王迪

摘 要：隨著植物轉基因技術的不斷進步，它對于分子遺傳學研究和植物改良都具有特別重要的意義。轉基因植株的篩選在轉基因技術中起著關鍵性的作用。將含有35S啟動子的基因載體PMDC150經農桿菌介導，利用農桿菌侵染擬南芥花序的方法轉入擬南芥后得到T1代種子。文章通過組織培養(yǎng)來篩選含有Kan抗性的轉基因植株。

關鍵詞：擬南芥；轉基因植物；篩選

中圖分類號：Q943 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2017）24-0087-02

1 文獻綜述

1.1 轉基因植物的研究進展

植物的遺傳轉化是指利用重組DNA，細胞組織培養(yǎng)等方法，將外源基因導入到植物的組織或細胞中，獲得轉基因植物的技術[1]。從轉基因植株成功之后，轉基因技術飛速發(fā)展，如今，植物在抗病、抗蟲和抗藥等方面都有了轉基因植株。這種技術對改進農作物品質、提高產量等方面都有非常大的幫助。

1.2 基因轉化技術

隨著人們對基因轉化技術不斷地深入研究和探索，現已發(fā)現多種基因轉化的方法，例如農桿菌介導的基因轉化、花粉管通道法等。相比較其他植物基因的轉化方法，農桿菌介導法有著減少成本、容易操作等優(yōu)點，但對宿主細胞有著嚴格的要求。每種方法都有其優(yōu)缺點，所以根據植物的不同種類，我們要選擇合理的轉化方法，達到理想的轉化效果。

1.3 本論文的目的和意義

植物的轉基因技術日新月異迅速發(fā)展，已經成為許多國家重點發(fā)展的新目標新領域，它所產生的巨大的社會和經濟效益促使各個國家對其進行更加深入的研究，由其產生的巨大的生產潛能一定會推動社會的進步，改善人類現有的生產、生活質量以及健康水平。

本文以擬南芥為主要研究對象，通過轉化后的農桿菌侵染擬南芥花序的方法及組織培養(yǎng)的方法進行了轉基因植物的篩選。借由本次實驗研究，可深入了解基因工程等相關領域的理論，可熟練掌握相關技術例如無菌操作技術、植物轉基因技術、植物組織培養(yǎng)技術等等。

2 轉基因植物的篩選與鑒定

2.1 實驗材料

2.1.1 植物材料

擬南芥

2.1.2 載體與菌株

重組表達載體PMDC150-35S（由實驗室提供）、農桿菌菌株GV3101

2.1.3 主要試劑

75%酒精、84消毒液、侵染緩沖液、限制性內切酶、卡那霉素、壯觀霉素（重組表達載體含有的抗性）、利福平

2.1.4 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，15g/L瓊脂（只固體培養(yǎng)基添加）

1/2MS培養(yǎng)基

2.2 實驗方法

2.2.1 擬南芥種植：將種子放在浸過水的濾紙上，放在4℃的冰箱中，不見光培養(yǎng)24小時，然后取出種子種在營養(yǎng)土里，在光照強度8000Lux，溫度25℃的培養(yǎng)箱中經過光照16小時/黑暗8小時培養(yǎng)[2]。

2.2.2 電轉化將表達載體導入農桿菌

電轉化準備：準備好要轉化的表達載體質粒DNA，將農桿菌細胞處于感受態(tài)，并放在冰上解凍（約3-5min）。

（1）將放有感受態(tài)農桿菌細胞的冰桶轉移到超凈工作臺，用移液器將質粒DNA和農桿菌細胞混合，并用移液器上下吹吸使其混勻。放于冰上3min。（2）將混合液轉移到電轉杯。（3）用電轉電擊3-5s。（4）取出電轉杯，加入800l的LB液體培養(yǎng)基，混勻并轉移至1.5ml的EP管中。（5）放于28℃下，振蕩培養(yǎng)3h。（6）在此期間，配置添加有100g/ml壯觀霉素抗性的LB固體平板，約15min培養(yǎng)基凝固后蓋好蓋，倒置放置。（7）將（5）的懸液離心。取出上上清液，放入800l LB培養(yǎng)基再培養(yǎng)。50min后涂板。（8）取20l LB培養(yǎng)基和30l轉化農桿菌分別先后加入到平板。（9）放于28℃下培養(yǎng)兩天。

