易 哲，葉姜瑜，李大榮， 竇建軍， 石玉竹

(1.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院， 重慶 400030；2.重慶融極環(huán)保有限公司， 重慶 401120)

喀斯特地貌中碳酸酐酶微生物鑒定與特性研究

易 哲1，葉姜瑜1，李大榮2， 竇建軍1， 石玉竹1

(1.重慶大學(xué) 城市建設(shè)與環(huán)境工程學(xué)院， 重慶 400030；2.重慶融極環(huán)保有限公司， 重慶 401120)

喀斯特地貌；碳酸酐酶；循環(huán)冷卻水

循環(huán)冷卻水系統(tǒng)運(yùn)行過程中由于蒸發(fā)濃縮而產(chǎn)生水垢，主要是碳酸鹽垢、磷酸鹽垢、硅酸鹽垢和混合物垢，影響系統(tǒng)的正常換熱效率。葉姜瑜等[3]將碳酸酐酶微生物用于處理循環(huán)水的水垢，結(jié)果表明：碳酸酐酶能溶蝕硬垢且造成其結(jié)構(gòu)疏松，表面被溶蝕為細(xì)小的顆粒，溶蝕效果深入到垢樣內(nèi)部。在此基礎(chǔ)上，選取具有典型喀斯特地貌的重慶金佛山景區(qū)的土壤樣本，分離出高產(chǎn)碳酸酐酶菌，選取酶活性最高的一株菌，觀察其形態(tài)和生理特性，并鑒定其種屬。同時(shí)，研究了工業(yè)循環(huán)冷卻水的主要環(huán)境因子溫度、pH值、金屬離子、陰離子對(duì)高產(chǎn)碳酸酐酶微生物活性的影響，這將為構(gòu)建高效的循環(huán)水微生物阻垢劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

夏季在金佛山古佛洞溶蝕巖石表面、古佛洞流水洞壁、苔蘚覆蓋的巖石表面及燕子洞洞口巖石表面取表層土壤作為土樣，編號(hào)1、2、3、4。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

1.3 產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌分離與篩選

將4份新鮮土壤樣品分別稱取3份，制備10-3、10-4、10-5、10-6的稀釋菌液，分別將其均勻涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)平板上。挑平板上不同形態(tài)和顏色的單菌落，采取分區(qū)劃線法將其分離培養(yǎng)。在分離細(xì)菌的平板上挑取單菌落，采用平板劃線進(jìn)一步純化。將純化后的菌種用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基擴(kuò)培至200 mL，留待后續(xù)分析及甘油保種。

純細(xì)菌培養(yǎng)物適量涂布于白堊培養(yǎng)基上，30 ℃ 倒置培養(yǎng)24～48 h。選擇能在此固體培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，測(cè)定其純細(xì)菌培養(yǎng)物的碳酸酐酶活性，從而篩選出能產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌。

1.4 產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌形態(tài)觀察與生長曲線

采用革蘭氏染色法[4]對(duì)篩選出的產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌進(jìn)行染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)。生長曲線測(cè)定：將培養(yǎng)好的種子液，按2 %比例接種到裝有牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，置于180 r/min搖床中，30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，每2 h測(cè)OD600值。

1.5 產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌鑒定

用無菌的槍頭挑取極少量至少經(jīng)3次劃線純化的單菌落，洗脫至30.0 μL無菌超純水中(盛放在PCR管中)作為模板，16S引物采用細(xì)菌通用引物8F和1492R[5]。正向引物8F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer(不含鎂離子)，2.5 μL；MgCl2，1.5 μL；dNTP，2.0μL；上下游引物(10 uM)，各1.0 μL；Taq酶(5 U/μL)，0.4 μL；模板，2.0 μL；用無菌超純水補(bǔ)足25.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)反應(yīng)5 min；94 ℃變性1 min；56 ℃反應(yīng)1 min；72 ℃退火1.5 min，反應(yīng)循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min；18 ℃保溫60 min。反應(yīng)結(jié)束后，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其大小，將PCR產(chǎn)物用TaKaRa DNA凝膠回收試劑盒(D823A)進(jìn)行純化。

將純化產(chǎn)物委托給寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析，并將測(cè)序結(jié)果提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)[6]。

1.6 碳酸酐酶的提取與純化

將細(xì)菌培養(yǎng)物在4 ℃、5 000 r/min下冷凍離心10 min，取上清液備用。向上清液中加入一定量的(NH4)2SO4使溶液飽和度達(dá)到75 %，此條件下析出的碳酸酐酶的酶量及活性最高[7]，并將其置于4 ℃下鹽析12 h。將鹽析后的液體在4 ℃、8 000 r/min下冷凍離心30 min，棄上清液，得到蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)沉淀完全溶解于50.0 mmol/L、pH值8.2的HEPES-KOH緩沖溶液中，溶液過G-100葡聚糖凝膠柱，并用100.0 mmol/L、pH值7.5的Tris-H2SO4緩沖液作為洗脫液去洗脫收集粗酶液[8-10]。

