劉建華,裴福云,宋鳳鳴,雷江麗

(1.廣東省深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司,廣東 深圳 518040;2.廣東省深圳市中科院仙湖植物園/廣東省深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518004)

中華結(jié)縷草對(duì)潮霉素的敏感性研究

劉建華1,裴福云1,宋鳳鳴1,雷江麗2*

(1.廣東省深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司,廣東 深圳 518040;2.廣東省深圳市中科院仙湖植物園/廣東省深圳市南亞熱帶植物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 深圳 518004)

研究了中華結(jié)縷草3種不同外植體對(duì)不同濃度潮霉素溶液的敏感性。結(jié)果表明:中華結(jié)縷草不同外植體對(duì)潮霉素的敏感性存在差異，其中種子經(jīng)50 mg/L潮霉素處理3周后,發(fā)芽率極顯著減少,只有6%;愈傷組織經(jīng)20 mg/L潮霉素處理3周后褐化率達(dá)到62%；離體葉片經(jīng)50 mg/L潮霉素處理7 d后,黃化面積率超過(guò)85%。故中華結(jié)縷草的種子、愈傷組織、離體葉片在遺傳轉(zhuǎn)化中適宜的潮霉素篩選濃度分別為50、20、50 mg/L。

中華結(jié)縷草;潮霉素;敏感性;外植體

中華結(jié)縷草(ZoysiasinicaHance)作為我國(guó)的鄉(xiāng)土品種,在枝條密度、抗寒性、耐熱性、抗旱性、葉子質(zhì)地等方面均位于同類(lèi)暖季型草種的前列[1],而且分布區(qū)域廣泛,管理成本低,其中需水量更是只有草地早熟禾的50%左右,因而無(wú)論是在北方還是在南方均有大面積種植[2]。隨著對(duì)中華結(jié)縷草研究的深入和應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注中華結(jié)縷草的轉(zhuǎn)基因育種,在遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道中遺傳介導(dǎo)的載體包含種子[3-4]、愈傷組織[5-6]等,且目前主要集中在耐寒[6-7]的研究。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化中,選擇合適的篩選標(biāo)記基因往往能達(dá)到事半功倍的效果。用抗生素進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物陽(yáng)性材料篩選,已是一種較為快速有效的措施,在前期篩選和后代材料鑒定上使用廣泛,目前已在小麥[8]、大豆[9]、楊樹(shù)[10]等上成功應(yīng)用。潮霉素B (Hygromycin B)是一種氨基糖苷類(lèi)抗生素,可破壞各種細(xì)胞中核糖體的功能,使敏感組織褐化死亡。潮霉素B因其具有選擇率高、假陽(yáng)性率低、重復(fù)性好、對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞毒害作用小等優(yōu)點(diǎn)而被重視[11-14],在單子葉植物上得到了廣泛應(yīng)用[15-17]。目前國(guó)家對(duì)轉(zhuǎn)基因植物安全性的重視也促使育種工作者選用更安全的篩選標(biāo)記基因。HPT編碼蛋白對(duì)人體潛在致敏性很低[18],是一種較安全的標(biāo)記基因。本文采用愈傷組織、種子、離體葉片這3種不同的外植體，研究了它們對(duì)潮霉素的敏感性,以期為中華結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因各階段的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

中華結(jié)縷草草籽:采集于山西省沂蒙山區(qū)。中華結(jié)縷草植株:苗齡在3個(gè)月左右。潮霉素B：生產(chǎn)廠家為羅氏制藥,儲(chǔ)存液濃度為50 mg/mL。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

人工氣候箱的培養(yǎng)條件為:溫度(25±2)℃、光照強(qiáng)度2000～2500 lx、光照時(shí)數(shù)16 h/d。愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂,并用NaOH調(diào)節(jié)pH至5.8。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 潮霉素對(duì)種子的處理方法 挑選飽滿成熟的種子,各處理均先進(jìn)行催芽處理:用10%的NaOH處理20 min,再用清水沖洗5遍。然后進(jìn)行消毒處理:用75%的酒精消毒1 min,然后用0.1%升汞消毒10 min,最后用無(wú)菌水清洗5遍左右。將經(jīng)消毒的種子置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，并加入相應(yīng)濃度的潮霉素溶液,最后放入人工氣候箱中培養(yǎng)。在試驗(yàn)處理中每3 d更換1次相應(yīng)濃度的潮霉素溶液。本試驗(yàn)共設(shè)計(jì)了5個(gè)潮霉素濃度,分別為0、10、30、50、80 mg/L,每個(gè)處理100粒種子,均10次重復(fù),其中0 mg/L為對(duì)照組。參照國(guó)標(biāo)牧草種子檢驗(yàn)規(guī)范的判定標(biāo)準(zhǔn)[19],在第3周記錄發(fā)芽數(shù)并按下列公式計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。

