況春燕,楊 藩

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 550002； 2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院/陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西楊凌 712100)

論著·基礎研究

小鼠pMSV-Slfn5-GFP 表達質(zhì)粒構建及基因結構分析*

況春燕1,楊 藩2

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽 550002； 2.西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院/陜西省干細胞工程技術研究中心，陜西楊凌 712100)

目的 構建小鼠pMSV-Slfn5-GFP 基因重組表達質(zhì)粒及基因結構分析。方法 提取小鼠肝臟組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴增小鼠Slfn5編碼序列片段,并與pGEM-T Easy載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送Macrogen USA測序。測序正確的質(zhì)粒通過HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,并命名為pMSV-Slfn5-GFP。通過UCSC(http://genome.ucsc.Edu/) 分析小鼠Slfn5及其家族基因組結構，并通過NCBI確定Slfn5的蛋白結構域。結果 Slfn5全長基因序列克隆到表達載體pMSV-GFP中，酶切鑒定片段大小為2.65 kb。Slfn5的AAA_4蛋白結構域由phylogeny.fr確定了該結構在Slfn蛋白家族中的保守性。結論 成功構建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全長基因表達載體。

pMSV-Slfn5-GFP；構建；基因結構；分析

睡眠因子(Schlafen,Slfn)基因家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的細胞周期調(diào)節(jié)基因，該家族基因在小鼠中由10個成員組成(Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10和14)[1-2]。Slfn5 是Slfn家族第三組的成員之一，它可影響多種細胞的生物學行為，但在不同的細胞中，其作用不同：(1)在NIH 3T3成纖維細胞中，通過異源性過表達Slfn5基因，結果發(fā)現(xiàn)成纖維細胞的生長并未受到影響[3]；(2)在人類惡性黑色素瘤細胞中，通過基因干擾的方法沉默Slfn5的表達，結果顯示其有雙重的作用，不僅促進惡性黑色素瘤細胞的不依賴支持物的生長和克隆形成能力，而且還增強該細胞在三維膠原中的侵襲能力[4]；筆者的前期研究，分離培養(yǎng)5～7 d的大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞，通過RT-PCR檢測Slfn5基因的表達，結果發(fā)現(xiàn)在EPCs細胞有Slfn5基因的表達，是否 Slfn5基因影響內(nèi)皮祖細胞的功能，目前仍不清楚。為了研究Slfn5基因?qū)?nèi)皮祖細胞功能的影響，需要構建Slfn5基因的表達載體，本文獲得小鼠Slfn5全長基因表達質(zhì)粒并對其基因的結構進行分析，為進一步探討其在內(nèi)皮祖細胞的生物學作用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸埃希菌DH5α，質(zhì)粒pMSV-GFP、反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞Plat-E、小鼠293細胞由西奈山醫(yī)學院遺傳系實驗室提供。載體pGEM-T Easy均購自Promega公司。總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA marker均購自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq 聚合酶均購自Fermentas公司；高保真DNA聚合(PhantaTMHS Super-Fidelity DNA Polymerase)購自Vazyme公司；定量PCR Mix (Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture)購自Bioteke公司；脂質(zhì)體 (Lipofectamine 2000)、Opti-MEM和DMEM培養(yǎng)基均購自Invitrogen公司；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巰基乙醇 (β-ME) 購自Gibco 公司；胎牛血清(FBS) 購自Hyclone公司；PCR 引物由美國Macrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Slfn5編碼序列的克隆與載體構建 參照天根的血液/細胞/組織基因組RNA提取試劑盒從小鼠肝臟組織中提取總RNA。從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下載小鼠Slfn5編碼序列(CDS)并設計帶有酶切位點HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,引物序列為Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA,并擴增2.7 kb CDS片段。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行回收，并與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中。挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送美國Macrogen公司測序。測序正確的質(zhì)粒通過HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,并命名為pMSV-Slfn5-GFP。引物序列為Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與感染 Plat-E和293細胞用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。按照Lipofectine 2000使用說明書，首先將pMSV-Slfn5-GFP 轉(zhuǎn)入Plat-E細胞，轉(zhuǎn)染后18 h在換成新鮮培養(yǎng)液。并在轉(zhuǎn)染后48、72、96 h收取細胞培養(yǎng)液中上清液存放于4 ℃冰箱中。將收集的培養(yǎng)液上清液用45 nm的濾器過濾并按照上清液與細胞培養(yǎng)液1∶1的比例感染小鼠內(nèi)皮祖細胞，并在感染12 h后換液。為了提高感染效率將在換液后12 h進行第2次感染并換液。

