鄧 鑫，吳 劍

·短篇論著·

慢性乙型肝炎和肝硬化患者血漿m iR-181a水平變化*

鄧 鑫，吳 劍

目的 探討慢性HBV感染者血漿微小RNA(miRNA)-181a的變化。方法 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)20例乙型肝炎病毒攜帶者（ASC）、20例慢性乙型肝炎（CHB）患者、20乙型肝炎肝硬化（LC）患者和20例健康人血漿miR-181a水平，常規(guī)檢測(cè)血清HBV DNA。結(jié)果 NC 組、ASC組和 LC組血漿 miR-181a水平分別為（1.01±0.03）、（0.97±0.02）、（0.91±0.02），而CHB組患者為（0.74±0.03），顯著低于前三組（P＜0.001）；ASC 組和 LC 組血清 HBV DNA（3.86±2.89）lg copies/m l和（2.47±3.26）lg copies/ml，而CHB組患者為（8.96±1.63）lg copies/m l（P＜0.001）；CHB患者血漿miR-181a水平與HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)（r=0.76，P＜0.001）,ASC組和LC組血漿miR-181a水平與HBV DNA水平無(wú)顯著相關(guān)性。結(jié)論 CHB患者血漿miR-181a水平降低，其意義還需要進(jìn)一步探討。

慢性乙型肝炎；血漿miR-181a；HBV DNA

Chronic hepatitis B；Plasma miR-181a；HBV DNA

microRNA（miRNA）是一類非編碼單鏈小RNA 分子，廣泛存在于動(dòng)物、植物和病毒中，廣泛參與諸如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、腫瘤發(fā)生以及病毒感染發(fā)病機(jī)制等多種生命過(guò)程的調(diào)節(jié)[1-5]。隨著miRNA和生物信息學(xué)領(lǐng)域研究的不斷推進(jìn)，尋找疾病相關(guān)的特異性miRNA已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)[6]。本研究通過(guò)對(duì)乙型肝炎病毒攜帶者（hepatitis B virus carriers，ASC）、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者外周血 miR-181a水平檢測(cè)，旨在為CHB患者提供潛在的基因診斷標(biāo)志物。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年1月～2016年8月西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院門診或住院的ASC 20例，男12例，女8例，平均年齡（35.5±12.1）歲；CHB 患者20例，男 11例，女 9例，平均年齡（38.6±10.7）歲；LC患者20例，男13例，女7例，平均年齡（52.3±14.6）歲。診斷依據(jù)2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)聯(lián)合制定的慢性乙型肝炎防治指南。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）近6個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過(guò)α干擾素、皮質(zhì)激素等藥物治療的患者；（2）合并其他肝炎病毒感染者；（3）合并肝臟腫瘤者。另選在我校附屬第一醫(yī)院行健康體檢者20例作為NC組，男13例，女7例，平均年齡（34.3±12.8）歲。本研究所有入組者均遵循自愿參加原則，簽署知情同意書，并經(jīng)過(guò)西南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血漿miR-181a定量檢測(cè) 抽取外周血1 m l，EDTA抗凝，經(jīng)兩次離心（2000 g，5 min；15000 g，10 min，均在 4℃進(jìn)行，Eppendorf公司），以徹底去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片。使用Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）提取血漿RNA，將獲得的RNA保存于-80℃冰箱（Thermo fisher公司）。凝膠電泳（Bio-Rad公司）檢測(cè)RNA完整性，經(jīng)NanoDrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara公司）說(shuō)明書步驟合成cDNA，在冰上預(yù)冷的RNase free EP管中加入RNA 模板 6 μl，2×miRNA Reaction Buffer Mix 10 μl，0.1%BSA 2 μl，miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix 2 μl，總體積20μl，37℃孵育60 min，行PolyA加尾和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，隨后向上述RT反應(yīng)液中添加RNAase Free H2O至100μl，取2μl進(jìn)行定量檢測(cè)。采用SYBR Green和Stepone Plus實(shí)時(shí)定量PCR 儀（ABI公司）檢測(cè)miR-181a水平，以U6作為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析，miRNA定量反應(yīng)體系按照12.5μl SYBR Premix Ex Taq，1 μl PCR Primer（miR-181a，F(xiàn)orward primer:5’-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3’，reverseprim er： 使 用 試 劑 盒 自 帶 特 定 引 物 ；U6，F(xiàn)orward primer:5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，reverse primer：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’），2 μl 模 板 ，ddH2O 8.5μl配置，總體積25μl，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性 95℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)：95℃ 5 s，60℃ 20 s；采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-181a相對(duì)水平。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 血清HBV DNA檢測(cè) 采用PCR法（廣東達(dá)安基因公司）。

