楊 彭，黃 健，韓 敏，莫穎敏，黃振興，劉 波

(1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科干部病區(qū)老年神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021)

·經(jīng)驗交流·

石杉堿甲對帕金森病模型大鼠乙酰膽堿酯酶及ATP酶活性的影響

楊 彭1，黃 健2△，韓 敏1，莫穎敏1，黃振興3，劉 波1

(1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科干部病區(qū)老年神經(jīng)內(nèi)科，南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，南寧 530021；3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021)

目的 探討石杉堿甲對帕金森模型病大鼠乙酰膽堿酯酶(AchE)及ATP酶活性的影響。方法 選擇45只雄性SD大鼠為研究對象，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、石杉堿甲組各15只。模型組、石杉堿甲組采用6-羥基多巴胺腦立體定向單側(cè)紋狀體雙靶點微量注射法制備帕金森大鼠模型，石杉堿甲組給予0.1 mg·kg-1·d-1石杉堿甲灌胃，空白對照組和模型組灌入等容量蒸餾水。比較3組大鼠空間記憶能力、紋狀體多巴胺(DA)水平及AchE水平、腦內(nèi)黑質(zhì)Ca2+-ATPase、Na+- K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性。結(jié)果 模型組信息游泳時間、選擇游泳時間明顯長于空白對照組(t=6.907、6.966,P<0.05)，石杉堿甲組大鼠信息游泳時間、選擇游泳時間明顯短于模型組(t=4.572、3.444,P<0.05)，且石杉堿甲組大鼠且明顯短于模型組(t=2.421、3.912,P<0.05)；模型組大鼠腦組織多巴胺明顯低于空白對照組，AchE明顯高于空白對照組(t=12.517,6.834,P<0.05)，石杉堿甲組大鼠腦組織多巴胺明顯高于模型組，AchE明顯低于模型組(t=6.388、4.719,P<0.05)，且石杉堿組大鼠腦組織多巴胺明顯低于空白對照組，AchE明顯高于空白對照組(t=6.055、2.024,P<0.05)；模型組大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均明顯低于空白對照組(t=20.326、15.2225、12.517,P<0.05)，石杉堿甲組大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均高于模型組(t=16.771、9.516、7.480,P<0.05)，且大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均低于模型組(t=3.901、5.844、5.848,P<0.05)。結(jié)論 石杉堿甲有助于提高帕金森大鼠空間記憶能力，可能與抑制AchE表達(dá)、提高腦組織中多巴胺及ATP酶的活性有關(guān)。

帕金森?。灰阴Ｄ憠A酯酶；石杉堿甲；ATP酶；空間記憶能力

帕金森病是一種錐體外系疾病，臨床主要特征為靜止性震顫、肌強(qiáng)直、肌張力增高及運動困難(運動遲緩、姿勢步態(tài)不穩(wěn))[1]。帕金森病常見于中老年人，發(fā)病率約占65歲以上老齡人群的1.00%～2.00%。研究表明,帕金森病患者除了運動功能受損外,10.00%～30.00%患者存在明顯的記憶、智能、情緒障礙及癡呆等高級神經(jīng)活動受損癥狀[2],嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。帕金森病因尚不明確，腦紋狀體多巴胺(dopamine,DA)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AGhE)表達(dá)失衡可能是導(dǎo)致帕金森病的主要原因[3]。石杉堿甲(huperzine A)能抑制AchE活性，通過抗氧化應(yīng)激和抗細(xì)胞凋亡途徑來保護(hù)神經(jīng)元繼續(xù)損傷[4]。也有學(xué)者研究表明，石杉堿甲能顯著改善PD患者大腦認(rèn)知功能[5]，但具體作用機(jī)制尚少見文獻(xiàn)報道。本研究擬通過觀察石杉堿甲對帕金森病大鼠AchE及ATP酶活性的影響，初步探討石杉堿甲治療帕金森的可能作用機(jī)制，為下一步臨床治療提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康清潔級成年SD大鼠45只，雄性，體質(zhì)量200～300 g，平均(238.36±22.45)g，4～8周齡，平均(6.75±0.72)周齡。購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心(許可證號151210)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對照組、模型組、石杉堿甲組各15只，本次研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品、試劑與主要儀器 石杉堿甲片：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：H10960133，規(guī)格50μg×40 s；水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H37022673；6-羥基多巴胺(6-OH多巴胺)、AchE活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase 試劑盒購自天津市科密歐化學(xué)試劑中心)；HPLC高效液相色譜系統(tǒng)(Varian 公司)、電子分析天平：美國METTLERTOLEDO公司XS205型；分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司722型；高速冷凍離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠LD5.2A型；腦立體定位儀：美國Stoelting公司51700型；Morris水迷宮：上海吉量電子公司。