1.2.3 熒光定量PCR 按照天根總RNA提取試劑盒說明書提取組織總RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit 相關說明進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并設計qSlfn和qGAPDH引物。熒光定量PCR 反應體系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 pmol/L)，模板 cDNA 1 μL，去離子水7 μL，共20 μL。每個樣本設3個重復。反應條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃退火階段收集熒光信號。實時熒光定量PCR引物序列Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.4 小鼠Slfn5編碼序列克隆及生物學分析 本研究通過UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結構，并通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)確定Slfn5的AAA_4蛋白結構域。

2 結 果

2.1 Slfn基因簇結構分析 通過對小鼠Slfn家族基因在基因組中的定位分析發(fā)現(xiàn)，10個Slfn基因成簇分布于11Qc,且長度約為1 mbp(82.95～83.30 mbp)。這其中包含了2個非編碼基因Slfn5os和假基因Slfn10-ps。Slfn5os(Schlafen 5,opposite strand)是位于對應鏈上的Slfn5序列， Slfn5位于Slfn5os下游(圖1A)。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)， Slfn5編碼884個氨基酸且含有4個保守的結構域。其中的AAA-4結構域位于第188和320氨基酸之間。該結構域在Slfn家族中很保守(圖1B)。進一步對Slfn家族全長蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)Slfn5蛋白與Slfn1、Slfn3、Slfn4和Slfn2同源性較高，但是與Slfn8和Slfn9差異較大。

A：Slfn相關基因在第11號染色體上的額定位。B：Slfn蛋白及AAA_4結構域在Slfn家族蛋白中的同源比對

圖1 Slfn基因結構分析

2.2 Slfn5組織表達分析 通過對小鼠序列表達標簽(EST)分析發(fā)現(xiàn),小鼠Slfn5表達具有組織特異性。具體來說神經(jīng)組織和腺體高表達Slfn5(圖2A)。通過設計針對Slfn5全序列的特異引物，成功從腺體組織中擴增得到Slfn5(圖2B)。

A：Slfn5序列表達標簽分布分析；B：Slfn5在腺體組織中的表達檢測(1、2表示腺體組織)

圖2 Slfn5組織表達分析

2.3 Slfn5表達載體構建 將擴增得到Slfn5通過酶切插入到pMSV-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中(圖3A)。雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)成功地將2.65 kb的序列成功插入到了目標載體(圖3B)。

A：Slfn5通過酶切插入到pMSV-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中；B:雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)將2.65 kb的序列成功插入到目標載體

圖3 pMSV-Slfn5-GFP表達載體構建

2.4 Slfn5基因結構分析 本研究通過UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結構，并通過NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 確定了Slfn5的AAA_4蛋白結構域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)確定了該結構在Slfn蛋白家族中的保守性。

3 討 論

本研究有3個發(fā)現(xiàn)：(1)成功構建小鼠Slfn5表達載體；(2)發(fā)現(xiàn)Slfn5在神經(jīng)組織及腺體組織中有高表達；(3)Slfn基因簇結構分析發(fā)現(xiàn)Slfn5編碼884個氨基酸且含有4個保守的結構域，其中Slfn5的AAA_4蛋白結構域由phylogeny.fr確定了該結構在Slfn蛋白家族中的保守性。