2 結(jié)果

2.1 各組人群血漿miR-181a水平比較 與NC組比，CHB患者血漿miR-181a水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而ASC和LC組與NC組比無(wú)顯著性差異（圖1）。

圖1 各組血漿MiR-181a水平比較

2.2 不同類型肝病患者血清HBV DNA水平比較 CHB患者血清 HBV DNA 水平為（8.96±1.63）lg copies/m l，顯著高于 ASC組的（3.86±2.89）lg copies/m l或 LC組的（2.47±3.26）lg copies/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.3 各組患者血漿miR-181a與HBV DNA載量的相關(guān)性CHB組血漿miR-181a水平與血漿HBV DNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.7629，P＜0.001,圖 2A），而在 ASC 組（r=-0.3248，P＞0.05,圖 2B）和 LC 組（r=-0.2677，P＞0.05，圖 2C））血漿 miR-181a水平與血漿HBV DNA無(wú)明顯相關(guān)性。

圖2 三組患者血漿miR-181a與HBV DNA水平相關(guān)性

3 討論

miRNA是大小約18～25個(gè)堿基的非編碼單鏈小分子RNA，能通過(guò)與靶基因3’端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的堿基不完全配對(duì)，調(diào)控基因的表達(dá)，抑制mRNA翻譯[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs水平異常與HBV感染有關(guān)[9]。在HepG2 2.2.15細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-199a-3p和 miR-210可以抑制HBV復(fù)制[10]。有人發(fā)現(xiàn)肝癌患者血漿 miR-122、miR-192、miR-21、miR-223、miR-26a、miR-27a和 miR-801 均有明顯的變化[9]。

miR-181a是miR-181家族重要一員，在肝臟生理和病理過(guò)程中具有重要作用。Brockhausen et al發(fā)現(xiàn)miR-181a介導(dǎo)的TGF-β表達(dá)上調(diào)參與了肝硬化或肝癌的發(fā)生[10]。HepG2.2.15細(xì)胞miR-181a、miR-181b、miR-200b和miR-146a水平升高[11]，提示miR-181a可能與乙型肝炎病毒感染有密切的聯(lián)系。本研究采用定量PCR檢測(cè)技術(shù)分析比較了ASC、CHB、LC和NC血漿miR-181a水平，結(jié)果顯示 CHB組miR-181水平降低，其意義還需要研究。

宿主miRNA可以抑制病毒復(fù)制，同時(shí)還可以直接調(diào)節(jié)病毒抗原表達(dá)而抑制病毒復(fù)制[12]。近年來(lái)，miR-181a作為腫瘤診斷標(biāo)志物在子宮內(nèi)膜癌[13]、鱗狀上皮細(xì)胞癌[14]和乳腺癌[15]中得到了廣泛深入的研究。CHB患者血漿 miR-181a水平與病情、抗病毒療效或與肝細(xì)胞癌發(fā)生的關(guān)系等，均需要深入研究。

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（收稿：2016-11-28）

（本文編輯：陳宗炳）

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.04.031

四川省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào)：16ZB0208);四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研項(xiàng)目（編號(hào)：16ZD033）；西南醫(yī)科大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：2014QN-042）

646000四川省瀘州市 西南醫(yī)科大學(xué)藥物研究中心（鄧鑫）；附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心（吳劍）

鄧鑫，男，28 歲，碩士研究生。E-mail：780244355@qq.com

吳劍.，E-mail:hankbergcn@163.com

Plasm a m iR-181a levels in patients w ith chronic hepatitis B Deng Xin,Wu Jian.Drug and Functional Food Research Center,Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan Province