發(fā)芽勢(shì)(%)=第2周的發(fā)芽數(shù)/種子數(shù)×100;

發(fā)芽率(%)=第3周的發(fā)芽數(shù)/種子數(shù)×100。

1.3.2 潮霉素對(duì)愈傷組織的處理方法 對(duì)供試種子進(jìn)行消毒并將其接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,每3周轉(zhuǎn)接1次；到第3次時(shí),將愈傷組織放入含有潮霉素溶液的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,其中潮霉素濃度分別為0、20、50、80、100 mg/L。每個(gè)處理5個(gè)樣品,均10次重復(fù),其中0 mg/L為對(duì)照組。每周進(jìn)行觀察記錄,3周后統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)并計(jì)算分化率、存活率和褐化率，其中褐化率的計(jì)算公式如下：

褐化率(%)=褐化數(shù)/樣品數(shù)×100。

1.3.3 潮霉素對(duì)離體葉片的處理方法 經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)可知,離體條件下葉片在0.5 mg/L的6-BA溶液中能保證1周不明顯變黃,故處理時(shí)均加入6-BA以增加其綠葉時(shí)間。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí),共設(shè)置5個(gè)潮霉素濃度處理,分別為0、50、100、150、200 mg/L,溶劑為含6-BA的蒸餾水,其中0 mg/L為對(duì)照組。取正常生長(zhǎng)的成熟葉片(在新葉后的第1～2片真葉),用剪刀剪去葉片兩端并留取寬度在1.0～1.5 cm的葉片片段,最后把葉片段隨機(jī)放置到各個(gè)處理溶液中,放入人工氣候箱培養(yǎng)。每2 d觀察記錄1次,并在第6天統(tǒng)計(jì)每張葉片段的黃化面積率。

黃化面積率(%)=黃化面積/葉面積×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013進(jìn)行圖表制作,采用SPSS 23.0軟件對(duì)發(fā)芽率、存活率、黃化率等進(jìn)行單因素方差分析,選用Duncan法進(jìn)行多重比較,顯著性水平設(shè)置為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 潮霉素對(duì)中華結(jié)縷草種子發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率的影響

發(fā)芽勢(shì)是測(cè)試種子發(fā)芽速度和整齊度的一個(gè)指標(biāo)。從圖1可以看出,經(jīng)過(guò)潮霉素處理后，中華結(jié)縷草種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率都不同程度的降低；10 mg/L潮霉素處理的影響不顯著;當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到30 mg/L時(shí)發(fā)芽率只有22%，與對(duì)照有極顯著差異;當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到50 mg/L時(shí),發(fā)芽率為6%,發(fā)芽勢(shì)為4%,說(shuō)明此時(shí)種子發(fā)芽已受到嚴(yán)重抑制;當(dāng)潮霉素濃度繼續(xù)升高至80 mg/L時(shí),發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均趨近于0%。故為了防止藥劑濃度過(guò)高導(dǎo)致的生長(zhǎng)毒害作用且為了滿足較高的篩選效率,選用50 mg/L的潮霉素濃度作為種子的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