Slfn基因家族盡管包含了許多成員，但在不同的物種之間，各個成員的表達不同,其作用也不盡相同。是否Slfn家族在小鼠及人類有相同的功能或其功能有物種的專一性，目前仍不清楚。幾個小鼠的Slfn基因，包括Slfn1、Slfn2、Slfn3在細胞增殖和分化上發(fā)揮關鍵的調(diào)節(jié)作用[5-7],Slfn2在免疫細胞靜止狀態(tài)下發(fā)揮重要作用[8]，而Slfn4參與髓細胞生成的調(diào)控[9]。Slfn5在小鼠及人類有表達[1-2]。人類Slfn5包含有一個RNA/DNA解鏈酶基序，而在Slfn組1成員中未見此結構[10]。有研究報道，Slfn5在干擾素誘導下,在人類的黑色素瘤細胞及腎癌細胞內(nèi)表達，并且負性調(diào)節(jié)人類惡性黑色素瘤細胞的生長和侵襲能力[4],而在鼠類的惡性黑色素瘤細胞并無類似的作用[11]。此外，Slfn5參與腎癌細胞的運動及侵襲能力的調(diào)控，并且Slfn5的表達與腎癌患者的存活呈正相關[12]。目前，Slfn5的組織表達特異性及其是否參與血管細胞的生物學行為的調(diào)控，目前均少見報道。

筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，Slfn5在小鼠的內(nèi)皮祖細胞有表達，為了研究Slfn5是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細胞的生物學行為，本研究設計構建了小鼠Slfn5的表達載體。本實驗通過獲得小鼠Slfn5的全長基因，為研究Slfn5在小鼠的功能提供新的可靠依據(jù)。本研究從小鼠肝臟組織中提取了總RNA，并將其進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并設計帶有酶切位點HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,利用引物從cDNA中擴增出Slfn5的全長2.65 kb的基因序列，并與pGEM-T Easy載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中形成克隆后，挑取陽性克隆進行雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒進行測序,經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)得到的Slfn5與網(wǎng)上公布的序列NM_183201一致。測序正確的質(zhì)粒通過HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,質(zhì)粒構建成功。同時,也通過UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結構，并通過NCBI分析Slfn5的AAA_4蛋白結構域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)確定了該結構在Slfn蛋白家族中的保守性。Slfn5組織表達分析。此外，還通過對小鼠EST分析發(fā)現(xiàn),小鼠Slfn5表達具有組織特異性,其在神經(jīng)組織及腺體組織高表達，通過設計Slfn5全序列的特異引物，成功從腺體組織中擴增得到Slfn5。目前，國際上對Slfn5的作用研究極其有限，通過本實驗獲得Slfn5的全長基因系列，并對其結構及其組織表達進行分析，可為進一步研究其在血管系統(tǒng)及神經(jīng)組織及腺體組織中的生物學效應打下堅實的基礎。

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Construction of pMSV-Slfn5-GFP plasmid and analysis of gene structure in mice*

KuangChunyan1,YangFan2

(1.DepartmentofCardioloy,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.ShaanxiProvincialCenterforStemCellsEngineeringandTechnologyResearch,CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestAgricultureandForestScienceandTechnologyUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Objective To perform mouse pMSV-Slfn5-GFP gene recombinant expression plasmid construction and gene structure analysis.Methods Total RNA was extracted from mouse liver and turned into cDNA by reverse transcription.Mouse Slfn5 coding sequence (CDS) fragment was amplified by PCR and connected with the pGEM-T Easy vector.The connected product was transferred the E.coli DH5α.The positive clones were selected for extracting plasmid,which was identified by double enzyme of restriction endonucleaseHpaⅠ andXhoⅠ.Then correct plasmid identified by enzyme digestion was sequenced by Macrogen USA.Then correct plasmid by sequencing was connected with pMSV-GFP byHindⅢ andXboⅠ,which was named as pMSV-Slfn5-GF.UCSC (http://genome.ucsc.Edu /) was used to analyze mouse Slfn5 and its family genomic structure.Slfn5 protein structural domain was determined by NCBI.Results Slfn5 full-length gene sequence was cloned into the expression vector pMSV-GFP,the fragment size was about 2.65 kb by enzyme digestion identification.The conservatism of AAA_4 protein domain in Slfn5 protein family was determined by phylogeny.fr.Conclusion Mouse full-length gene pMSV-Slfn5-GFP expression vector is successfully constructed.

pMSV-Slfn5-GFP； construction； gene structure； analysis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.003

國家自然科學基金資助項目(81560056)。 作者簡介：況春燕(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病，血管損傷和修復的研究。

Q331

A

1671-8348(2017)22-3033-03

2017-02-22

2017-04-10)