1.3 模型制作 45只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除空白組，其余組大鼠采用單側(cè)絞狀體雙靶點注射法建立帕金森模型[6]。用6-OH多巴胺行腦內(nèi)立體定向注射,10%水合氯醛(0.35 g/kg)麻醉,俯臥位固定于腦立體定位儀上，根據(jù)paxson《The Rat Brain》圖譜， 將6-OH多巴胺分2點分別注入右中腦腹側(cè)被蓋部和黑質(zhì)致密部,每點注射每5微升10 μg，留針10～15 min，術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素20 MU/d預(yù)防感染,連用7 d。2周后腹腔注射鹽酸阿樸嗎啡(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)出模，以平均旋轉(zhuǎn)大于7 r/min 為建模成功。

1.4 分組干預(yù) 造模成功后7 d，石杉堿甲組按0.1 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，空白對照組和模型組灌入等容量蒸餾水，1次/天，連續(xù)4周[7]。治療結(jié)束后，采用Markowska設(shè)計延緩位置非匹配作業(yè)進(jìn)行訓(xùn)練[8]。將一T型隔板放入水迷宮內(nèi)，分割成開始部A與開放部B、C，在開放部B放一平臺。參照高懷云等[9]文獻(xiàn)資料計算信息游泳時間與選擇游泳時間。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 空間記憶能力 水迷宮訓(xùn)練5 d，統(tǒng)計分析3組大鼠信息游泳時間、選擇游泳時間。

1.5.2 腦組織中多巴胺和AchE水平 水迷宮訓(xùn)練5 d后，斷頭處理大鼠取腦組織，在冰臺上迅速分離紋狀體,于液氮中保存。經(jīng)勻漿、3 000 r/min離心10 min后，用高效液相色譜法(HPLC)測定紋狀體多巴胺(dopamine,DA)水平；取下丘腦中部腦組織勻漿、4℃離心后取上清液測定AchE(Acetyl cholinesterase,AchE)活性。

1.5.3 ATP酶活性檢測 水迷宮訓(xùn)練5 d后，選用升主動脈灌注固定腦組織，參照白妍等[10]文獻(xiàn)資料，采用分光光度法測定各組大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性。

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠空間記憶能力比較 模型組信息游泳時間、選擇游泳時間明顯長于空白對照組(P<0.05)；石杉堿甲組大鼠信息游泳時間、選擇游泳時間明顯長于空白對照組，且明顯短于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 三組大鼠信息游泳時間與選擇游泳時間比較±s)

a：t=6.907、6.966,P<0.05，與空白對照組比較；b：t=4.572、3.444,P<0.05，與模型組比較；c：t=2.421、3.912,P<0.05，與空白對照組比較

2.2 3組大鼠腦組織多巴胺、AchE水平比較 模型組大鼠腦組織多巴胺明顯低于空白對照組，AchE明顯高于空白對照組(P<0.05)；石杉堿甲組大鼠腦組織多巴胺明顯高于模型組，AchE明顯低于模型組(P<0.05)；且石杉堿組大鼠腦組織多巴胺明顯低于空白對照組，AchE明顯高于空白對照組(P<0.05)，見表2。

表2 三組大鼠腦組織中多巴胺、AchE水平比較±s)

a：t=12.517、6.834,P<0.05，與空白對照組比較；b：t=6.388、4.719,P<0.05，與模型組比較；c：t=6.055、2.024,P<0.05，與空白對照組比較