圖中不同大寫(xiě)英文字母表示處理間差異達(dá)P<0.01的顯著水平。下同。

2.2 潮霉素對(duì)中華結(jié)縷草愈傷組織的影響

合適的潮霉素篩選濃度是保證基于組培途徑的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功的關(guān)鍵因子之一,直接影響后期的遺傳轉(zhuǎn)化效果和工作量。由圖2可知：隨著潮霉素濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng),外植體的褐化率總體上呈上升趨勢(shì)。具體來(lái)說(shuō)，在第2周時(shí),除20 mg/L潮霉素處理外其他濃度處理均達(dá)到半致死濃度,而對(duì)照組變化不顯著。在處理3周后,20 mg/L潮霉素處理的愈傷組織達(dá)到半致死濃度；而50 mg/L處理下褐化率達(dá)到90%；隨著濃度繼續(xù)升高,褐化率雖小幅度下降但均保持在80%左右。實(shí)際觀察(圖3)發(fā)現(xiàn)：在50 mg/L潮霉素處理下,愈傷組織長(zhǎng)勢(shì)急劇下降,幾乎停滯生長(zhǎng)且愈傷組織質(zhì)地變軟,顆粒不明顯,后續(xù)也不能繼續(xù)增殖和分化,毒害作用較大;在潮霉素處理下,前期愈傷組織的褐化識(shí)別較難,需經(jīng)過(guò)3周左右才能結(jié)合顏色和愈傷組織大小進(jìn)行綜合區(qū)分。故基于試劑成本與篩選效率的考慮,在實(shí)際應(yīng)用時(shí),可選取20 mg/L為愈傷組織培養(yǎng)的潮霉素篩選濃度。

圖2 不同潮霉素濃度對(duì)愈傷組織的影響

2.3 潮霉素對(duì)中華結(jié)縷草離體葉片的影響

經(jīng)不同濃度的潮霉素處理7 d后,對(duì)各處理離體葉片的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出：各處理與對(duì)照間的黃化面積率均存在極顯著差異；當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到50 mg/L時(shí),黃化面積率已經(jīng)超過(guò)85%,藥害癥狀明顯(參見(jiàn)圖4);當(dāng)潮霉素濃度超過(guò)50 mg/L后,葉片黃化面積較50 mg/L處理略有減少。綜上分析,認(rèn)為50 mg/L的潮霉素濃度較適合作為轉(zhuǎn)基因后代耐藥性篩選的條件,它可以在節(jié)省成本的同時(shí)得出一個(gè)辨識(shí)度高的結(jié)果,方便得出結(jié)論。

左圖：潮霉素濃度0 mg/L;右圖：潮霉素濃度50 mg/L。

圖4 不同潮霉素濃度處理下葉片的黃化面積率

從左到右依次為潮霉素濃度0、50、100、150、200 mg/L。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，中華結(jié)縷草對(duì)潮霉素有一定抗性,且不同外植體的耐性不同,其中種子、愈傷組織、離體葉片的篩選濃度分別為50、20、50 mg/L。前人的研究表明,種子的篩選濃度稍高于葉片、莖段、愈傷組織等外植體的[20]。本文中中華結(jié)縷草葉片和種子的篩選濃度相近,可能是由于葉片的疏水作用且切口較小,故減輕了藥劑的毒害;葉片處理時(shí)間較短,故對(duì)濃度要求較高。種子作為轉(zhuǎn)基因后代材料,往往需其萌發(fā)成苗后才能進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)抗生素對(duì)種子進(jìn)行檢測(cè),有效地縮短了檢測(cè)時(shí)間間隔,也顯著降低了工作量[15]。離體葉片檢測(cè)由于取材方便、效果直觀、檢測(cè)成本小、可信度較高[21],可作為轉(zhuǎn)基因后代檢測(cè)的一種輔助方法。愈傷組織檢測(cè)由于其培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、對(duì)外界條件敏感，故還需根據(jù)實(shí)際情況對(duì)潮霉素的篩選濃度和篩選時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,防止其細(xì)胞大量死亡而無(wú)法正常增殖、分化。

[1] 董厚德,宮莉君.中國(guó)結(jié)縷草生態(tài)學(xué)及其資源開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[M].第一版.北京:中國(guó)林業(yè)出版社,2001.

[2] 宣繼萍.結(jié)縷草屬(ZoysiaWilld.)植物種質(zhì)資源多樣性研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[3] 雷江麗,王丹,吳燕民,等.農(nóng)桿菌浸種法介導(dǎo)中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009(5):865-871.

[4] 王丹.用農(nóng)桿菌浸種法建立白三葉和中華結(jié)縷草遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[5] 張振霞.幾種牧草和草坪草植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其轉(zhuǎn)基因研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2002.

