma of the wine.

low pressure preservation；sweet rice wine；higher alcohol；ester

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.045

2016-12-08

海南省科技廳科研基金資助項(xiàng)目（312079）

楊東升（1966—），男（漢），副研究員，本科，研究方向：生物化工。