1.7 碳酸酐酶活性測(cè)定

碳酸酐酶活性參照Brownell[11]等的方法略作改進(jìn)后測(cè)定，該測(cè)定方法為：在一個(gè)2 ℃的冷凍反應(yīng)室中，將4.5 mL冰冷的現(xiàn)制CO2飽和水分別加入到0.5 mL煮沸和未煮沸的CA酶液中，并測(cè)定其pH值下降一個(gè)單位所用的時(shí)間。

酶活單位數(shù)

U=10(T0/Te-1)

其中：T0為加入煮沸CA酶液組所測(cè)得的pH值下降一個(gè)單位所需的時(shí)間；Te為加入未煮沸CA酶液組所測(cè)得的pH值下降一個(gè)單位所需的時(shí)間。蛋白測(cè)定參照Lowry等[12]的方法。碳酸酐酶活性以每mg蛋白含有的酶活單位數(shù)(U/mg)表示。

1.8 細(xì)菌碳酸酐酶特性研究

1.8.1 細(xì)菌碳酸酐酶的熱穩(wěn)定性研究

將從細(xì)菌中提取出的碳酸酐酶分別在10、20、30、40、50、60 ℃下處理15、30、60 min，并分別測(cè)定處理后的酶活性。

1.8.2 pH值對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶的影響研究

將從細(xì)菌中提取出的碳酸酐酶分別在pH 值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下處理1 h，測(cè)定處理后的酶活性。

1.8.3 金屬陽離子對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶的影響研究

配置一定濃度的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+金屬陽離子溶液，分別與從細(xì)菌中提取出的碳酸酐酶以一定比例混合，使混合后的金屬離子濃度達(dá)到0.001、0.01、0.10、1.00 mmol/L，將混合溶液置于室溫下，使其平衡1 h，測(cè)定處理后的酶活性。

1.8.4 陰離子對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶的影響研究

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌分離與篩選

金佛山風(fēng)景區(qū)是典型的喀斯特地貌，有研究結(jié)果表明，夏秋季節(jié)土壤中CA活性較高[13]，且表層土壤的微生物種類及土壤活性更高[14]。從土樣中共分離出肉眼可見的不同形態(tài)菌落的可培養(yǎng)細(xì)菌16株。其中有8株菌能在白堊培養(yǎng)基上生長，分別為C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8。其中C8菌株在白堊培養(yǎng)基上生長的菌斑特別明顯，如圖1所示。通過檢測(cè)菌斑周圍水解圈的pH值發(fā)現(xiàn)呈弱堿性，所以需確定是由于細(xì)菌利用碳酸鈣造成的，而不是細(xì)菌產(chǎn)酸水解造成的[15]。

圖1 菌株C8在白堊培養(yǎng)基上的白堊菌斑

2.2 細(xì)菌碳酸酐酶活性測(cè)定

分別提取能產(chǎn)碳酸酐酶的8株細(xì)菌的碳酸酐酶，測(cè)定酶活性，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知：分離出的8株菌均能檢測(cè)到碳酸酐酶活性，且個(gè)體差異明顯。其中菌株C8的碳酸酐酶活性最高，達(dá)到2.12 U/mg，而C2號(hào)菌株的碳酸酐酶活性只有0.20 U/mg，這說明雖然碳酸酐酶普遍存在于原核生物中，但不同種屬的菌，其表達(dá)程度有很大差異。在此，僅對(duì)活性最高的C8菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖2 細(xì)菌碳酸酐酶活性

2.3 高產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌形態(tài)及生長曲線

C8在固體選擇培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果見圖3。由圖3可知：C8菌為革蘭氏陽性菌，呈短桿狀。其生長曲線如圖4所示。由圖4可知：大約在18 h C8達(dá)到穩(wěn)定期，以此作為后續(xù)提取碳酸酐酶的依據(jù)。

圖3 C8菌落(A)及革蘭氏染色(B：40×100)

圖4 菌株C8生長曲線

2.4 高產(chǎn)碳酸酐酶細(xì)菌鑒定

對(duì)C8菌進(jìn)行16S rRNA序列分析，用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果與GenBank中的己登錄的序列進(jìn)行相似性分析，得出結(jié)果為：菌株C8與Bacillussp.菌的16S rDNA序列有100%的同源性。