[6] 韋善君.結(jié)縷草抗寒性及轉(zhuǎn)錄因子CBF1的轉(zhuǎn)化研究[D].武漢：華中科技大學(xué),2006.

[7] 章家長(zhǎng).P_(SAG12)-ipt基因?qū)胙泳徶腥A結(jié)樓草衰老研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[8] 奚亞軍,范學(xué)科,侯文勝,等.小麥遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素適宜篩選濃度的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2003(1):39-42.

[9] 鄒莉,文藝,張勻華,等.大豆子葉節(jié)對(duì)潮霉素敏感性研究[J].大豆科學(xué),2008(2):267-269.

[10] 王丹,鄒莉,王義,等.楊樹(shù)對(duì)潮霉素的敏感性研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010(1):47-50.

[11] 于波,劉金梅,劉曉榮,等.兩種抗生素對(duì)阿拉巴馬花燭植株再生的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(7):53-56.

[12] 劉京,劉建巍,韓天富,等.潮霉素作為篩選劑對(duì)大豆發(fā)狀根誘導(dǎo)的影響[J].大豆科學(xué),2013(4):449-454.

[13] 喬寧寧,鄒愛(ài)蘭,陳崇順.番茄寶大906高頻再生系統(tǒng)的建立及其潮霉素選擇壓的測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41(2):39-42.

[14] 汪玲.725楊再生體系的建立及轉(zhuǎn)Bt基因的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[15] 楊橋,藺自敏,侯詳文,等.小麥遺傳轉(zhuǎn)化中潮霉素篩選體系的建立及應(yīng)用[J].麥類(lèi)作物學(xué)報(bào),2014(3):304-310.

[16] 閆美玲.日本結(jié)縷草再生體系優(yōu)化和根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)PSAG12-IPT基因的轉(zhuǎn)化研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[17] 張磊.幾種草坪草轉(zhuǎn)基因及體細(xì)胞無(wú)性系變異的研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[18] 許文濤,蘆云,羅云波,等.潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的致敏性評(píng)價(jià)研究[J].食品科學(xué),2009,30(1):261-264.

[19] 農(nóng)業(yè)部牧草與草坪種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心.牧草種子檢驗(yàn)規(guī)程：發(fā)芽試驗(yàn)[M].北京：2001.

[20] 于永明,王軍輝,麻文俊,等.不同濃度卡那霉素、潮霉素對(duì)楸樹(shù)試管苗生長(zhǎng)的影響[J].生物技術(shù)通訊,2014(6):832-836.

[21] 殷奎德,張興梅,鄭桂萍,等.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻潮霉素抗性標(biāo)記的方法[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào),2010(1):45-48.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Study on Sensitivity ofZoysiasinensisto Hygromycin

LIU Jian-hua1, PEI Fu-yun1, SONG Feng-ming1, LEI Jiang-li2*

(1. Shenzhen Techand Ecology & Environment Company Limited in Guangdong Province, Shenzhen 518040, China; 2. Fairylake Botanical Garden, Shenzhen & Chinese Academy of Sciences / Shenzhen Key Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity, Shenzhen 518004, China)

The sensitivities of 3 types of explants ofZoysiasinensisto different concentrations of hygromycin solution were studied. The results showed that the sensitivities of different explants ofZ.sinensisto hygromycin were different. Three weeks after the seeds were treated with 50 mg/L hygromycin, their germination rate was very significantly reduced to only 6%. Three weeks after the calluses were treated with 20 mg/L hygromycin, their browning rate reached 62%. Seven days after the isolated leaves were treated with 50 mg/L hygromycin, their yellowing area rate exceeded 85%. Therefore, the optimum concentration of hygromycin for the screening of seed, callus and isolated leaf ofZ.sinensisin genetic transformation was 50, 20 and 50 mg/L, respectively.

Zoysiasinensis; Hygromycin; Sensitivity; Explant

2017-05-16

廣東省生態(tài)修復(fù)技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(粵發(fā)改高技術(shù)[2015]162號(hào));立體綠化輕型基質(zhì)研究工程實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(深發(fā)改 [2016]1023號(hào))。

劉建華(1989─),男,重慶人,工程師,從事抗逆植物選育研究。*通訊作者:雷江麗。

S688.4

A

1001-8581(2017)09-0041-04