應(yīng)向賢，高 亮，張 麗，毛王偉，趙 嫚，汪 釗

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

釀酒酵母醛酮還原酶的克隆表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

應(yīng)向賢，高 亮，張 麗，毛王偉，趙 嫚，汪 釗

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

從釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC 1002基因組中克隆獲得醛酮還原酶基因，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中實(shí)現(xiàn)過量表達(dá).重組醛酮還原酶經(jīng)Ni-NTA親和層析分離純化獲得高純度目的蛋白，并對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)表征.該重組酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為單一條帶，分子量為38 kDa.該酶的最適pH和最適溫度分別為6.0，60 ℃，且具有良好的穩(wěn)定性.1 mmol/L金屬離子Co2+或Ni2+顯著提高酶活力.底物特異性分析表明：該重組酶對(duì)鄰位二酮具有較高活力，其中對(duì)酮基泛解酸內(nèi)酯的比酶活可達(dá)20.53 U/mg.

釀酒酵母；醛酮還原酶；克隆表達(dá)；酶學(xué)性質(zhì)；酮基泛解酸內(nèi)酯

醛酮還原酶(Aldo-keto reductase; AKR)是氧化還原酶超家族成員之一，廣泛存在于真核與原核生物中[1].AKR超家族目前由15 個(gè)家族組成，家族成員約有150 個(gè)[2]，它們的催化中心為D-Y-K-H，且以β-折疊的羧基端與輔酶結(jié)合，這與短鏈脫氫/還原酶(Short-chain dehydrogenases/reductases; SDR)不同，后者是通過Rossmann折疊區(qū)域和NAD (P) (H)結(jié)合[3].鑒于醛酮還原酶表現(xiàn)出較高的催化活性和立體選擇性，其在手性醇不對(duì)稱合成上的應(yīng)用備受關(guān)注[4].D-泛解酸內(nèi)酯是D-泛酸合成過程中重要的手性前體，工業(yè)上由化學(xué)法羥醛縮合作為起始反應(yīng)合成混旋泛解酸內(nèi)酯[5-6]，再通過生物酶水解拆分而獲得[7-8].生物酶選擇性水解拆分泛解酸內(nèi)酯需要D-泛解酸和L-泛解酸內(nèi)酯的分離，D-泛解酸內(nèi)酯化以及L-泛解酸內(nèi)酯的消旋化后再利用[9].為了克服拆分法的不足，研究者開發(fā)了多種新的催化工藝，其中又以氧化還原酶法合成D-泛解酸內(nèi)酯的工藝最具應(yīng)用潛力[9].氧化還原酶法利用L-泛解酸內(nèi)酯脫氫酶催化L-泛解酸內(nèi)酯的脫氫生成酮基泛解酸內(nèi)酯，酮基泛解酸內(nèi)酯再通過酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶催化的不對(duì)稱還原反應(yīng)生成D-泛解酸內(nèi)酯[10]，實(shí)現(xiàn)手性翻轉(zhuǎn).來自Candidaparapsilosis中的CPR-C2是目前已知的活力較高的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶[11]，但其催化效果仍達(dá)不到工業(yè)化應(yīng)用的要求.因而，發(fā)現(xiàn)新型的高活力酮泛解酸內(nèi)酯還原酶具有積極意義.

以釀酒酵母(SaccharomycescerevisiaeCCIC 1002)為出發(fā)菌株，對(duì)其基因組中的醛酮還原酶基因進(jìn)行分子克隆和誘導(dǎo)表達(dá)，并利用Ni-NTA親和層析實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分離純化，確定其可以用于不對(duì)稱合成D-泛解酸內(nèi)酯.在此基礎(chǔ)上，表征了該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)，如最適溫度、最適pH、pH和溫度穩(wěn)定性、金屬離子的影響和底物特異性等，為后續(xù)酶法不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與載體

釀酒酵母(S.cerevisiaeCCIC 1002)由本實(shí)驗(yàn)室保藏；宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)為實(shí)驗(yàn)室已有資源；E.coliTrans-T1克隆宿主菌和載體pEASY-Blunt E1購(gòu)自北京全式金(TransGen Biotech)生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 試 劑

PfuDNA聚合酶及配套材料，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Taq DNA聚合酶及其對(duì)應(yīng)dNTPs，南京諾唯贊生物科技有限公司；用于質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，大連寶生物工程有限公司；基因組提取試劑盒、輔酶NAD(P)(H)、蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液BSA等，上海生工生物工程股份有限公司.