2.5 溫度對(duì)碳酸酐酶穩(wěn)定性的影響

將Bacillussp.菌的碳酸酐酶置于10、20、30、40、50、60 ℃下分別處理20、40、60 min后，酶的相對(duì)剩余活性如圖5所示。

圖5 溫度對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶活性的影響

結(jié)果表明：3個(gè)處理時(shí)間下酶的相對(duì)活性變化趨勢(shì)大致相同，相同溫度下，隨著處理時(shí)間的加長，酶活性有所下降。溫度在10～40 ℃時(shí)，碳酸酐酶基本能維持較好的活性；超過50 ℃后，酶活下降非常明顯，僅處理20 min，就只余下70 %的活性，且隨處理時(shí)間增多，酶活繼續(xù)下降。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，只余下30 %的活性。循環(huán)冷卻水系統(tǒng)管道及換熱器中的溫度較高，碳酸酐酶處理水垢的效果受到抑制，但是集水池中的溫度一般在30 ℃，細(xì)菌碳酸酐酶能在其中維持較好的活性[3,16]。

2.6 pH值對(duì)碳酸酐酶穩(wěn)定性的影響

將Bacillussp.菌的碳酸酐酶分別在pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5下處理1 h，處理后的酶活性變化見圖6。

由圖6可知，碳酸酐酶最適pH值范圍是7.0～8.5。過酸過堿的環(huán)境都會(huì)對(duì)其活性有較大影響，如pH值低于6.0時(shí)，僅殘留10%左右的活性；pH值大于9.5時(shí)，活性僅余60%左右。由此可知，碳酸酐酶在pH值為6.8～9.0的循環(huán)冷卻水中能維持較高活性。

圖6 pH值對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶活性的影響

2.7 金屬陽離子對(duì)碳酸酐酶穩(wěn)定性的影響

將Bacillussp.菌的碳酸酐酶分別置于濃度為0.001、0.01、0.10、1.00 mmol/L的Zn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+液中，室溫處理1 h，處理后的酶活性變化見圖7。

圖7 金屬離子對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶活性的影響

Zn2+是α-CA金屬配位層的活性中心[17-18]，而Fe2+也是β類CA活性中心的組成部分[19]，對(duì)碳酸酐酶高效催化CO2水合可逆反應(yīng)十分重要。由圖可知，F(xiàn)e2+和Zn2+在濃度低于0.01 mmol/L 時(shí)，有一定的增強(qiáng)碳酸酐酶活性激活效果，其中Zn2+的增強(qiáng)效果比Fe2+更明顯，在濃度0.001 mmol/L時(shí)，達(dá)到9%。當(dāng)濃度高于0.01 mmol/L時(shí)，F(xiàn)e2+和Zn2+都抑制了碳酸酐酶活性，但仍維持在65%以上。相反，Ca2+、Mg2+對(duì)碳酸酐酶活性則有抑制作用，隨濃度升高抑制作用越明顯，Mg2+的抑制作用比Ca2+稍強(qiáng)，但處理后都能維持在65%以上的活性。

2.8 陰離子對(duì)碳酸酐酶穩(wěn)定性的影響

圖8 陰離子對(duì)細(xì)菌碳酸酐酶活性的影響

3 結(jié)論

1) 從土壤中篩選出來的高產(chǎn)碳酸酐酶微生物為Bacillussp.菌，革蘭氏陽性菌，呈短桿狀，于18 h達(dá)到生長穩(wěn)定期。

2)Bacillussp.菌的碳酸酐酶能在10～40 ℃維持較高活性，溫度高于50 ℃則活性降低了70%；pH值處于7.0～8.5時(shí)活性較高，而循環(huán)冷卻水的pH值一般控制在6.8～9.5，集水池水溫與大部分管道的溫度一般控制在30 ℃左右，碳酸酐酶能在其中維持較高活性。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Identification and Characterization of Bacterium with Carbonic Anhydrase in Karst Landform

YI Zhe1, YE Jiangyu1, LI Darong2, DOU Jianjun1, SHI Yuzhu1

(1.Faculty of Urban Construction and Environmental Engineering, Chongqing University, Chongqing 400030, China；2.Chongqing Rongji Environmental Technology Co., Ltd.，Chongqing 401120，China)

Karst landform；carbonic anhydrase；circulating cooling water

2017-02-17 基金項(xiàng)目：國家科技重大專項(xiàng)(2013ZX07104004)

易哲(1991—)，男，碩士研究生，主要從事環(huán)境工程微生物學(xué)研究；通訊作者 葉姜瑜(1963—)，男，四川人，博士，副教授，博士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境工程微生物學(xué)研究，E-mail：yejy8888@163.com。

易哲，葉姜瑜，李大榮，等.喀斯特地貌中碳酸酐酶微生物鑒定與特性研究[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué))，2017(8):113-119.

format：YI Zhe, YE Jiangyu, LI Darong,et al.Identification and Characterization of Bacterium with Carbonic Anhydrase in Karst Landform[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(8):113-119.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.08.019

X172

A

1674-8425(2017)08-0113-07