高家坤 李靜心 何宏魁,,3 李安軍,,3 宰紅玉

窖泥理化指標(biāo)與微生物含量相關(guān)性研究

高家坤1李靜心2何宏魁1,2,3李安軍1,2,3宰紅玉1

窖泥是生產(chǎn)濃香型白酒的基礎(chǔ)，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。本研究利用qPCR技術(shù)對濃香型白酒窖泥微生物含量進行測定，同時結(jié)合常規(guī)理化指標(biāo)進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，pH與窖泥細菌含量呈正相關(guān)（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與窖泥細菌含量呈負相關(guān)（P＜0.05），說明窖泥pH和腐殖質(zhì)含量可作為衡量微生物含量的理化指標(biāo)。

濃香型白酒的生產(chǎn)以泥窖窖池為基礎(chǔ)，發(fā)酵過程是棲息在窖池糟醅、窖泥中的龐大微生物區(qū)系在糟醅固、液、氣三相界面的復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過程。在濃香型白酒窖池發(fā)酵過程中，大曲微生物、窖泥微生物與糟醅微生物區(qū)系的形成和演變左右著發(fā)酵過程中窖池內(nèi)微生物物質(zhì)能量代謝的走向，與濃香型白酒獨特風(fēng)格的形成息息相關(guān)。但長期以來，由于受到科研力量分散以及技術(shù)手段落后的限制，廣大科研工作者對發(fā)酵過程中窖泥微生物區(qū)系的研究和認識還非常有限。

實時熒光定量PCR是一種核酸定量技術(shù)，此技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中引入了熒光基團，通過檢測PCR過程中熒光信號的積累實時監(jiān)控整個過程，最終通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量。熒光定量PCR技術(shù)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物的研究中，但在窖泥微生物中的應(yīng)用較少。張勁等使用qPCR技術(shù)對不同窖齡窖泥中主要產(chǎn)甲烷菌群進行研究，探討了菌群含量與窖齡的關(guān)系；胡貝利用qPCR技術(shù)對古菌、細菌及相關(guān)菌群在不同酒廠不同窖齡窖泥中的拷貝數(shù)進行了分析，這些qPCR對窖泥的研究結(jié)果為本研究提供了依據(jù)。

窖泥是生產(chǎn)濃香型白酒的基礎(chǔ)，窖泥質(zhì)量的優(yōu)劣對濃香型白酒的質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。本研究對濃香型白酒窖泥的各項理化指標(biāo)進行研究，同時結(jié)合qPCR技術(shù)對窖泥微生物含量進行分析，通過SPSS對窖池的理化指標(biāo)與微生物含量進行相關(guān)分析，試圖尋找二者之間的相關(guān)性。

材料與方法

材料

樣品采集。隨機抽取12個窖池，每個窖池取池底窖泥250g。窖泥取樣方式為五點取樣法。取1g窖泥提取DNA，200g窖泥測定理化指標(biāo)，其余窖泥樣品-80℃凍存。

試驗試劑。50×TAE溶液，上海生工Agarose M，TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒，，TAKARA SYBR Fast qPCR Mix。

試驗儀器。UVP高級化學(xué)發(fā)光成像工作站，賽多利斯G-26C高速冷凍離心機，北京六一電泳儀，Thermo qPCR儀及耗材，Thermo離心機，Nano核酸微量測定儀。

試驗方法

樣品總DNA的提取。樣品基因組的提取按照TIAGEN 土壤DNA提取試劑盒操作說明提取，提取的DNA置于-20℃保存。

樣品理化指標(biāo)的測定。取200g新鮮窖泥樣，測定其水分、pH值、銨態(tài)氮、有效磷、腐殖質(zhì)、脫氫酶活性等常規(guī)理化指標(biāo)。

水分（含揮發(fā)分）測定：稱取20g新鮮窖泥樣品，置于135℃烘箱中烘干2h，取出后置于干燥器內(nèi)自然冷卻，稱量冷卻后樣品的質(zhì)量，計算窖泥水分含量。

pH測定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入50mL H2O，混勻30min后用pH計測定窖泥pH值。

銨態(tài)氮測定：稱取25g絕干重量的新鮮窖泥，加入10% NaCl溶液定容至250mL，30min后吸取5mL上清液置于擴散皿，內(nèi)圈加入2mL硼酸溶液，外圈加入2mL 40% NaOH溶液，混勻并在室溫下靜置24h， 硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定并計算窖泥中銨態(tài)氮的含量。