1.1.3 引 物

根據(jù)S.cerevisiaeS288c中D-阿拉伯糖1-脫氫酶基因設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增醛酮還原酶基因引物，引物如下：

上游引物SceAKR3C1 F：5′- ATGTCTTCTTCAGTAGCCTCAAC-3′

下游引物SceAKR3C1 R：5′-TTAATACTTTAAATTGTCCAAGTTTG-3′

1.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20.調(diào)節(jié)pH至7.0，培養(yǎng)基于115 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min.

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 10.調(diào)節(jié)pH至7.0，固體培養(yǎng)基中添加2.0%的瓊脂粉，培養(yǎng)基于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min.

LB/Amp培養(yǎng)基(g/L)：在LB培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(Ampicillin; Amp)至終質(zhì)量濃度100 μg/mL.

1.2 方 法

1.2.1 醛酮還原酶SceAKR3C1的基因克隆

以S.cerevisiaeCCIC 1002基因組為DNA模板，進(jìn)行醛酮還原酶SceAKR3C1的基因克隆，PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s；55 ℃復(fù)性20 s；72 ℃延伸1 min；反應(yīng)循環(huán)數(shù)為35；72 ℃復(fù)延伸5 min.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并回收純化.純化后PCR產(chǎn)物與載體pEASY-Blunt E1連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μLE.coliTrans-T1感受態(tài)細(xì)胞中.采用菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆子，選取陽(yáng)性克隆子送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序確證.將測(cè)序所得的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的基因序列進(jìn)行比對(duì)，并將含有目的片段的質(zhì)粒命名為pEASY-Blunt E1-SceAKR3C1.

1.2.2 基因重組菌E.coliBL21 (DE3)/pEASY-Blunt E1-SceAKR3C1的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-SceAKR3C1，取50～100 ng將其轉(zhuǎn)入50 μL剛解凍的感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21 (DE3)中，孵育1 h后將其涂布于LB/Amp固體平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng).挑取陽(yáng)性克隆子，接種于含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)12 h，作為種子液.按體積分?jǐn)?shù)2%接種量擴(kuò)大培養(yǎng)至Amp抗性的150 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖瓶培養(yǎng)至菌體濃度OD600=0.6～0.8時(shí)，添加誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG；0.1 mmol/L).然后22 ℃，150 r/min誘導(dǎo)10 h.

1.2.3 SceAKR3C1的分離純化

誘導(dǎo)結(jié)束后，4 ℃，8 000 r/min離心10 min收集菌體，并用超純水反復(fù)重懸清洗，再離心收集菌體.用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)重懸菌體(菌體最終質(zhì)量濃度為50 g/L)，然后在冰浴條件下超聲破碎細(xì)胞.超聲破碎參數(shù)：工作時(shí)間1 s，間歇時(shí)間1 s，有效破碎時(shí)間為10 min.細(xì)胞裂解液在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，收集上清即為含SceAKR3C1粗酶液.

Ni-NTA親和層析柱經(jīng)含5 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH 8.0)預(yù)平衡后，加入SceAKR3C1粗酶液上樣.Ni-NTA親和層析柱上結(jié)合的蛋白通過5～250 mmol/L的咪唑濃度梯度進(jìn)行逐步梯度洗脫，并對(duì)各洗脫組分進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè).將洗脫出的含有目的蛋白SceAKR3C1的溶液用50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)通過超濾脫鹽，保存在-20 ℃下進(jìn)一步使用.以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，利用Bradford試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度.

1.2.4 醛酮還原酶SceAKR3C1的酶學(xué)性質(zhì)研究

以酮基泛解酸內(nèi)酯為底物，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)NADPH在波長(zhǎng)340 nm下1 min內(nèi)的吸光度變化值來測(cè)定酶活力.標(biāo)準(zhǔn)酶活力測(cè)定體系為2.5 mL，包括：10 mmol/L酮基泛解酸內(nèi)酯，5.9 μg SceAKR3C1，0.1 mmol/L NADPH，0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.0)補(bǔ)至2.5 mL，反應(yīng)溫度60 ℃.NADPH的摩爾消光系數(shù)為6.22×103L/(mol·cm)，酶活力單位(U)定義為每分鐘消耗1 μmol NADPH所需的酶量.