2.3 3組大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)ATPase 活性比較 模型組大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、N2+- K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均明顯低于空白對照組(P<0.05)；石杉堿甲組大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+- K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均高于模型組(P<0.05)，且大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+- K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase水平均低于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)中ATP酶活性測定結(jié)果比較

a：t=20.326、15.2225、12.517,P<0.05，與空白對照組比較；b：t=16.771、9.516、7.480,P<0.05，與模型組比較；c：t=3.901、5.844、5.848,P<0.05，與空白對照組比較

3 討 論

帕金森病是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理機(jī)制與患者中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的缺失密切相關(guān)。多巴胺合成減少，導(dǎo)致黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺通路多巴胺能神經(jīng)功能減弱，乙酰膽堿系統(tǒng)功能相對亢奮，而鈣超載參與帕金森的多巴胺能神經(jīng)元損傷的發(fā)生發(fā)展[11]。

石杉堿甲是從我國傳統(tǒng)中草藥蛇足石杉分離提取到的一種新型石松類生物堿，具有高效、可逆選擇性AchE抑制的作用，脂溶性高，分子量小，易透過血腦屏障，能增加突觸間隙內(nèi)乙酰膽堿含量，促進(jìn)乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的升高[12-13]。乙酰膽堿是形成記憶的神經(jīng)遞質(zhì)，主要由膽堿酯酶分解而成。帕金森患者大腦中樞膽堿能神經(jīng)元受損，使ACh遞質(zhì)減少[14]。多巴胺屬于神經(jīng)遞質(zhì)，是負(fù)責(zé)傳遞大腦情欲、感覺的是一種腦內(nèi)分泌物[15]，使用石杉堿甲抑制AchE活性后，能改善膽堿能神經(jīng)元受損癥狀[16]。本文研究中，石杉堿甲組大鼠信息游泳時間、選擇游泳時間明顯短于模型組，這也可以從兩組大鼠腦組織中多巴胺、AchE含量比較中得到證實，與劉忠錦等[17]文獻(xiàn)報道基本相似，提示石杉堿甲可通過調(diào)節(jié)多巴胺、AchE發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

腦組織對缺血缺氧非常敏感，細(xì)胞內(nèi)Ca2+是神經(jīng)元凋亡的觸發(fā)者。當(dāng)鈣離子大量內(nèi)流時可加強(qiáng)缺氧癥狀，導(dǎo)致一氧化氮合酶(NOS)的激活與釋放，進(jìn)而增加一氧化氮(NO)含量[18]。二者均促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)、加重線粒體損傷，線粒體損傷又加深鈣超載程度，進(jìn)一步加重神經(jīng)元細(xì)胞損傷及凋亡，因此拮抗Ca2+的作用可起到抗凋亡和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[19]。Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase是細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換的重要系統(tǒng)[20]，當(dāng)上述3種ATP酶活性下降時，會引起Ca2+超載，所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用則導(dǎo)致神經(jīng)元活性下降甚至死亡。有研究顯示，帕金森大鼠大腦紋狀體中多巴胺神經(jīng)元丟失與多巴胺含量下降、黑質(zhì)的Caspase-3表達(dá)增多有關(guān)[21]。白妍等[10]指出，提高帕金森病大鼠腦黑質(zhì)中Ca2+-ATPase、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase酶活性能減少鈣超載。本文研究中，石杉堿甲組大鼠腦黑質(zhì)中3種ATPase活性均高于模型組，說明石杉堿甲有助于調(diào)節(jié)ATP酶活性。本研究結(jié)果表明，石杉堿甲有助于提高帕金森模型大鼠空間記憶能力，可能與抑制AchE表達(dá)、提高腦組織中多巴胺及ATP酶活性有關(guān)。需要提出的是，由于可供參考文獻(xiàn)較少，本文對石杉堿甲對乙酰膽堿酶、ATP酶活性影響可能作用機(jī)制分析不夠，這也是研究的局限性之一。而且由于人體與動物對藥物反應(yīng)能力的差異性，石杉堿甲用于治療帕金森病還有待于更多的臨床研究去證實。

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楊彭(1980-)，主治醫(yī)師，碩士， 主要從事腦血管疾病、帕金森病、癡呆的研究?！?/p>

，E-mail:yp198003@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.036

R322.81

A

1671-8348(2017)22-3132-04

2017-01-31

2017-03-12)