脫氫酶活性：參考文獻所述方法。

有效磷的測定：參考文獻所述方法。

腐殖質(zhì)測定：稱取2g風(fēng)干窖泥，加入70mL堿性焦磷酸鈉溶液，沸水浴提取30min后定容至100mL。吸取5mL上清液加入等體積0.8M 重鉻酸鉀和15mL濃硫酸，沸水浴30min后加入20mL蒸餾水和鄰菲羅啉指示劑，硫酸亞鐵滴定并計算窖泥中腐殖質(zhì)的含量。

微生物含量的測定。本試驗采用引物GJ-F 5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’和GJ-R 5’-ATTACCGCG GCTGCTGG-3’ 擴增細菌16S rDNA基因，擴增片段約177bp。以每個窖池的DNA樣品為模板進行qPCR，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到每條窖池細菌的拷貝數(shù)。qPCR反應(yīng)體系（10uL）：2×qPCR mix 5μL，GJ-F 0.5μL，GJ-R 0.5μL，dd H2O 3μL，DNA模板1μL。qPCR反應(yīng)循環(huán)條件：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，55℃退火30s，72℃延伸10s，變性、退火、延伸進行40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后制作熔解曲線。

數(shù)據(jù)處理。使用SPSS軟件對窖泥理化指標(biāo)和窖泥細菌含量進行相關(guān)性分析，擬找出與窖泥細菌含量相關(guān)的理化指標(biāo)。

結(jié)果與分析

窖泥理化指標(biāo)的測定

對12個窖泥樣品的常規(guī)理化指標(biāo)進行測定，分別測定了水分、pH值、銨態(tài)氮、腐殖質(zhì)、脫氫酶活性等常規(guī)理化指標(biāo)（表1）。結(jié)果表明，水分、有效磷、腐殖質(zhì)等常規(guī)理化指標(biāo)變化不大，pH、銨態(tài)氮和脫氫酶活性在各個窖池間有一定差距，這些指標(biāo)的差異可能是窖池間差異的主要原因。

表1 窖泥常規(guī)理化指標(biāo)的測定結(jié)果

窖泥細菌含量

使用qPCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對12個樣品窖泥中的細菌含量進行分析檢測，分析細菌在不同窖池中的含量情況，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各窖池細菌含量均超過109，但不同窖池間的細菌含量有所差別，細菌含量最高的5號窖池與含量最低的12號窖池之間相差接近100倍，說明不同的窖池之間存在細菌含量的差異，這種差異可能是造成窖池間差異的直接原因。

表2 窖泥細菌的qPCR測定結(jié)果

理化指標(biāo)與細菌含量的相關(guān)性研究

使用SPSS 22.0軟件對窖泥理化指標(biāo)與細菌含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，pH和細菌含量相關(guān)性較高（圖1），達到了0.771（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與細菌含量相關(guān)性稍低，為-0.613（P＜0.05），其他理化指標(biāo)與細菌含量不具有相關(guān)性。經(jīng)分析，這是由于窖池中微生物的最適pH值為弱酸性，當(dāng)pH值偏低時總酸含量也隨之增高，影響了微生物的生長，從而使得微生物含量偏低。腐殖質(zhì)是窖泥微生物的重要養(yǎng)分，微生物含量越豐富，腐殖質(zhì)的利用率越高，微生物含量越低，窖泥中腐殖質(zhì)的殘留就越高，因此腐殖質(zhì)與細菌含量呈負相關(guān)。

表3 窖池環(huán)境因子與細菌含量的相關(guān)性

圖1 pH與細菌含量的相關(guān)性

本試驗利用qPCR技術(shù)對濃香型白酒窖泥微生物含量進行了定量，同時結(jié)合窖泥理化指標(biāo)進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)pH與窖泥細菌含量呈正相關(guān)（P＜0.01），腐殖質(zhì)含量與窖泥細菌含量呈負相關(guān)（P＜0.05）。本試驗的結(jié)果表明窖泥的pH和腐殖質(zhì)含量可以作為直接衡量窖泥微生物含量的理化指標(biāo)，方便了在生產(chǎn)過程中對窖泥的質(zhì)量進行評價。

(作者單位：1. 安徽古井貢酒股份有限公司；2. 安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；3. 安徽瑞思威爾科技有限公司)