通過測(cè)定pH 5.0～8.5緩沖液中SceAKR3C1的酶活力確定該目的蛋白的最適pH，其中pH 5.0緩沖液為0.2 mol/L KH2PO4-Na2HPO4溶液.在最適pH條件下，通過測(cè)定25～65 ℃下SceAKR3C1的酶活力確定該目的蛋白的最適溫度.在pH穩(wěn)定性方面，在最適溫度下將該酶孵育在不同pH的緩沖液中，間隔一定時(shí)間測(cè)定殘余活力，孵育前的酶活力為100%.在熱穩(wěn)定性方面，在最適pH下測(cè)定該酶在最適溫度下孵育一定時(shí)間后的殘余活力，孵育前的酶活力為100%.在金屬離子影響方面，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別添加終濃度均為1 mmol/L的金屬離子或金屬螯合劑EDTA，在酶的最適反應(yīng)條件下測(cè)定其酶活力，以不添加金屬離子時(shí)的酶活力為100%.在底物特異性方面，在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中分別添加終濃度均為10 mmol/L的不同的醛、酮化合物作為底物，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定其酶活力，以酮基泛解酸內(nèi)酯為底物時(shí)的酶活力為100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 SceAKR3C1的表達(dá)和純化

以S.cerevisiaeCCIC 1002基因組為DNA模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得目的基因，該基因序列與S.cerevisiaeS288c中D-阿拉伯糖1-脫氫酶基序列一致.成功構(gòu)建E.coliBL21 (DE3)/pEASY-Blunt E1-SceAKR3C1重組菌，并實(shí)現(xiàn)了重組菌中醛酮還原酶SceAKR3C1的過量表達(dá).粗酶液經(jīng)Ni-NTA親和層析進(jìn)行分離純化，目的蛋白用含40 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L，pH 8.0)洗脫，并通過超濾進(jìn)行脫鹽處理.重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)前后以及SceAKR3C1純酶經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，相比于誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后菌體在大小約為38 kDa處出現(xiàn)明顯的加粗條帶，并與純化的目的蛋白位置一致.通過標(biāo)準(zhǔn)酶活力檢測(cè)和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，該酶的比活力為20.53 U/mg.

M—蛋白Marker；1—誘導(dǎo)前粗酶液；2—誘導(dǎo)后粗酶液；3—純化后SceAKR3C1圖1 SceAKR3C1的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of SceAKR3C1

2.2 最適溫度和最適pH

不同pH和溫度對(duì)酶活的影響分別如圖2，3所示.醛酮還原酶SceAKR3C1在pH 5.0～7.0條件下，酶活力相對(duì)較高，在pH 6.0條件下達(dá)到最大，但隨著pH升高，酶活力迅速下降，在pH 8.5下幾乎沒有酶活.溫度為25～60 ℃時(shí)，醛酮還原酶SceAKR3C1酶活隨著溫度的上升而提高，當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高，但繼續(xù)增加溫度，酶活急劇下降.因此，醛酮還原酶的最適pH為6.0，最適溫度為60 ℃.

圖2 pH對(duì)醛酮還原酶SceAKR3C1活力的影響 Fig.2 Effect of pH on the activity of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

圖3 溫度對(duì)醛酮還原酶SceAKR3C1活力的影響 Fig.3 Effect of temperature on the activity of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

2.3 熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性

在pH分別為5.0，6.0，7.0的0.2 mol/L PBS緩沖液環(huán)境下考察醛酮還原酶SceAKR3C1的穩(wěn)定性(圖4).結(jié)果表明：偏酸性的條件對(duì)酶的穩(wěn)定性影響并不顯著，當(dāng)在pH 5.0條件下放置60 h后酶活力還能保持在初始活力的83.6%.此外，在最適溫度60 ℃下考察了酶的熱穩(wěn)定性.在60 ℃水浴中孵育10 h，酶活力基本不變，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力快速下降，約40 h后酶活力基本消失，相對(duì)于初始活力只剩下10.4%(圖5).

圖4 醛酮還原酶SceAKR3C1的pH穩(wěn)定性Fig.4 The pH stability of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

圖5 醛酮還原酶SceAKR3C1的熱穩(wěn)定性Fig.5 Thermostability of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

2.4 金屬離子的影響

終濃度為1 mmol/L的金屬離子可影響醛酮還原酶SceAKR3C1的活力(圖6).Co2+，Ni2+均可不同程度地提高SceAKR3C1的酶活力，在含有1 mmol/L Co2+和Ni2+體系中其相對(duì)活力分別達(dá)到了163%和149%.而Ba2+，Mn2+，K+，Mg2+，Na+或EDTA對(duì)酶活力沒有顯著影響，但Ca2+，Al3+或Zn2+則對(duì)該酶活力存在一定的抑制作用.低濃度的Co2+或Ni2+能有效地提高還原酶SceAKR3C1的酶活力，該特性可在后續(xù)催化工藝的構(gòu)建中予以考慮.