2.2.3 質粒提取及鑒定

將以上轉化出的菌斑挑取培養(yǎng)，在28℃下培養(yǎng)24h。

質粒用質粒提取試劑盒提取，并經酶切鑒定[3]

酶切體系（20L）：

DdH2O 14.9L

10×buffer 2L

質粒 3L

內切酶 0.1L

（37℃酶切0.5個小時）

2.2.4 農桿菌侵染擬南芥花序

侵染緩沖液的配置：200ml滅菌水、5g蔗糖、40L有機硅：（1）將經擴增的陽性菌株離心進行收集，棄去上清液。（2）將收集到的菌株沉淀懸浮于緩沖液中，并使其混合均勻。（3）用移液槍將上述混勻的懸浮液加入到擬南芥的花苞上，避光處理20分鐘，等到菌液快干時再取些懸浮液滴到花苞上，最后將侵染后的擬南芥用保鮮膜包好，放在避光處過夜，次日揭掉保鮮膜，將侵染后的花苞暴露在日光下使其正常生長[2]。（4）培養(yǎng)一段時間后，獲得成熟的擬南芥種子。

2.2.5 組織培養(yǎng)獲得轉基因植株

（1）種子的消毒處理：將擬南芥種子（T1）經75%酒精進行表面消毒2分鐘，再用滅菌水清洗2次，然后加入84消毒液、滅菌水、Trition放在搖床上搖30分鐘，最后用滅菌水清洗2-3次。（2）將滅菌后的種子用一定的瓊脂懸浮均勻，用移液槍將懸浮好的擬南芥種子接種于添加50mg/L的1/2MS固體培養(yǎng)基上，封口膜封好，并做好標記[4]。于4℃冰箱中黑暗處理24h，后置于培養(yǎng)箱，條件為光照16小時/黑暗8小時，光照強度8000Lux，溫度23℃[5]。（3）觀察各種子的生長情況。黃化的子葉逐漸枯萎，綠色的子葉繼續(xù)生長，即為轉化成功。（4）當綠苗長到一定程度后，再移到營養(yǎng)土中培養(yǎng)。

3 結果與分析endprint

3.1 農桿菌的轉化鑒定

對轉化的農桿菌進行鑒定，結果如圖1所示。

BamHI單酶切質粒，所得正確條帶大小為：11000bp，10500bp，1400bp，521bp

第一條：重組表達載體PMDC150-35S，為正確條帶。

第二條：PMDC150酶切對照

第三條：Marker

由轉化鑒定圖可以看出，酶切片段的大小和重組表達載體的大小幾乎一致。結果表明農桿菌轉化成功。

3.2 轉基因擬南芥植株的篩選

對轉基因植株進行篩選，在其他條件都相同的情況下，在分別含有37.5mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)篩選，結果如下表1：

表中數據表明，篩選的最適濃度為50mg/L。

因此選用含有50mg/L卡那霉素的MS培養(yǎng)基來培養(yǎng)植株，成活率最高，且非轉基因幼苗會變黃而逐漸死亡，綠色的轉基因植株得以存活。

4 結論

將含有35S啟動子的基因載體PMDC150轉入農桿菌后，再用轉化后的農桿菌侵染擬南芥花序，培養(yǎng)后得到T1代種子，再用特定培養(yǎng)基篩選出綠色的轉基因擬南芥植株。

由實驗過程可以看出，農桿菌介導法具有較低成本、容易操作而轉化成功率高等優(yōu)點，但卻受宿主細胞基因型的限制[6]。所以，根據植物的不同種類，我們要選擇合理的轉化方法，以達到理想的轉化效果。

參考文獻：

[1]翟曉巧.泡桐體外植株再生及反義LFY基因遺傳轉化研究[D].東北林業(yè)大學，2004.

[2]渠曉霞.擬南芥糖基轉移酶基因的克隆、載體構建及轉基因植物的研制[D].山東大學，2012.

[3]吳健誼，蔣太峰，許麗艷，等.哺乳動物細胞CDK3系列表達載體的構建與表達[J].汕頭大學醫(yī)學院學報，2010，23（3）：134-137.

[4]王明莉.堿蓬甜菜堿醛脫氫酶基因（ScBADH）的表達分析以及在擬南芥中的功能鑒定[D].吉林農業(yè)大學，2012.

[5]馬新梅.擬南芥細胞分裂素O-糖基轉移酶基因功能分析[D].山東大學，2011.

[6]冉翠香.植物基因工程中目的基因的轉化方法[J].呂梁學院學報，2007，23（1）：3-6.endprint