1—對(duì)照；2—Co2+；3—Ni2+；4—Ba2+；5—Mn2+；6—K+；7—Mg2+；8—Na+；9—EDTA；10—Ca2+；11—Al3+；12—Zn2+圖6 金屬離子對(duì)醛酮還原酶SceAKR3C1的影響 Fig.6 Effect of metal ions on the activity of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

2.5 酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶的底物特異性

以酮基泛解酸內(nèi)酯的比酶活力(20.53 U/mg)為對(duì)照，考察醛酮還原酶SceAKR3C1的底物特異性，結(jié)果如表1所示.SceAKR3C1對(duì)酮基泛解酸內(nèi)酯(Entry 1)具有高酶活力，但對(duì)其自發(fā)水解產(chǎn)物酮基泛解酸(Entry 6)、以及D-泛解酸內(nèi)酯、L-泛解酸內(nèi)酯(Entry 7，8)均無活力.同時(shí)SceAKR3C1以鄰位二酮(Entry 2)為底物時(shí)，相對(duì)活力達(dá)到78.70%，但對(duì)間位酮基底物活力則相對(duì)較低(Entry 3～5).

表1 醛酮還原酶Sce-AKR3C1的底物特異性

Table 1 Substrate specificity of the aldo-keto reductase SceAKR3C1

Entry底物相對(duì)活力/%11001)278．70340．90429．4858．336NA2)7NA2)8NA2)

注：1) 當(dāng)SceAKR3C1的相對(duì)活力為100%時(shí)，其比酶活力為20.53 U/mg；2) NA表示未檢測(cè)到活力.

3 結(jié) 論

以S.cerevisiaeCCIC 1002基因組為DNA模板，利用基因工程技術(shù)成功克隆表達(dá)并分離純化獲得了一種醛酮還原酶SceAKR3C1.該酶能利用輔酶NADPH催化不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯反應(yīng)，并且有較好的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性.低濃度的Co2+，Ni2+可有效地提高還原酶SceAKR3C1的酶活力.在底物特異性方面，該重組酶對(duì)鄰位二酮具有較高的酶活力，其中對(duì)酮基泛解酸內(nèi)酯活力最高.重組醛酮還原酶SceAKR3C1與當(dāng)前研究較多的酮基泛解酸內(nèi)酯還原酶CPR-C2 (19.30 U/mg)活力相近[12]，在酶法不對(duì)稱還原酮基泛解酸內(nèi)酯形成D-泛解酸內(nèi)酯中具有應(yīng)用潛力.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Cloning, over-expression and characterization of an aldo-keto reductase fromSaccharomycescerevisiaeCICC 1002

YING Xiangxian, GAO Liang, ZHANG Li, MAO Wangwei, ZHAO Man, WANG Zhao

(College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The gene encoding an aldo-keto reductase fromSaccharomycescerevisiaeCICC 1002 (SceAKR3C1) was cloned and over-expressed inEscherichiacoliBL21 (DE3). The recombinant aldo-keto reductase SceAKR3C1 was purified by Ni-NTA affinity chromatography and a single band corresponding to a molecular weight of 38 kDa was observed on the SDS-PAGE. The enzymatic properties were characterized. The optimum pH and temperature of SceAKR3C1 were 6.0 and 60 ℃, respectively, and the metal ions Co2+and Ni2+significantly increased the enzymatic activity. The substrate spectrum analysis indicated that the recombinant SceAKR3C1 had high activity on vicinal diketones, with a specific activity of 20.53 U/mg using ketopantolactone as substrate.

Saccharomycescerevisiae; aldo-keto reductase; cloning and expression; enzymatic properties; ketopantolactone

2017-03-29

浙江省新苗人才計(jì)劃項(xiàng)目(2016R403074)；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY17B020012)

應(yīng)向賢(1975—)，男，浙江永康人，副教授，博士，研究方向?yàn)樯锎呋?，E-mail：yingxx@zjut.edu.cn.

Q55

A

1674-2214(2017)03-0129-05